专利名称：一种提高产1，3-丙二醇融合菌筛选效率的方法
技术领域：
本发明涉及一种应用基因组重排技术制备产1，3-丙二醇基因工程融合菌的筛选方法，特别是提高筛选效率的方法，属于工业生物技术领域。
背景技术：
1，3_丙二醇(PDO)是一种重要的化工和医药中间体原料，可作为有机溶剂应用于油墨、印染、乳化剂、抗冻剂等。PDO最主要的用途，是合成新型聚酯高分子材料聚对苯二甲酸丙二酯(PTT)的单体。PTT是目前国际上公认的六大石化新产品之一。与聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚对苯二甲酸丁二酯(PBT)和尼龙等比较，PTT具有良好的印染特性、富有弹性、抗紫外线、静电性能好、可生物降解并再生利用等多种优良特性，因此PTT在纺织服装业、地毯装饰业、工程塑料等众多领域有着十分广阔的应用前景。据估计，目前仅我国每年就需求PDO上百万吨，而且在未来十年我国对PDO的需求量还将继续增大。PTT生产的关键在于单体原料PDO的来源，其生产成本直接影响着PTT的工业化生产和应用规模。1，3_丙二醇的生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法。化学合成法目前仅有国外DuPont和Siell公司以及国内的少数几家单位在进行小规模工业化生产。技术路线分别是德国Degussa公司的丙烯醛合成法专利技术和Siell公司开发的环氧乙烷合成法， 并用于聚合生产PTT。为了垄断市场，这两家跨国公司不对外销售用于PTT生产的PD0，而只向客户销售PTT切片及其下游产品。同时，化学合成法存在设备投资大、工艺要求严格、 操作条件苛刻、有毒副产物多、产品提取难度大、三废处理成本高以及生产原料依赖于不可再生的石油资源等问题，导致PTT材料及其原料产品PDO的价格一直居高不下，制约其进一步的发展。而微生物发酵法生产PD0，以可再生资源——碳水化合物为原料，具有操作简便、反应条件相对温和、副产物少、污染少且容易处理以及成本低廉等优点，引起了国内外相关企业和研究单位的高度重视，将具有广泛的应用前景和开发潜力。微生物发酵法的生产方法包括一是利用从自然界获得的菌株以甘油为底物直接发酵生产1，3_丙二醇；二是构建基因工程菌以葡萄糖或甘油为底物发酵生产1，3_丙二醇； 基因工程菌构建策略主要有5种(1)强化原始菌株中还原途径限速酶的表达及阻止副产物的代谢途径；(2)将1，3-丙二醇生产菌的关键酶基因dhaB、dhaT基因克隆到甘油生产菌中，以希望能获得将葡萄糖转化为1，3_丙二醇的基因工程菌；(3)将甘油生产菌的DAR1、GPP2基因克隆到1，3_丙二醇生产菌中，以希望能获得将葡萄糖转化为1，3-丙二醇的基因工程菌；(4)将产1，3_丙二醇的dha调控子基因克隆到大肠杆菌中，获得能转化甘油为1， 3-丙二醇的基因工程菌；(5)将1，3_丙二醇生产菌的关键酶基因dhaB、dhaT基因和甘油生产菌的DARl、 GPP2基因克隆到大肠杆菌中，从而获得能将葡萄糖转化为1，3_丙二醇的基因工程菌。目前，国外DuPont公司已经在大肠杆菌中成功构建了以葡萄糖为底物发酵1. 3-丙二醇的途径，产量高达135g/L。国内众多研究机构也纷纷针对产1，3-丙二醇途径中的关键酶进行了深入的研究，在模式大肠杆菌成功表达关键酶基因，但产量水平较低，而针对原始生产菌株肺炎克雷伯氏菌的基因工程手段改造鲜见报道，随着国际范围内生物柴油工业的广泛兴起，将产生大量的剩余副产品甘油，为利用发酵法制备1，3_丙二醇提供了丰富的原料。基因组重排技术作为新型的育种技术，基于原生质体融合技术之上，使不同基因组发生重排的过程。