一种表达弹性蛋白酶2b的基因工程菌、其构建方法及应用的制作方法

专利名称：一种表达弹性蛋白酶2b的基因工程菌、其构建方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效表达人源弹性蛋白酶的基因工程 菌、其构建方法及应用。
背景技术：
弹性蛋白酶(elastase)是以水解不溶性弹性硬蛋白为特征的一类广谱蛋白水解 酶，在食品、医药、日化及环保领域有重要的开发前景。目前国内弹性蛋白酶的生产方法主 要是从动物的胰脏中提取，受到脏器材料及生产工艺的限制，成本较高，产量较低，大大落 后于市场需求，限制了弹性蛋白酶的应用推广。国内外广泛开展利用微生物发酵生产弹性 蛋白酶，在一定程度上缓解了工业用酶，如肉类嫩化剂、化妆品添加剂等方面的需求，但作 为医用生化药物仍然有很大的局限，这主要是由于微生物发酵生产的弹性蛋白酶在生物安 全性及毒理方面还有一定的不足，另外不同微生物来源的弹性蛋白酶性质有一定差别，距 离医用生化药物商品生产有一定的距离。本发明利用基因工程技术，通过反转录克隆了人肾脏组织中的弹性蛋白酶 2B (elastase 2B,ELA2B)基因，利用毕赤酵母表达系统对其进行表达，使大规模生产安全的 人源弹性蛋白酶成为可能，同时为人源弹性蛋白酶的结构和性质研究提供了实验材料。

发明内容
本发明的目的是提供一种能够高效表达人源重组弹性蛋白酶2B的基因工程菌。本发明的另一目的是提供上述基因工程菌的构建方法。本发明的进一步目的是提供上述基因工程菌在生产人源重组弹性蛋白酶中的应用。为了实现本发明目的，本发明的一种表达弹性蛋白酶2B的基因工程菌，其出发菌 株为毕赤酵母。优选地，其出发菌株为毕赤酵母GS115。上述基因工程菌的构建方法，其包括步骤1)从人体肾脏组织中提取总RNA，经 RT-PCR扩增得到ELA2B基因；2)将步骤1)中得到的ELA2B基因插入到表达载体中；3)将 步骤2)中构建的表达载体转入毕赤酵母，并筛选阳性克隆，得到重组毕赤酵母工程菌。前述的方法，其中所述表达载体的出发载体为pPIC9K，即将所述弹性蛋白酶2B基 因克隆到PPIC9K的多克隆位点而获得。将上述表达载体转入毕赤酵母的方法可以是电转化法，也可以采用本领域技术人 员所熟悉的任何将表达载体转入酵母细胞的方法，例如氯化锂转化法、PEG法等。前述的方法，其中步骤3)中所述筛选阳性克隆包括用MD培养基初步筛选阳性克 隆，再用G418抗性进行二次筛选，得到具有弹性蛋白基因高拷贝数的克隆，最后采用酪蛋 白-MM平板诱导法，筛选得到高分泌表达的重组菌株。前述的方法，其中所述所述弹性蛋白酶2B基因具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序 列。该序列可由产弹性蛋白酶的人肾脏组织中的弹性蛋白酶2B(elastase 2B,ELA2B)基因为模板克隆得到。本发明通过基因工程的方法构建人源弹性蛋白酶2B毕赤酵母表达系统，即将人 源弹性蛋白酶2B基因克隆到载体中，利用酵母表达载体系统，在酵母细胞中表达外源弹性 蛋白酶。毕赤酵母表达系统具有很高的生物安全性，获得包括美国FDA在内的广泛认可。此 外，它对外源蛋白具有很高的表达量和高分泌性，能够进行翻译后加工，使之更接近于天然 蛋白的构象和活性，是一种广泛应用的真核表达系统。更具体地说，可通过如下方法构建高效表达人源弹性蛋白酶2B的基因工程菌采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术，从人体肾脏组织中提取的总RNA中扩 增得到ELA2B基因。然后对PCR产物进行T-A克隆，获得质粒pGEM T-eaSy/ELA2B。测序 后与GenBank中的ELA2B基因序列进行比对。测序结果与GenBank上的序列完全一致。用 EcoRI和Not I分别对pGEM T-easy/ELA2B和毕赤酵母表达载体pPIC9K进行双酶切，将弹 性蛋白酶基因切下，转入到表达载体PPIC9K中，构建质粒pPIC9K/ELA2B。经过双酶切和测 序验证，证明插入方向正确且未引起碱基序列的变化。用Sac I对表达载体pPIC9K/ELA2B进行线性化，用电转化方法，将质粒转入毕赤 酵母GS115中，利用MD培养基筛选到近460个转化子，再经G418抗性的二次筛选，获得50 株含高拷贝的重组毕赤酵母转化子。