专利名称：琼脂平板筛选降解林可霉素好氧细菌的方法
技术领域：
本发明涉及林可霉素降解菌的筛选，具体的说是一种以固体培养方式，在琼脂平 板中筛选降解林可霉素好氧细菌的方法。
背景技术：
抗生素生产废水、废渣有微量抗生素残留，具有长期残留性、生物蓄积性，易引起 耐药性并存在各种安全隐患。微生物在治理环境污染中扮演着重要的角色，是抗生素在环 境中降解的重要途径之一。微生物降解已广泛应用于抗生素废水的治理，但利用微生物治 理抗生素废渣的研究较少，林可霉素生产废渣的降解菌研究更是尚未见报道。从自然界中分离筛选微生物菌株，主要包括采样、纯种分离、筛选等几个步骤，通 常纯种分离是在琼脂平板中进行，而筛选是在接种摇瓶进行。具体地说，琼脂平板的主要作 用是分离微生物菌株，对微生物菌株进行定性，接种摇瓶的主要作用是对微生物菌株的生 产性能或降解性能进行定量，从而筛选出最优菌株。筛选出降解林可霉素的好氧细菌，其主要目的是用于降解废渣中林可霉素残留， 在后期的应用中宜采用固体培养的方式，若采用液体培养的方式，存在设备投资大、耗水量 大，产生二次污染等问题。基于降解林可霉素的好氧细菌在后期应用的考虑，降解林可霉素 的好氧细菌筛选不宜在接种摇瓶中进行，而应在琼脂平板，通过固体培养的方式进行。综上，本发明提供一种以固体培养方式，在琼脂平板中筛选降解林可霉素好氧细 菌的方法，为实现利用微生物降解林可霉素生产废渣中的抗生素残留，开发废渣生产饲料、 有机肥等奠定基础，为抗生素降解菌的筛选提供一定参考。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用固体培养方式，以琼脂平板筛选降解林可霉素好 氧细菌的方法，具体步骤如下(1)基础培养基琼脂平板的制备按下列浓度配制培养基，K2HP041. Og/L, KH2P04 0. 2g/L, MgS04 7H20 0. 2g/L, CaCl2 2H20 0. 04g/L, FeCl3 6H200. 005g/L, NH4N03 0. 25g/ L，琼脂15 20g/L，于121 °C灭菌15min，以10ml/个培养皿分装培养基，待培养基冷却凝固 后在其表面均勻添加一定量的林可霉素水溶液，静置至表面干燥即可；(2)琼脂中林可霉素测定方法采用酸溶加热的方式溶解琼脂平板，通过紫外分 光光度法测定林可霉素含量，对琼脂平板中林可霉素进行定量分析，为林可霉素降解菌的 筛选奠定基础；(3)样品采集采集林可霉素生产废渣堆放处的土壤，利用无菌水配制成土壤稀 释液用于菌种的分离；(4)菌种分离取0. 2mL 土壤稀释液涂布含0. 015g林可霉素的基础培养基琼脂平 板，30°C下培养5天，经稀释涂布分离单菌落，获得能够以林可霉素为唯一碳源和能源生长 的菌株并保存试管中；
(5)菌种筛选无菌水将分离得到的菌株配成菌悬液，0D值0. 8，取0. 2mL涂布含 0. 02g林可霉素的基础培养基琼脂平板中，以不接种的相同平板为空白对照，在30°C培养7 天后，在优化得到的最佳酸溶解工艺条件下测定样品，并根据线性回归方程测定出琼脂平 板中林可霉素的含量，以林可霉素降解率为指标，筛选林可霉素降解菌。所述步骤(2)酸溶加热的条件为盐酸浓度1. 14mol/L，加盐酸量3mL，加热时间 70s。所述步骤(2)测定琼脂平板中林可霉素的标准方程为y = 0. 01533+0. 00299x, 其中x表示林可霉素浓度(ug/ml)，y表示吸光值，方程的相关系数r = 0.99935，浓度范 围为0 250ug/mL，待测定的样品在静置30min后，该方法测定是稳定的，在30 120min 内，RSD为0. 13756%，精密度的RSD为0. 2654%，重复性的RSD为0. 4328%，样品回收率 94. 8858%。该琼脂平板筛选降解林可霉素好氧细菌的方法是从林可霉素生产废渣堆放处的 土壤取样，通过在基础培养基中添加一定量林可霉素，以稀释涂布分离单菌落，获得能够以 林可霉素为唯一碳源和能源生长的菌株。目前，林可霉素的定量测定有紫外分光光度法、高 效液相色谱法和旋光法等，这些方法均需要林可霉素样品为液态。而琼脂平板中林可霉素 的样品为固态，琼脂在100°c时才融化，在常温下琼脂很快会固化，因此，琼脂平板中林可霉 素含量难以进行定量分析。发明采用酸溶加热的方式处理琼脂平板，利用紫外分光光度法 测定琼脂平板中林可霉素含量，优化了酸溶加热工艺并对琼脂中林可霉素的测定方法进行 了考察。利用已建立的琼脂平板中林可霉素测定方法，发明采用固体培养方式，考察分离得 到的各菌株在琼脂平板中的林可霉素降解率，筛选菌株。在琼脂平板中筛选林可霉素降解 菌的技术，具有操作方便、快速、准确的优点。