其主要机制在于利用原生质体融合达到全基因组片段交换、重组，经过多轮递归融合后促使正向突变表型聚集，相较诱变育种、原生质体融合人技术等，基因组重排技术具有更高的效率。基因组重排技术基于多亲本之间的递归融合，具有更大基因突变来源；递归融合还能使正向突变的表型聚集，多轮融合极大的提高了基因交换的概率。其次，基因组重排技术可以无需了解相关微生物的代谢途径、关键酶的表达基因、转录调控等知识背景，尤其适合微生物代谢途径的遗传改造。此外，基因组重排技术操作简单，容易推广，不需要昂贵的实验仪器，而且见效快。因此，基因组重排育种很适合工业菌株的改造工程，不仅体现成本经济效应，还具备高效性。基因组重排技术充分结合了细胞工程和代谢工程的优势，不仅可以进行菌种表型快速高效优化，还可为不同种类的微生物复杂的代谢和调控网络提供了信息来源。目前，基因组重排技术主要应用于提高微生物代谢产物产率，增强菌株对环境的耐受性以及底物的利用率。在 2009 年，Jin 等(Jin ZH, Xu B, Lin SZ, Jin Q, Cen P. Enhanced production of spinosad in Saccharopolyspora spinosa by genome shuffling. Appl BiochemBiotechnol 2009. doi :10. 1007/sl2010-008-8500_0)研究了 Saccharopolyspora spinosa的基因组重排育种工作，经过四轮重排后，筛选到了两株高产多杀菌素的融合菌，生产能力比原始出发菌株提高了 201%和436%。Burkhard Otte等(APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Dec.2009， p.7610-7616Vol.75, No.240099-2240/09/ doi :10. 1128/AEM. 01774-09)首次结合传统诱变育种和基因组重排技术，以Clostridium diolis为亲本菌株，筛选到了高耐甘油和1，3-丙二醇的工程菌，其中一株融合菌的1，3-丙二醇浓度达到了 85g/L。采用基因组重排过程获得优良目的菌株的工作量较大，主要过程包括原生质体的获取、原生质体的灭活诱变、原生质体的融合、融合子的筛选等步骤。基因组重排一般需要多轮操作，每步骤的条件稍有变化对最终结果都可能产生明显的影响，基因组重排过程需要大量人力、物力和时间。科学高效的融合子筛选方法是基因组重排育种技术过程成功的关键，而目前一般的筛选方法普遍采用提高单因子通量来筛选。该方法有一定理论基础和实践基础，但是对于微生物整个发酵体系而言，缺乏科学性。微生物发酵体系对微生物后期有害胁迫和毒害作用是多因子作用的结果，并不是单一因子作用的结果。本发明利用初始菌株补料发酵终点的发酵液并经过滤除菌后作为选择培养基，包含了各种对菌体不利因素，而且模拟了实际发酵体系，筛选到的菌株理论上具备更强的生产强度。本发明为工业菌株改良筛选提供了新的思路。
发明内容
本发明提供提高产1，3_丙二醇融合菌筛选效率的方法，本发明方法可以提高目标菌株的使用性能，同时提高目标菌株的筛选效率。本发明提高产1，3_丙二醇融合菌筛选效率的方法包括如下过程(1)选择亲本菌株，或菌种经适宜培养得到亲本菌株；(2)亲本菌株进行酶解脱壁得到原生质体；(3)原生质体进行灭活处理得到灭活原生质体；(4)灭活的原生质体进行原生质体融合；(5)用含有目的发酵产物的培养基筛选融合子，选择性能优良的目的融合菌；(6)步骤(5)获得的优良融合菌株作为亲本进入下一轮基因组重排过程，至获得综合性能优良的菌株。其中步骤(5)中每轮获得目的融合菌补料发酵终点的发酵液经过滤除菌后作为选择培养基，用于筛选下一轮目的融合菌。