专利名称：一种以肝癌相关基因dlk1为靶点的核糖核酸及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和基因工程领域，具体地，本发明涉及肝癌相关基因DLK1、 以其mRNA序列为靶点的一组siRNA、及其在制备诊断肝癌试剂、制备基因治疗肝癌的药物 中的应用。
背景技术：
目前我国有慢性肝炎患者约1200万例，每年死于肝病约30万，其50%为原发性肝 癌，约占全世界肝癌死亡人数的45%左右。绝大多数与HBV、HCV感染有关。肝癌发病率在 我国居2-3位，主要在青壮年男性发病，在华东地区的发病率明显高于其他地区，近年来， 有持续上升趋势。在上海，肝癌的发病率居第三位，仅次于肺癌和胃癌。最新资料显示这个 比例还有继续上升的趋势。现在，肝癌，特别是肝炎病毒引起的肝癌已经严重危害了我国人 民生命安全。因此，非常有必要对肝癌发生的分子机制作深入的研究。随着人类基因组测序的完成，基因组学的研究重点已经转移到以解析基因功能为 主的功能基因组学研究。功能基因组学的重点是以疾病为中心，全力解决人类疾病相关基 因研究中的重大科学问题。肝癌在我国素有“国病”之称，经过半个世纪的探索，对于肝癌 的早期诊断和治疗虽然有了一定的认识，但肝癌预后仍然很差，特别是对其发病机制的了 解及治疗药物的新靶点方面，更是知之甚少。因此，寻找与肿瘤相关的基因，特别是寻找新 的抑癌基因是近年来肿瘤研究的热点。DLKl基因定位于染色体14q32上。DLKl是在胞外 区域包含6个EGF样重复序列的糖基化Delta样跨膜蛋白。DLKl首先是在脂肪前体细胞 中发发现，与脂肪细胞的分化紧密相关。DLKl基因具有抑制脂肪前体细胞向脂肪细胞分化 的功能。近年来，有研究发现DLKl在神经母细胞瘤细胞和小细胞肺癌细胞株等肿瘤细胞中 存在表达，表明DLKl基因可能与肿瘤发生相关；同时在老鼠的胎肝细胞和胆汁淤积引起的 肝纤维化细胞中均发现DLKl的表达。在我们的前期肝癌及癌旁表达谱分析的研究中，发现 DLKl基因在肝癌中的表达较癌旁组织中明显增加，提示DLKl基因可能对肝癌的发生相关。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种肝癌相关基因DLKl的mRNA序列，盖基因定 位在人染色体14q32上，可用于制备治疗原发性肝癌的RNA干扰药物。为解决上述技术问题，本发明提供肝癌相关基因DLKl的mRNA序列。本发明还提供一种表达载体，含有所述以DLKl上mRNA为靶点的siRNA序列。本发明还提供一种含有所述表达载体的宿主细胞。在本发明的再一方面，还提供了一种用于治疗肝癌的试剂盒，其含有所述的以 DLKl上mRNA为靶点的siRNA。
在本发明的又一方面，还提供了一种用于治疗肝癌的生物芯片，其含有以DLKl上 mRNA为靶点的siRNA。在本发明的又一方面，还提供了肝癌相关基因DLKl在制备诊断肝癌及肿瘤的试 齐U，和制备基因治疗肝癌及肿瘤的药物中的应用。本发明由于对DLKl基因进行了体外动物细胞试验，证实DLKl缺失能够导致肝肿 瘤细胞显著缩小，认为DLKl基因在进行制备治疗肝癌的基因药物中有巨大作用，可以成为 基因治疗的靶点。
图1是实施例1中pSUPER DLK874和pSUPER DLKlOl 1的RNA干扰效率示意图，其 中，pSUPER为空载对照，pSUPER Luc+为阴性对照；图2是实施例2中三次克隆实验中的一次的实验照片；图3是实施例2中从上到下为H印3B、!fepG2和Huh_7细胞在三次独立实验中的克 隆数目统计图，其中，*表示与对照组比较时ρ值< 0. 05 ；图4是实施例3中DLKl表达稳定下调的Huh_7细胞株的鉴定示意图，其中， β -actin作为各样品蛋白上样量对照；图5是实施例3中DLKl表达稳定下调Huh_7细胞株的生长曲线比较示意图，其中， 细胞活力在450nm波长处测量，每点上下所标的黑色刻度线标志为其标准差；图6是实施例4中DLKl表达下调的Huh_7细胞在裸鼠体内的成瘤性降低示意图； 上图为4周后携带肿瘤的裸鼠照片，皮下的肿瘤呈圆块状；下图为4周后取下的皮下肿瘤照 片，其中Huh-7 plOll A4细胞在六周后仍无肿瘤形成；图7是实施例5中SMMC-7721瞬间转染pcDNA3. 0和pcDNA3. O-DLKl后的生长曲 线示意图；图 8 是实施例 5 中 SMMC-7721 瞬间转染 pcDNA3. 0 和 pcDNA3. O-DLKl 后的 Western Blotting分析鉴定图，其中DLKl为转染pcDNA3. O-DLKl质粒，3. 0为转染pcDNA3. 0质粒， blank为没有转染的SMMC-7721细胞，β -actin作为各样品蛋白上样量对照。