采用酪蛋白-MM平板诱导的方法，成功筛选出高效分 泌表达的重组菌株。将菌株在新鲜YPD平板上划线，于30°C，倒置培养2天。分别挑取菌株的单菌落， 接种于20mL BMGY培养基中，用500mL三角瓶进行培养，直至细胞浓度达到0D_ = 2 6。 培养条件为28°C、摇床转速为200rpm。室温6000rpm条件下离心5min，收集菌细胞，弃去 上清液，用20mL BMMY培养基重悬细胞，开始诱导表达。诱导表达的培养条件为30°C，摇 床转速为200rpm，培养4天。取发酵液于4°C，lOOOOrpm离心5min去除菌体，将上清液于 Tris-HCL缓冲液(pH8. 0)中透析过夜，即得到粗酶液。通过DEAE-S印harose FF柱纯化，即 可获得纯酶。把发酵上清直接进行SDS-PAGE电泳，能够得到与天然弹性蛋白酶大小相近的条 带(28kDa)，以弹性蛋白为底物的平板水解实验，发现发酵上清能够专一水解底物弹性蛋 白，证实了表达产物具有一定的生物活性。以刚果红-弹性蛋白为底物，特定地测定重组弹 性蛋白酶的酶活，发现发酵液中粗酶的酶活比铜绿假单胞菌发酵产物高24倍。测定酶活的方法如下准确称取10mg刚果红-弹性蛋白，加入pH7. 4，0. 2mol/L的硼酸缓冲液2mL，再加 lmL经过适当稀释的上清酶液，28°C振荡反应3h后，立即用pH6. 0，浓度为0. 7mol/L的磷酸 缓冲液2mL终止反应，lOOOOr/min离心5min后，取上清液于495nm处的测定光密度值，以不 加底物的上清酶液作为空白对照。在此反应条件下，每5mL反应混合液495nm处增加0. 01 个吸光度所需的酶量定义为1个弹性蛋白酶活性单位(u)弹性蛋白酶活性(U/mL)=(样品的0D495-空白对照的0D495) X 100X稀释倍数借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果(1)首次在真核酵母表达系统中高效表达了具有很高酶活的重组人源弹性蛋白酶。(2)重组蛋白的产量高达375y g/mL，发酵液中粗酶的酶活为980U/mL，是铜绿假单胞菌发酵产物酶活的24倍。(3)重组蛋白可直接分泌到培养基中，无需破碎细胞且培养基中杂蛋白的含量极 少，纯化步骤简单，只需通过一步纯化即可获得纯酶。(4)适于大规模的高密度发酵生产，操作简单，成本低，产物具有很高的生物安全 性，适用于食品和医药等领域。


图1为本发明质粒pGEM-T easy/ELA2B用EcoR I和Not I进行双酶切后的琼脂 糖凝胶电泳图，其中M为DL2000DNA Marker。图2为本发明重组质粒pPIC9K/ELA2B的酶切鉴定电泳图，其中Ml和M2为DNA Marker, 1 3分别代表质粒pPIC9K/ELA2B ；EcoRI限制性内切酶单切的pPIC9K/ELA2B ； EcoR I和Not I限制性内切酶双切的pPIC9K/ELA2B。图3为本发明人源弹性蛋白酶基因ELA2B的测序结果与GenBank上的ELA2B序列 进行比对的结果示意图。图4为本发明His+转化子在含G418的YPD平板上的筛选结果示意图。图5为本发明利用MM/MD平板筛选甲醇利用型重组酵母的结果示意图。图6为本发明重组毕赤酵母菌株经过不同天数诱导表达后，上清中的SDS-PAGE电 泳图，其中，M为低分子量蛋白Marker，1为转化pPIC9K空载体的酵母菌，2 5分别代表诱 导1天、2天、3天、4天。图7为本发明含有重组弹性蛋白酶的粗酶液通过DEAE-S印harose FF柱纯化的梯 度洗脱图。图8为本发明重组酵母发酵上清液中弹性蛋白酶的活性检测结果示意图，其中 1 4代表不同批次的重组酵母诱导表达后的发酵上清液；CK代表未诱导表达的重组酵母 菌发酵上清液。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件进行操作，例如 Sambrook 等，分子克隆实验室手册(New York :ColdSpring Harbor Laboratory Press， 1989)中所述的条件，或按照制造厂商建议的条件。实施例1弹性蛋白酶2B基因的扩增1.肾脏组织中总RNA的提取(1)精确称取100mg液氮保存的肾脏组织样品，放入玻璃勻浆器，加入1. 5mL的 RNAiso Reagent，放置冰上勻浆；(2)将勻浆液转移至1. 5mL离心管中，室温静置5分钟；(3) 12000rpm 4°C离心15min。吸取上清液，移入新的离心管；(4)加入400 PL氯仿，用力震荡均勻，待溶液充分乳化呈乳白状后，室温静置 5min ；(5) 12000rpm 4°C离心15min，小心吸取上清液转移至新的离心管；