本发明方法中，亲本菌株一般为两株，可以是肺炎克雷伯氏杆菌同种之间融合，或者是肺炎克雷伯氏杆菌与产酸克雷伯氏杆菌间跨属融合，或者是肺炎克雷伯氏杆菌与大肠杆菌之间跨属融合等具体方式。亲本菌株可以源来市售商品，也可以是实验室保藏菌种经培养获得，菌种培养的方法可以采用本领域常规方法。本发明方法中，亲本菌株酶解脱壁可以采用Tris-Cl (Tris盐酸缓冲液)溶解的溶菌酶溶液进行酶解脱壁处理。亲本菌株在酶解脱壁处理之前可以进行适宜的预处理过程，预处理如紫外诱变、NTG (亚硝基胍)诱变、DES (硫酸二乙酯)诱变、Tris-Cl缓冲液预处理等一种或几种。本发明方法中，原生质体进行灭活处理可以采用常规的方法，如紫外灭活、热灭活等方法，不同的亲本原生质体可以采用不同的灭活方法处理，具体灭活方法是本领域技术人员熟知的内容。本发明方法中，采用菌株同种之间融合时，不同亲本菌株的酶解脱壁和原生质体灭活等步骤优选分别进行；采用不同菌株跨属融合时，不同亲本菌株的酶解脱壁和原生质体灭活等步骤可以分别进行，也可以在同一体系中同时进行。本发明方法中，酶解脱壁得到原生质体或灭活原生质体可以进行膜过滤处理，膜过滤处理优选采用0. 22 0. 85 μ m滤膜过滤除去对原生质体融合有影响的菌体，优选对酶解脱壁得到原生质体进行膜过滤处理。本发明方法中，灭活原生质体进行原生质体融合的操作可以采用本领域常规方法，如灭活原生质与聚乙二醇溶液(如聚乙二醇6000溶液)混合，在适宜温度(如30 400C )下进行融合一定时间(如3 30分钟)。本发明方法中，融合子的筛选过程与常规基因组重组方法相同，如采用补料发酵方式在培养基中和适宜的条件下对融合子进行筛选，主要特点在于以每轮筛选的补料发酵终点时的发酵液经过滤除菌后作为下一轮融合子筛的培养基。培养基中跟据需要添加适宜的营养物质。本发明方法中，各步骤的其它条件和操作方式可以采用本领域常规的方法。本发明方法中，在融合子筛选过程中，通过采用适宜的培养基，用于筛选目的融合菌，即利用初始菌株补料发酵终点时的发酵液，经过滤除菌后直接用于筛选目的融合菌，获得的融合菌具备对发酵体系更高的耐受性。实验证明，使用本发明中补料发酵终点时的发酵液并经过滤除菌，明显提高了融合菌的生产强度，提高了产物的最终浓度及转化率，提高经济经济效益。同时由于补料发酵终点时发酵液的对融合子的有效筛选作用，可以进一步提高获得使用性能目标菌株的筛选效率，实验表明，采用该方法进行菌株筛选比采用普通培养基筛选时可以提高效率20 %以上。本发明方法中，原生质体在融合前进行膜过滤操作，可以选择适宜的原生质体进行融合筛选，有效去除对融合操作有影响的菌体，减少筛选过程中的干扰，显著提高了目的融合菌的筛选效率，实验表明，采用这种方法可以提高筛选效率20%以上。
具体实施例方式下面通过实施例进一步说明本发明的方案和效果。实施例1基因组重排育种，以肺炎克雷伯氏杆菌为初始亲本菌株菌种肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)由抚顺石油化工研究院筛选，保藏于中国微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，编号为0798。再生培养基(固体):A、蔗糖171.5g/L，胰蛋白胨10g/L，葡萄糖10g/L，酵母膏 5g/L，MgCl24. 273g/L，NaC15g/L，琼脂 15g/L。LB培养基(固体)胰蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaC15g/L，琼脂15g/L。溶菌酶用10mM/L的Tris-Cl (pH8. 0)溶解溶菌酶，配置成20mg/mL的贮存液，分