具体实施例方式
下面结合附图对本发明作进一步详细的说明。本发明的实施例如下所示实施例1构建并鉴定DLKl的RNAi质粒在本实施例中，引入pSUPER质粒，以构建能够对细胞进行比较稳定转染的RNAi 的质粒。该质粒含有Hl-RNA多聚酶III基因启动子，将能转录出含有短链发夹结构 RNA (shRNA)的cDNA序列寡核苷酸插入pSUPER质粒的该启动子之后，使此载体在转染入细 胞后能在细胞内稳定合成发卡样结构的shRNA，即达到比较稳定的沉默目的基因的作用。在本实施例中所用的寡核苷酸序列如下1、pSUPER Luc+正 向 引 物:gatccccctt acgctgagta cttcgattca agagatcgaagtactcagcg taagtttttg gaaa
反 向 引 物agcttttcca aaaacttacg ctgagtactt cgatctcttgaatcgaagta ctcagcgtaa gggg2、pSUPER DLK874 正 向 引 物:gatccccggt ctcacctgtg tcaagattca agagatcttgacacaggtga gacctttttg gaaa反 向 引 物agcttttcca aaaaggtctc acctgtgtca agatctcttgaatcttgaca caggtgagac cggg3、pSUPER DLK1011 正 向 引 物:gatccccggt gtccatgaaa gagctcttca agagagagctctttcatagg cacctttttg gaaa反 向 引 物agcttttcca aaaaggtgtc catgaaagag ctctctcttgaagagctctt tcataggcac cggg其中pSUPER Luc+质粒，其RNAi所针对的片段为改良过的北美萤火虫 (Photinuspyralis)萤光素酶基因的19个碱基片段。该基因Luc+是具有种属特异性的报 告基因，在哺乳动物细胞中不存在该基因也不表达。因此，本实施例中pSUPER Luc+质粒为 RNAi干扰体系的参照，以排除pSUPER Luc+质粒在RNAi过程中可能出现的非特异的实验 结果。而pSUPERDLK874和pSUPER DLK1011质粒干扰的靶序列分别针对DLKl基因序列第 874和第1011个碱基开始的连续19个碱基片段。将靶序列对应的cDNA序列分别插入到正向引物(Forward primer)和反向引物 (Reverse primer)的前段空缺内，同时将该cDNA的互补cDNA序列插入后段空缺，形成完整 的正向引物，共64个碱基。在得到人工合成DNA序列后，对正向引物和反向引物进行退火 和磷酸化，随后连接入pSUPER载体，再经过转化进行阳性克隆的筛选。利用pSUPER质粒内部固定的限制性内切酶位点Ecor I和Hind III JipSUPER Luc+质粒进行酶切鉴定。阳性克隆酶切后的条带大小约为360bp，而阴性克隆酶切后为300bp。所挑选的8 个pSUPER Luc+克隆中左起第2和3号克隆酶切后的条带略高于其它条带，大小符合阳性 克隆的特征。选择该两个克隆经测序鉴定发现3号克隆的序列完全符合目的序列片段。而 4个pSUPER DLK1011克隆中，左起1、3、4号均为阳性，测序鉴定发现1号克隆的序列完全 符合目的序列片段。另外，pSUPER DLK874质粒的鉴定筛选过程同上。最终得到该三个以 pSUPER为载体的RNAi质粒。