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(6)向上清液中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混勻后，室温静置 lOmin ；(7) 12000rpm 4°C离心lOmin，小心弃去上清，缓慢沿离心管加入1ml的75%乙醇， 轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12000rpm 4°C离心。C 5min，弃去上清；(8)室温干燥沉淀4min，加入DEPC处理水，待RNA沉淀完全溶解后于_80°C保存。通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的提取效果。2. cDNA 第一链合成使用TaKaRa公司的High Fidelity PrimeScript 反转录试剂盒进行反转录实验。(1)总RNA变性解链，在PCR反应管中加入下列反应液，65°C，5min保温后，在冰上 预冷却2min ；总 RNA1 u L引物RluLdNTP 混合液1 ii LRandom 6mers1 li LddH20 (不含 Rnase)1 u L(2)反转录反应，在冰浴后的解链反应体系中加入以下反应液，轻轻混勻，42°C温 浴lh。5XPrimerScript RT4 u LRnase 抑制剂0. 5 ii LPrimeScript Rtase0. 5u LddH20 (不含 Rnase)5 u L(3) 30°C温浴lOmin后，转为42°C温浴30min，在95°C，5min后冰上冷却，得到的产 物-20°C保存用于PCR扩增。以肾脏中提取的弹性蛋白酶cDNA为模版，以合成的引物进行PCR扩增，从而获得 目的基因序列。(1)第一次PCR 50 UL反应体系和扩增条件如下引物P1、P2分别为5， -TACAGAACTCCCACGGACACAC-3，5， -TTCCAAGTCTGAAACAGTCCCA-3‘上述的反转录反应液2iiL5XPrimerSTAR10 u LdNTP 混合液4 ii L引物 PI1 u L引物 P21 u LPrimerSTAR HSDNA 聚合酶 0. 5 ii LddH2031. 5 u L反应程序为94°C变性 3min ；98°C变性 lOsec，60°C退火 5sec，72°C退火 90sec，30 个循环；72°C延伸90sec。
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(2)第二次PCR50 u L反应体系和扩增条件如下引物A1、A2分别为5’ -TCCCACGGACACACCATGAT-3，5， -GTTAGTTATTTGCAATCACCG-3，上述的PCR反应液1 y L5 X Primer STAR PCR 缓冲液10 ii LdNTP 混合液4u L引物 A11 u L引物 A21 u LPrimerSTAR HS DNA 聚合酶0. 5 ii LddH2032. 5 u L反应程序为94°C变性4min ；98°C变性 10sec，60°C退火 15sec，72°C退火 60sec， 30个循环；72°C延伸lOmin。实施例2克隆质粒pGEM-T easy/ELA2B的构建及鉴定1.引物的合成F :5，-GCGCGAATTCTGTGGGGTCTCCACTTACG-3‘(下划线为 EcoR I 酶切位点)R 5’ -ATCGCGGCCGCTTAGTTATTTGCAATCACCGAATTG-3’ (下划线为 Not I 酶切位点)引物合成由上海生工公司完成。2.目的基因的PCR扩增PCR反应采用30 ii L体系进行，以重组的pMD_T easy/ELA2B质粒为模板，在0. 5mL Eppendorf管中依次加入无菌蒸馏水20.2uL