装使用。SMM 缓冲液0. 5mol/L 蔗糖，0. 02mol/L MgCl, 0. 02mol/L 顺丁烯二酸。Tris-Cl 缓冲液还含有 0. 01mol/L 的 EDTA，0. 5mol/L 蔗糖。补料发酵培养基酵母膏5g/l，K2HPO4 · 3H20 10g/l，KH2P042g/l，NH4ClO. 8-lg/l， NaCl 0. 5g/l，MgSO4 · 7H20 0. lg/1，FeCl3 · 6H20 30mg/l，CoCl2 · 6H205mg/l，VitaminB125mg/ 1，甘油30g/l ；实料发酵过程甘油控制在15 20g/L。补料发酵培养条件37°C，300rpm,空气 0. 25 0. 5vvm。基因组重排过程(1)菌体预处理从_80°C甘油管保藏下的双亲本菌株在固体培养板上活化4代，液体LB活化 14h。预先紫外诱变三轮，接种到LB固体斜面。转到LB液体培养基活化10h，按2%接种量接种到含甘氨酸浓度为0.8%的25mL LB培养基的摇幷S培养，培养条件为37°C，130rpm， 4h。用Tris-Cl缓冲液预处理。在恒温震荡仪37°C下，IOOrpm,时间为30min。用SMM缓冲液洗涤一次离心去上清，离心条件为4000g，4°C，IOmin0(2)酶解脱壁用SMM配制的溶菌酶母液(pH8. 0，溶菌酶浓度为20mg/mL)加入离心洗涤后的菌体，使最终浓度为0. 5mg ang，充分混勻，置恒温振荡仪中37°C，lOOrpm，Ih后离心去上清， 离心条件为3000g，4°C，lOmin。用SMM缓冲液洗涤两次，离心条件同上。(3)原生质体灭活用紫外和热分别灭活两份酶解脱壁的原生质体，紫外灭活条件距离紫外灯20cm， 照射时间为30min，热灭活条件为60°C，时间池，然后收集菌液。(4)原生质体融合
由上步收集到的菌液按等体积混勻离心，加入浓度为40%的PEG6000 (SMM配制)， 37°C温箱中40rpm，融合时间为6_8min。(5)融合子筛选融合后的原生质体在再生培养基上进行培养生长，以克雷伯氏杆菌补料发酵终点时的发酵液并经过滤除菌后作为选择培养基，将再生培养基上长出的融合菌株接种到摇弁瓦中，初步筛选耐受发酵体系优良的融合子。HPLC(高效液相色谱)测定摇瓶发酵液1， 3_丙二醇的产物浓度并进一步通过发酵罐培养确定。每轮获得的优良菌株作为亲本进入下轮融合。而每轮获得目的融合菌补料发酵终点的发酵液并经过滤除菌后作为选择培养基， 筛选下轮目的融合菌。经过3 6轮的基因组重排筛选，可以获得性能优良的菌株。实施例2以肺炎克雷伯氏杆菌和大肠杆菌作为亲本菌株，基因组重排技术育种选择肺炎克雷伯氏杆菌和大肠杆菌为亲本菌株，预先用LB液体培养基活化14h， 对双亲菌株(肺炎克雷伯氏杆菌和大肠杆菌)分别进行紫外诱变和NTG诱变。其余步骤方法同例1，经过3 6轮的基因组重排筛选，可以获得性能优良的菌株。实施例3以肺炎克雷伯氏杆菌和产酸克雷伯氏杆菌作为亲本菌株，基因组重排技术育种选择肺炎克雷伯氏杆菌和产酸克雷伯氏杆菌为亲本菌株，预先用LB液体培养基活化14h，对双亲菌株(肺炎克雷伯氏杆菌和产酸克雷伯氏杆菌)分别进行紫外诱变和NTG 诱变。其余步骤方法同例1，经过3 6轮的基因组重排筛选，可以获得性能优良的菌株。实施例4与比较例实施例4采用初始菌株补料发酵终点时的发酵液并经过滤除菌后，作为选择培养基，比较例采用前述补料发酵培养基(补料发酵培养基组成为酵母膏5g/l，K2HPO4 · 3H20 10g/l，KH2P042g/l，NH4Cl 0. 8-lg/l，NaCl 0. 5g/l，MgSO4 · 7H20 0. lg/1，FeCl3 · 6H20 30mg/ 1，CoCl2 ·6Η20 5mg/l，VitaminB125mg/l，甘油 30g/l)，培养条件37°C，300rpm，空气 0. 25 0.5vvm。当发酵液中1，3-丙二醇浓度不再提高，甘油停止消耗时视为发酵终点。表1实施例4实验结果
