专利名称：一种从猪血中提取超氧化物歧化酶sod的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种从猪血中提取超氧化物歧化酶SOD 的方法。
背景技术：
超氧化物歧化酶(SOD)是一种能催化超氧阴离子自由基歧化反应的金属酶，其主要作用是能专一地清除生物氧化过程中产生的超氧阴离子自由基，是生物体防御活性氧毒害的关键性防线，能预防或治疗由超氧阴离子自由基引起的多种疾病，是一种很有用途的药用酶，对人体血栓症、动脉硬化、高血糖有一定的预防和辅助治疗作用，还具有抗衰老、抗辐射和防止细胞突变等作用具有能够清除体内过多氧自由基的特性，从而在医学、食品、化妆品等领域得到广泛的应用。自1969年首次从牛红细胞中分离出SOD以来，人们相继从牛、猪、羊、马等动物红细胞、肌肉、肝脏组织以及植物中分离和纯化出SOD。现在我国大部分都是采用生化方法提取S0D，如基因合成、微生物发酵以及化学提取，同时在SOD纯化中大多使用琼脂糖凝胶法和阴阳离子树脂交换法等方法，这些方法普遍存在生产工艺复杂、成本高、周期长等缺点。我国作为猪肉产业大国，拥有丰富的猪血资源，但大部分猪血除了进行简单加工做饲料用外，则被直接抛弃，不仅极大地浪费了猪血资源，还严重污染了环境。猪血中的的营养成分丰富，除含有丰富的蛋白外，还含用超氧化物歧化酶(SOD)等活性物质，对猪血进行SOO的有效提取将极大提高猪血的附加值，产生良好的经济效益。
发明内容
本发明的目的就在于克服上述常规方法中存在的不足，而提供一种从猪血中提取超氧化物歧化酶SOD的方法，该方法工艺简单、生产周期短、适合工业化生产。如上构思，本发明的技术方案是一种从猪血中提取超氧化物歧化酶SOD的方法， 其特征在于依照如下步骤进行(1)向猪血中加入抗凝剂，离心3000rpm离心10 30min去血浆，收集红细胞；然后加入红细胞体积3 5倍的0. 9% NaCl溶液进行清洗，离心4000rpm离心10 30min， 弃去上清液后，收集红细胞并加入红细胞体积1 3倍体积的去离子水，0 4°C水浴下静置10-1 后得到溶血液；(2)向溶血液中缓慢加入4°C以下冷预过的95%乙醇后，再缓慢加入预冷过的的氯仿，然后搅拌、静置、离心后收集上清液获得粗酶液；(3)向粗酶液中加入丙酮，然后搅拌、离心，取沉淀物；(4)将沉淀物用加入1-3倍体积的去离子水进行溶解，并进行热处理后，迅速冰浴至4°C以下，然后，加入K2HPO4缓冲液，搅拌、离心后获得上清液；(5)采用螺旋梯度洗脱技术对上清液进行纯化处理，获得纯化酶液；(6)将纯化酶液通过透析工艺除去盐离子，并最终将精致酶液进行冷冻干燥，可以获得最终的猪血SOD成品。上述抗凝剂采用草酸钾溶液，其浓度为2 5%，其体积是猪血体积的10%。上述去离子水的pH = 9。上述步骤O)中95%乙醇的加入量是溶血液体积的0. 2 0. 5倍，氯仿的加入量是溶血液体积的0. 1 0. 5倍，溶血液加入95%乙醇和氯仿后搅拌10-20min、静置0. 5_lh、 4000rmp离心10 30min，收集上清液获得粗酶液。上述步骤(3)中丙酮的加入量是粗酶液体积的1 3倍，粗酶液加入丙酮后搅拌 10-15min,4000rmp 离心 10 30min，取沉淀物。上述步骤中热处理的条件为温度40 70°C、时间10 30min ；K2HPO4缓冲液的加入量是沉淀物体积的20 30倍，沉淀物加入K2HPO4缓冲液后搅拌5-8min，然后 4000rmp离心10 30min，获得上清液。上述步骤(5)中螺旋梯度洗脱技术采用浓度为2 50mmol/L、pH值为7. 2 9. 0 的K2HPO4缓冲液通过梯度盐析原理使杂质逐级沉淀的方法来实现SOD酶的纯化。本发明的优点是本发明综合生物与化学方法，采用高效分离、提取及纯化技术， 生产方法简单、周期短、污染小，适用于大规模工业化生产。经检测，采用本方法提取的猪血 Cu/Zn-SOD，其单位酶活可以达到6000U/mg以上。
具体实施例方式实施例1 向猪血中加入10%体积的2 5%的草酸钾溶液，3000rpm离心20min去血浆， 收集红细胞。然后加入5倍的0. 9% NaCl溶液进行清洗，期间不断搅拌后，4000rpm离心 20min。弃去上清液后，收集红细胞并加入2倍体积比的去离子水(pH = 9)，4°C水浴下静置 IOh后得到溶血液；向溶血液中缓慢加入4°C下冷预过的0. 25体积的95%乙醇后，再缓慢加入预冷过的0. 2体积的氯仿，搅拌15min。静置0.证后，4000rmp离心20min，收集上清液获得粗酶液；向粗酶液中加入3倍体积的丙酮，搅拌IOmin后，4000rmp离心20min，取沉淀物；将沉淀物用加入2倍体积的去离子水进行溶解，并在60°C温度下热处理15min后，迅速冰浴至4°C以下。然后，加入20倍体积的K2HPO4缓冲液，搅拌5min后，4000rmp离心20min， 获得上清液。