lOXPyrobest 缓冲液 II (含 Mg2+)3uL
dNTP混合物(各2. 5mM)2.4uL
上游引物(20pmol/uL)1 u L
下游引物(20pmol/iiL)1 u L
基因组0嫩(11^/1^)1 u L
Pyrobest高保真聚合酶(5U/ u L)0. 4u L _总计30iiL瞬时离心混勻后，按如下反应条件进行扩增94°C预变性4min ；98°C变性10s， 64°C复性30s，72°C延伸lmin，25个循环；72°C延伸lOmin结束反应。用琼脂糖凝胶电 泳检测PCR产物。结果显示，在760bp处出现目的条带，与预期相符。3.回收ELA2B基因的PCR产物将扩增ELA2B基因的PCR产物，以琼脂糖凝胶进行电泳。在紫外灯下迅速切下 目的条带，按照Tiangen DNA回收试剂盒(天根生化科技有限公司)的说明进行回收。4.与 pGEM-T easy 载体连接，构建质粒 pGEM-T easy/ELA2B连接反应采用10 ii L体系，全部操作均在冰上进行。在0. 5mL的Eppendorf管中， 依次加入
无菌蒸馏水 3iiL2XLig 缓冲液 5iiLpGEM-T easy 0. 5 u L目的 DNA0. 5u LT4DNA 连接酶 luL_总计10iiL以上各溶液经瞬时离心混勻后，于4°C冰箱进行过夜连接。5.连接产物对大肠杆菌感受态的转化开盖前将连接产物离心至管底，于冰上吸取10iiL连接产物加入1.5mL的 Eppendorf管中；取出-70°C冻存的大肠杆菌DH5ci感受态细胞，置冰上使其缓慢融化，轻弹 管壁使细胞混合均勻；取100 u L感受态细胞置于连接管中，混勻，置于冰上30min ；于42°C 水浴中热击90s，立即冰浴2min ；加入800 u L无附加抗生素的LB液体培养基，混勻，37°C预 培养45min ；吸取200 u L菌液涂布于LB/Amp/IPTG/X_Gal平板上，37°C培养16_24h，观察菌 落生长情况，利用蓝白斑初筛重组转化体。6.阳性克隆的鉴定(1)小量碱法提取质粒从LB/Amp/IPTG/X-Gal平板上挑取白色单菌落接种于25mLLB/Kan液体培养基中， 37 °C振荡过夜。吸取lmL菌液于1. 5mL的Eppendorf管中，于4°C，12000 X g离心5min收集菌体。用0.5mL STE 溶液(0. 1M NaCl，0.01M Tris-Cl (pH8. 0) ,0. 001MEDTA (pH8. 0))重 悬菌体沉淀，于4°C，12000 Xg离心5min，倾去上清，并使沉淀尽量干燥。用预冷(4 V冰箱放置可直接使用)的100 y L溶液I (50mM葡萄糖，25mM Tris-Cl (pH8. 0)，10mM EDTA(pH8. 0))重悬，在振荡器上剧烈振荡后，于冰上静置5min。加入200 iiL新配置的溶液11(0. 2M Na0H,l% (m/V) SDS)，盖紧管帽，快速轻轻上 下颠倒5次，使之充分混勻，勿要振荡，并在冰上放置5min。加入150 u L预冷的溶液III (5M乙酸钠60. OmL, 11. 5mL冰醋酸，28. 5mL水)，温和 振荡10s后，冰浴5min。于4°C，15000X g离心5min，然后将上清移入另一干净离心管中。加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(25241)，轻轻混勻后，于4°C，15000Xg离 心5min，然后将上层水相转移入另一干净的离心管中。用等体积或2/3体积的异丙醇沉淀质粒DNA，待上下颠倒4 5次，充分混勻后， 于-20°C放置 lOmin。于4°C，15000 Xg 离心 5min，吸去上清。以lmL预冷的70%乙醇振荡洗涤DNA沉淀1次，于4°C，15000 X g离心2min。倾去上清，再离心2min后，吸尽上清，除尽管壁上的液滴，并在超净工作台上吹干 lOmin。用20 ii L无菌水(含20 ii g/mL的RNaes)溶解DNA沉淀，37 V保温降解lh后，以 1 %琼脂糖电泳检测质粒后，于-20 °C冻存备用。
(2)重组质粒酶切鉴定无菌蒸馏水DNA10 X K 缓冲液(TaKaRa 公司)EcoR I (TaKaRa 公司)Not I (TaKaRa 公司)_