下面通过实验来加以说明(1)琼脂平板中林可霉素测定研究①酸溶加热条件的优化在含10mL基础培养基的琼脂平板表面添加0. 5ml浓度为40mg/mL的林可霉素 水溶液，待表层干燥后，添加一定体积和浓度的盐酸，水浴加热溶化一定时间，溶液定容体 积至15mL,静止12h，在10000r/min条件下离心15min后，取上清液1. 5mL,加0. 5mL浓 度0. 02mol/L氯化钯溶液，以lmol/L盐酸定容为10mL混合均勻后，静止lOmin，测定其在 380nm处的吸光强度，记为~。以不含琼脂的10ml基础培养基溶液加0. 5ml浓度为40mg/ mL的林可霉素水溶液为空白对照，同上处理，测定其在380nm处的吸光强度，记为A。。以式 (1)计算相对回收率相对回收率(％) = A/AoX 100% (式 1)设计Box-Behnken实验方案(见表1)研究工艺参数盐酸浓度、酸加量及加热时间 对测定琼脂平板中林可霉素含量的影响，以相对回收率为指标，确定最佳工艺组合。表1实验因素水平及编码表1
— -10 1 一X,盐酸浓度/mol/L(15L01.5
X2酸加量/mL 1 3 5 X,加热时间/min1. 0L5_2.0
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表2实验设计方案及结果表权利要求
一种琼脂平板筛选降解林可霉素好氧细菌的方法，其特征在于按下述步骤制备(1)基础培养基琼脂平板的制备按下列浓度配制培养基，K2HPO4 1.0g/L，KH2PO4 0.2g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，CaCl2·2H2O 0.04g/L，FeCl3·6H2O 0.005g/L，NH4NO3 0.25g/L，琼脂15～20g/L，于121℃灭菌15min，以10ml/个培养皿分装培养基，待培养基冷却凝固后在其表面均匀添加一定量的林可霉素水溶液，静置至表面干燥即可；(2)琼脂中林可霉素测定方法采用酸溶加热的方式溶解琼脂平板，通过紫外分光光度法测定林可霉素含量，对琼脂平板中林可霉素进行定量分析，为林可霉素降解菌的筛选奠定基础；(3)样品采集从林可霉素生产废渣堆放处的土壤取样，利用无菌水配制成土壤稀释液用于菌种的分离；(4)菌种分离取0.2mL土壤稀释液涂布于含0.015g林可霉素的基础培养基固体琼脂平板，30℃下培养5天，经稀释涂布分离单菌落，获得能够以林可霉素为唯一碳源和能源生长的菌株并保存试管中；(5)菌种筛选无菌水将分离得到的菌种配成菌悬液，OD值0.8，取0.2mL涂布含0.02g林可霉素的基础培养基琼脂平板中，以不接种的相同平板为空白对照，在30℃培养7天后，在优化得到的最佳酸溶解工艺条件下测定样品，并根据线性回归方程测定出琼脂平板中林可霉素的含量，以林可霉素降解率为指标，筛选林可霉素降解菌。
2.按照权利要求1所述的琼脂平板筛选降解林可霉素好氧细菌的方法，其特征在于 步骤(2)酸溶加热的条件为盐酸浓度1. 14mol/L，加盐酸量3mL，加热时间70s。
3.按照权利要求1所述的琼脂平板筛选降解林可霉素好氧细菌的方法，其特征在于 步骤(2)定琼脂平板中林可霉素的标准方程为y = 0. 01533+0. 00299x，其中χ表示林可霉 素浓度(ug/ml)，y表示吸光值，方程的相关系数r = 0. 99935，浓度范围为0 250ug/mL，待 测定的样品在静置30min后，该方法测定是稳定的，在30 120min内，RSD为0. 13756%, 精密度的RSD为0. 2654%，重复性的RSD为0. 4328%，样品回收率94. 8858%。
全文摘要
本发明涉及林可霉素降解菌的筛选，具体的说是一种在琼脂平板中筛选降解林可霉素的好氧细菌，本发明基于降解菌后期将应用于降解林可霉素生产废渣中抗生素残留的考虑，研究在琼脂平板中以固体培养方式筛选菌株。本发明具体方案包括琼脂平板中林可霉素测定方法建立、样品采集和菌种分离、琼脂平板中筛选菌株。在利用酸溶加热方式解决了琼脂平板中林可霉素定量测定的基础上，提供了一种以固体培养方式，在琼脂平板中筛选林可霉素降解菌的技术，具有操作方便、快速、准确等优点。通过本方法筛选出降解林可霉素的好氧细菌，可应用于降解林可霉素生产废渣的抗生素残留，为实现废渣的资源化利用奠定基础。
文档编号C12N1/20GK101948765SQ201010252489
公开日2011年1月19日 申请日期2010年8月13日 优先权日2010年8月13日
发明者何际芳, 刘凤霞, 周凯, 李慧星, 王莹, 薛刚, 许彬, 郭书贤 申请人:南阳理工学院