权利要求
1.一种提高产1，3-丙二醇融合菌筛选效率的方法，包括如下过程(1)选择亲本菌株，或菌种经适宜培养得到亲本菌株；(2)亲本菌株进行酶解脱壁得到原生质体；(3)原生质体进行灭活处理得到灭活原生质体；(4)灭活的原生质体进行原生质体融合；(5)用含有目的发酵产物的培养基筛选融合子，选择性能优良的目的融合菌；(6)步骤( 获得的优良融合菌株作为亲本进入下一轮基因组重排过程，至获得综合性能优良的菌株；其特征在于步骤(5)中每轮获得目的融合菌补料发酵终点的发酵液进行过滤除菌后作为选择培养基，用于筛选下一轮目的融合菌。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于亲本菌株为两株，为肺炎克雷伯氏杆菌同种之间融合，或者是肺炎克雷伯氏杆菌与产酸克雷伯氏杆菌间跨属融合，或者是肺炎克雷伯氏杆菌与大肠杆菌之间跨属融合。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于亲本菌株酶解脱壁采用Tris-Cl(Tris盐酸缓冲液)溶解的溶菌酶溶液进行酶解脱壁处理。
4.按照权利要求1或3所述的方法，其特征在于亲本菌株在酶解脱壁处理之前进行预处理过程，预处理过程包括紫外诱变、亚硝基胍诱变、硫酸二乙酯诱变、Tris-Cl缓冲液预处理中的一种或几种。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于原生质体进行灭活处理采用紫外灭活或热灭活方法。
6.按照权利要求5所述的方法，其特征在于采用菌株同种之间融合时，不同亲本菌株的酶解脱壁和原生质体灭活步骤分别进行；采用不同菌株跨属融合时，不同亲本菌株的酶解脱壁和原生质体灭活步骤分别进行，或者在同一体系中同时进行。
7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于酶解脱壁得到原生质体或灭活原生质体进行膜过滤处理。
8.按照权利要求7所述的方法，其特征在于膜过滤处理采用0.22 0. 85 μ m滤膜过滤除去对原生质体融合有影响的菌体。
9.按照权利要求1所述的方法，其特征在于灭活原生质体在聚乙二醇溶液中进行融合O
10.按照权利要求1所述的方法，其特征在于融合子的筛选过程采用补料发酵方式在培养基中对融合子进行筛选，以每轮筛选的补料发酵终点时的发酵液经过滤除菌后作为下一轮融合子筛的培养基。
全文摘要
本发明公开了一种提高产1，3-丙二醇融合菌筛选效率的方法，主要过程包括选择亲本菌株；亲本菌株进行酶解脱壁得到原生质体；原生质体进行灭活处理；灭活的原生质体进行原生质体融合；筛选融合子，选择性能优良的目的融合菌；优良融合菌株作为亲本进入下一轮基因组重排过程，至获得综合性能优良的菌株；其中每轮获得目的融合菌补料发酵终点的发酵液进行过滤除菌后作为选择培养基，用于筛选下一轮目的融合菌。与现有基因工程融合菌筛选方法相比，本发明方法具有操作方便，不需昂贵的实验仪器，筛选效率高，适合于工业菌株育种等优点。
文档编号C12N15/03GK102311946SQ201010220778
公开日2012年1月11日 申请日期2010年7月7日 优先权日2010年7月7日
发明者师文静, 李晓姝, 王崇辉, 王领民, 金平 申请人:中国石油化工股份有限公司, 中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院