9u L 7uL 2uL 1 u L 1 u L 总计以上各溶液经瞬时离心后，于37°C水浴消化1 3h，取10 P L产物用琼脂糖凝 胶电泳检测酶切条带，结果如图1所示。(3) DNA序列测定与分析随机选取人源ELA2B重组子一个，交由中国农科院进行序列测定，并利用 DNAMAN(Version5. 0)等软件分析测序结果。将该测序结果与GenBank上的ELA2B序列进行 比对，结果如图3所示。实施例3重组表达质粒pPIC9K/ELA2B的构建及鉴定人源ELA2B基因的PCR产物和表达载体pPIC9K均用EcoR I和Not I切成双粘性 末端，用T4 DNA连接酶4°C连接过夜，转化大肠杆菌DH5ci。通过氨苄抗性培养基筛选，分 别挑取单菌落培养，提取质粒，经EcoR I和Not I双酶切鉴定外源片段的插入情况。基因 的克隆、重组子筛选均参照Sambrook的《分子克隆)》(第二版)的方法进行1.带酶切位点的PCR引物的设计合成根据表达质粒pPIC9K多克隆位点(MCS)上的单酶切位点EcoRI和Not I以及 GenBank上的ELA2B序列(Gene ID. 51032)设计引物，引物合成由上海生工公司完成。上游引物5，-GCGCGAATTCTGTGGGGTCTCCACTTACG-3(下划线为 EcoR I 酶切位点)下游引物5，-ATCGCGGCCGCTTAGTTATTTGCAATCACCGAATTG-3’(下划线为 Not I 酶 切位点)2.采用高保真酶进行PCR扩增采用Pyrobest高保真聚合酶和引物进行扩增，电泳检测扩增产物，回收PCR产物。 方法同实施例2中的描述。3.双切双连构建 pPIC9K/ELA2B将回收的ELA2B的PCR扩增产物和表达质粒pPIC9K，分别用限制性内切酶EcoR I 和Not I进行双酶切，酶切反应采用20 y L体系，根据模板浓度加入适量模板，各反应5管， 在0. 5mL Eppendorf管中依次加入无菌水7iiL10 X H 缓冲液(TaKaRa 公司)2 ii L0. 1 % BSA2u LEcoR I (TaKaRa 公司)1 ii LNot I (TaKaRa 公司)1 ii L质粒pGEM-T/ELA2B/ 质粒 pPIC9k 各 7 ii L总计20iiL
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以上各溶液经瞬时离心混勻后，于37°C酶切3h，两种酶切产物进行琼脂糖凝 胶制备电泳，分别回收DNA片断，琼脂糖凝胶电泳粗略估计各回收产物的浓度，按照PPIC9K 载体片段与ELA2B基因片段摩尔比1(3 10)的比例进行连接反应，按如下反应体系进 行以上各溶液经瞬时离心混勻后，于16°C进行过夜连接后，取lOyL连接产物转化 大肠杆菌DH5 a。转化操作步骤同实施例2中的描述。4.重组表达质粒pPIC9K/ELA2B的鉴定(1)重组质粒菌液PCR鉴定以重组转化菌的菌液作为PCR反应的模板，用引物进行扩增。方法同实施例2中 的描述。提取的重组表达质粒通过PCR方法检测，在760bp左右处有目的条带扩增出来，与 预期结果相符。(2)酶切鉴定用限制性内切酶Not I和EcoR I进行酶切鉴定，酶切体系同实施例2中的描述， 37°C酶切3h后电泳检测酶切情况。结果如图2所示，分别得到大小为约9300bp和约760bp 的两个片段。(3)测序及分析将经PCR和酶切正确的重组子送上海生工生物公司测序。应用DNAMAN(Version 5.0)软件分析测序结果。测序结果同克隆结果一致，碱基序列未发生变化。实施例4重组质粒pPIC9K/ELA2B转化毕赤酵母菌株GS1151.制备GS115感受态细胞(1)取lOOii L于-70°C冻存的GS115菌株(美国Invitrogen公司)接入2mL新 鲜YEPD培养基中，28 30°C摇床180rpm过夜培养后，于新鲜YEPD平板上划线，28 30°C 培养2天至单菌落出现。(2)挑取一个单菌落接种于5mLYEPD培养基中，28 30°C摇床180rpm过夜培养， 取出lmL接种于100mL YEPD培养基中扩大培养至0D600 = 1. 3-1. 5，其余可用20%的甘油 进行菌种保藏。