将构建好的pSUPER DLK874和pSUPER DLK1011瞬间转染入内源性表达DLKl的HCC 细胞Huh-7、H印3B 和!fepG2 中，并以 pSUPER Luc+为对照质粒，用 Real-time Quantitative PCR鉴定其沉默DLKl基因表达的效果(见图1)。图1中的数据是以各样品的管家基因β肌动蛋白(β -actin)表达量为参考经标 准化后的相对平均值。本实施例中，DLKl的Real-timeQuantitative PCR引物如下正向引物5，-gtactcggga aaggactgcc-3，反向引物5，-ctcgcagaaa ttgcctgaga-3，所以探针为5' -FAM-aggcacccgt ggatgatgag-TAMRA-3'以上Real-time Quantitative PCR的实验每个都至少重复进行3次。由图1可见，由pSUPER载体介导的RNA干扰能使目的基因DLKl的表达在上述三种细胞内下调50-60%。实施例2瞬间克隆形成试验(证明HCC细胞的DLKl表达抑制后其克隆形成能力降低)在鉴定pSUPER载体介导的RNAi有效的基础上，对实施例1中的三种内源性表达 DLKl的细胞进行瞬间克隆形成试验(见图2、图3)，并以无内源性DLKl表达的HCC细胞株 Bel-7402细胞作为对照细胞。将pSUPER 空载质粒和 pSUPER DLK874、pSUPER DLKlOl 1 质粒与 pcDNA3. 0 质粒以 10比1的比例分别共转染入H印3B、H印G2、Huh-7和Bel-7402细胞，此处pcDNA3. 0质粒为 转染后的细胞提供G418抗性。在转染后，各对照组的分别取等量细胞分入IOOmm细胞培养 皿中培养，并用含适当浓度的G418的MEM或者DMEM完全培养液进行筛选并等待耐药克隆 的形成。其中tfepG2和G418筛选浓度为1000g/ml，H印3B、Huh-7和Bel-7402均为600g/ ml。待3-4周，克隆形成较为完全后染色并拍照保存。可以看到，在内源性DLKl被下调后，H印3B、HepG2和Huh_7细胞形克隆形成的数 目都有明显下降，即其克隆形成能力被显著削弱。而没有内源性表达的Bel-7402细胞在同 样的实验中其形克隆形成的数目却没有明显改变。实施例3Western Blotting分析(证明Huh_7细胞的DLKl表达被抑制后其生长 增殖能力降低)以 Huh-7 细胞为对象，将 pSUPER 空载质粒和 pSUPER DLK874、pSUPERDLK1011 质粒 与pcDNA3. 0质粒以10比1的比例分别共转染入Huh_7细胞，构建DLKl表达抑制的Huh_7 稳定细胞株，并用Western BlottingAnalysis对于其中的4株稳定细胞株在蛋白水平上对 DLKl的表达进行鉴定(见图4)。图4中，pSUPER C5为pSUPER空载质粒稳定细胞株；ρ 1011 Β3和ρ1011Α4为稳定 转染pSUPER DLK1011后形成的亚克隆；p874 C2为稳定转染pSUPER DLK874后形成的亚克 隆。得到两株DLKl稳定下调的细胞株Huh-7p874 C2和Huh_7 plOll A4，而稳定株Huh_7 PlOll B3中DLKl的表达并没有下调。在建立了 DLKl稳定下调细胞株的基础上，研究了这两株稳定株的生长属性是否 受DLKl下调的影响而改变，为此，比较这些细胞及对照的生长曲线。如图5所示，当DLKl 的表达被下调后，其稳定株的生长增殖能力明显减弱。与之比较的空载稳定细胞株PSUPER C5和内源性DLKl表达没有被下调的对照稳定细胞株plOll B3，它们两者的生长状态良好。 虽然它们之间也略有差异，即pSUPER C5要比plOll B3生长增殖能力稍微更强一些，但是 这两者总的要比P874 C2和plOll A4的生长增殖能力都要显著得多。该实验经重复三次 后，得到相似的结果。实施例4无胸腺的BLAB/cA裸鼠体内实验(证明Huh_7细胞的DLKl表达被抑制 后其在动物体内成瘤能力降低)本实施例共取32只裸鼠，分成四组，每组八只，分别于皮下注射相同量(2X106) 的Huh-7 pSUPER C5、pl011 B3、p874 C2和plOll A4细胞。注射后四周观察裸鼠的生存状 态及所成肿瘤的形态指标(见图6)。