采用浓度为8. 5mmol/L、pH值为8. 2的K2HPO4缓冲液通过梯度盐析原理使杂质逐级沉淀，可以获得纯化酶液；将纯化酶液通过透析工艺除去盐离子，并最终将精致酶液进行冷冻干燥，可以获得最终的猪血SOD成品。实施例2 向猪血中加入10%体积的2 5%的草酸钾溶液，3000rpm离心30min去血浆， 收集红细胞。然后加入3倍的0. 9% NaCl溶液进行清洗，期间不断搅拌后，4000rpm离心 20min。弃去上清液后，收集红细胞并加入3倍体积比的去离子水(pH = 9)，4°C水浴下静置IOh后得到溶血液；向溶血液中缓慢加入4°C下冷预过的0. 5体积的95%乙醇后，再缓慢加入预冷过的0. 5体积的氯仿，搅拌15min，静置0. 5h后，4000rmp离心30min，收集上清液获得粗酶液；向粗酶液中加入2倍体积的丙酮，搅拌IOmin后，4000rmp离心20min，取沉淀物；将沉淀物用加入2倍体积的去离子水进行溶解，并在50°C温度下热处理20min后，迅速冰浴至4°C以下。然后，加入25倍体积的K2HPO4缓冲液，搅拌5min后，4000rmp离心20min，获得上清液。采用浓度为8. 5mmol/L、pH值为8. 2的K2HPO4缓冲液通过梯度盐析原理使杂质逐级沉淀，可以获得纯化酶液；将纯化酶液通过透析工艺除去盐离子，并最终将精致酶液进行冷冻干燥，可以获得最终的猪血SOD成品。
权利要求
1.一种从猪血中提取超氧化物歧化酶SOD的方法，其特征在于依照如下步骤进行(1)向猪血中加入抗凝剂，离心3000rpm离心10 30min去血浆，收集红细胞；然后加入红细胞体积3 5倍的0. 9% NaCl溶液进行清洗，离心4000rpm离心10 30min，弃去上清液后，收集红细胞并加入红细胞体积1 3倍体积的去离子水，0 4°C水浴下静置 10-15h后得到溶血液；(2)向溶血液中缓慢加入4°C以下冷预过的95%乙醇后，再缓慢加入预冷过的的氯仿， 然后搅拌、静置、离心后收集上清液获得粗酶液；(3)向粗酶液中加入丙酮，然后搅拌、离心，取沉淀物；(4)将沉淀物用加入1-3倍体积的去离子水进行溶解，并进行热处理后，迅速冰浴至 40C以下，然后，加入K2HPO4缓冲液，搅拌、离心后获得上清液；(5)采用螺旋梯度洗脱技术对上清液进行纯化处理，获得纯化酶液；(6)将纯化酶液通过透析工艺除去盐离子，并最终将精致酶液进行冷冻干燥，可以获得最终的猪血SOD成品。
2.根据权利要求1所述的一种从猪血中提取超氧化物歧化酶SOD的方法，其特征在于 上述抗凝剂采用草酸钾溶液，其浓度为2 5%，其体积是猪血体积的10%。
3.根据权利要求1所述的一种从猪血中提取超氧化物歧化酶SOD的方法，其特征在于 上述去离子水的PH = 9。
4.根据权利要求1所述的一种从猪血中提取超氧化物歧化酶SOD的方法，其特征在于 上述步骤O)中95%乙醇的加入量是溶血液体积的0. 2 0. 5倍，氯仿的加入量是溶血液体积的0. 1 0. 5倍，溶血液加入95%乙醇和氯仿后搅拌10-20min、静置0. 5_lh、4000rmp 离心10 30min，收集上清液获得粗酶液。
5.根据权利要求1所述的一种从猪血中提取超氧化物歧化酶SOD的方法，其特征在于 上述步骤(3)中丙酮的加入量是粗酶液体积的1 3倍，粗酶液加入丙酮后搅拌10-15min， 4000rmp离心10 30min，取沉淀物。
6.根据权利要求1所述的一种从猪血中提取超氧化物歧化酶SOD的方法，其特征在于 上述步骤(4)中热处理的条件为温度40 70°C、时间10 30min ;Κ2ΗΡ04缓冲液的加入量是沉淀物体积的20 30倍，沉淀物加入K2HPO4缓冲液后搅拌5-8min，然后4000rmp离心 10 30min，获得上清液。
7.根据权利要求1所述的一种从猪血中提取超氧化物歧化酶SOD的方法，其特征在于 上述步骤(5)中螺旋梯度洗脱技术采用浓度为2 50mmol/L、pH值为7. 2 9. 0的K2HPO4 缓冲液通过梯度盐析原理使杂质逐级沉淀的方法来实现SOD酶的纯化。
全文摘要
该发明公开了一种从猪血中提取超氧化物歧化酶SOD的方法，该方法采用分离、清洗、破碎一步分离法与分离血浆与血球并得到溶血液，经乙醇-氯仿溶解沉淀法得到粗酶液，再经丙酮沉淀法沉淀得到SOD的粗蛋白，对上清液热变性，取上清弃去沉淀，采用螺旋梯度洗脱技术对上清液进行进一步的分离与纯化提高单位酶活，得到纯化的SOD酶液，经过膜过滤除盐，最后进行冷冻干燥，达到纯化的SOD的产品，简化了生产工艺和设备，适合工业化大规模生产的要求。
文档编号C12N9/08GK102337252SQ201010230060
公开日2012年2月1日 申请日期2010年7月19日 优先权日2010年7月19日
发明者卢进峰, 吴明文, 宋古全, 王雅静 申请人:天津宝迪农业科技股份有限公司