经观察发现，DLKl被稳定下调的Huh-7 p874 C2细胞在裸鼠皮下所成的肿瘤要比 对照组Huh-7 pSUPER C5和plOll B3细胞在裸鼠下所成的肿瘤在体积上显著减小，而且Huh-7 plOll A4在观察注射肿瘤细胞后六周仍然未见肉眼可见肿瘤形成，解剖证实该注射 Huh-7 plOll A4细胞的8只裸鼠确实没有肿瘤形成。注射Huh_7 pSUPER C5、plOll B3、 p874 C2细胞后的所有裸鼠在四周后都形成了肿瘤，而且注射了 Huh-7pSUPER C5和plOll B3细胞所形成的肿瘤经解剖分离后显示其所成肿瘤实体的体积比Huh-7 p874 C2的更大 (见图6)，并且该两组肿瘤实体本身没有显著性差异。但注射了 Huh-7 pSUPER C5和ρ 1011 Β3细胞的裸鼠与注射了 Huh-7p874 C2和plOll A4细胞的裸数的体重净重、进食能力和精 神状态在4周后没有显著差异，所有裸鼠在实验中止即解剖前全部存活。本实施例结果显示对于内源性表达DLKl的肝癌细胞株在模型动物皮下进行的成 瘤实验中，DLKl对于肿瘤细胞的成瘤能力起了重要的增强作用。由于DLKl被稳定下调的 细胞成瘤作用大幅度降低，甚至其中一例了 Huh-7 plOll A4细胞的8只裸鼠都没有长出肉 眼可见的肿瘤，因此本实施例证明了 Huh-7细胞的DLKl表达被抑制后其在动物体内成瘤能 力降低。实施例5DLK1促进SMMC-7721细胞的生长
以上实施例均采用了 RNAi的手段使DLKl的表达受到抑制，观察到DLKl的表达抑 制后，肝癌细胞生长增殖能力、克隆形成和成瘤能力都有显著的降低，这提示DLKl对于肝 癌细胞的生长增殖及成瘤性起着某种维持或限制的作用。本实施例用以验证DLKl是否可 以直接起到癌基因的作用来促进肿瘤细胞的增殖。在无内源性DLKl表达的SMMC-7721细胞中，瞬间转入之前所构建的过表达DLKl 全长蛋白的pcDNA3. 0-DLK1质粒，并以pcDNA3. 0空载质粒为对照，观察细胞的生长增殖 曲线(见图7)。Western Blotting Analysis中的样品为生长曲线所用同一批转染了 pcDNA3. 0和pcDNA3. 0-DLK1质粒的SMMC-7721细胞，各样品上样量均为20 μ g，以鉴定转染 质粒后DLKl在SMMC-7721细胞中表达的效率(见图8)。在本实施例中，在SMMC-7721细胞中进行了该两个质粒的瞬间转染，转染试剂为 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)，在转染4-5小时后将含有转染试剂的培养液撤去，更 换成新鲜的DMEM完全培养液，以尽量减少转染试剂的毒性对于细胞的损伤。继续培养至次 日，计数后分入96孔板内生长，每孔均勻分入1000个细胞。经过8天的观察，发现转染了 DLKl的SMMC-7721细胞比转染了空载质粒的细胞生长显著增快。本实施例结果表明DLKl能显著增强无内源性DLKl表达的HCC细胞株SMMC-7721 的生长增殖能力。
权利要求
一种以肝癌相关基因DLK1为靶点的核糖核酸，其特征在于它的寡核苷酸序列如下siRNASCAGGUCUCACCUGUGUCAAGAAGdTdT(SEQ ID NO12)；ASCUUCUUGACACAGGUGAGACCUGdTdT(SEQ ID NO13)。
2.一种如权利要求1所述的以肝癌相关基因DLKl为靶点的核糖核酸在制备治疗原发 性肝癌的RNA干扰药物中的用途。
全文摘要
本发明公开了一种以肝癌相关基因DLK1为靶点的核糖核酸，它的寡核苷酸序列如下siRNASCAGGUCUCACCUGUGUCAAGAAGdTdT(SEQ IDNO12)；ASCUUCUUGACACAGGUGAGACCUGdTdT(SEQ ID NO13)。此外，本发明还公开了上述以肝癌相关基因DLK1为靶点的核糖核酸在制备治疗原发性肝癌的RNA干扰药物中的用途。
文档编号C12N15/113GK101805737SQ201010169328
公开日2010年8月18日 申请日期2006年12月11日 优先权日2006年12月11日
发明者韩泽广, 黄健 申请人:上海人类基因组研究中心