(3)于4°C，1500Xg离心5min收集菌体细胞，并用100mL冰预冷无菌水重悬菌体细胞。(4)于4°C，1500Xg离心5min收集菌体细胞，再用50mL冰预冷无菌水重悬菌体细 胞。(5)于4°C，1500Xg离心5min收集菌体细胞，再用4mL冰预冷的无菌的lmol/L山 梨醇重悬菌体细胞。(6)于4°C，1500 X g离心5min收集菌体细胞，再用0. 2mL冰预冷的无菌的lmol/L无菌水10 X 连接 buffer (Promage 公司)pPIC9K载体片段ELA2B基因片段T4DNA 连接酶(Promage 公司)
6. 5 u L 2. 5u L
5 u L 10 u L
2. 5u L
10山梨醇重悬菌体细胞。置于冰上备用。2.电转化DNA样品的制备将pPIC9K/ELA2B用Sac I进行线性化酶切反应，即在0. 5mL的Eppendorf管中依 次加入2 u L10X酶切缓冲液、0. 5 u LBSA溶液、3 ii L重组表达质粒、1 y L限制性内切酶Sac I，最后加入无菌水至总体系20 yL。可同时多做几管。将以上溶液经瞬时离心混勻后，于 37°C酶切过夜。用1 %琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，若酶切反应完全，则将各管合并，加入 等体积的苯酚氯仿异戊醇(25241)抽提一次，lOOOOg离心5min，取上清液，加入 1/10体积的3M醋酸钠溶液(pH5. 2)和2倍体积的无水乙醇进行线性质粒的浓缩，于-20°C 沉淀lh，10000g离心5min，用70%的乙醇溶液洗涤沉淀，_20°C储存备用。3.毕赤酵母感受态细胞的电转化在Bio-Rad Gene Pulse电转仪上进行电转化反应。电转化条件为电压1500V， 电容25 ii F，电阻200 Q，转化时间随DNA样品的不同而变化，并由仪器自动给出，通常在 3. 5-4. 0s范围内。(1)将巴斯德毕赤酵母感受态细胞、重组表达质粒pPIC9K/弹性蛋白酶基因的线 性化DNA样品及0. 2cm电转化杯置于冰上，预冷lOmin。(2)在0. 2cm电转化杯内将80 i L感受态细胞和10 i g线性DNA立即混合均勻，冰 浴5min后，擦干电转化杯，并迅速置于电转仪上电击1次，然后立即加入lmL lmol/L冰预 冷的无菌山梨醇溶液，混勻后，转入1.5mL微离心管中，重新置于冰上。(3)取0. 4mL电转化物均勻涂布于MD平板上。(4)按照上述方法，以空质粒PPIC9K转化菌株GS115，作为表达的阴性对照。实施例5高表达弹性蛋白酶2B蛋白的毕赤酵母基因工程菌的筛选1.高拷贝毕赤酵母His+转化子的快速筛选质粒pPIC9K拥有细菌的卡那霉素抗性基因，可传递抗性给酵母细胞从而使其对 抗生素G418产生抗性。将转化的毕赤酵母菌株分别在含有不同浓度G418的培养基中进行 培养，筛选结果如图4所示。随着抗生素G418浓度的不断增加，能够存活的毕赤酵母菌株 逐渐减少，最后获得50株抗高浓度G418的菌株，这些菌株很可能含有高拷贝转化子。具体 操作步骤包括(1)将His+转化子点接在新鲜MD平板上，于30°C进行培养直至转化子出现。将 转化子置于4°C备用。(2)利用无菌操作技术，在细胞培养板的各孔中分别加入200y LYPD培养基。(3)用无菌牙签将MD平板上的His+转化子分别接入各孔中，搅拌均勻。在操作中 应注意，既要防止杂菌污染，同时也应避免转化子之间的交叉污染。(4)盖好细胞培养板的上盖，将第一批His+转化于30°C静置培养2d。(5)取另一块新鲜的细胞培养板，并在每孔内分别加入190y LYPD培养基。(6)依照次序分别向各孔内加入10yL第一批His+转化子，用移液器将其充分混 勻。(7)盖好细胞培养板的上盖，将第二批His+转化于30°C静置培养Id。(8)重复步骤(4)和(5)，盖好细胞培养板的上盖，将第三批His+转化子于30°C静 置培养Id。
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(9)用100 y L移液器上下反复吹吸毕赤酵母细胞培养物，从而使第三批His+转化 子获得充分悬浮。(10)在不同的YPD/G418平板上(G418的终浓度分别为0、0. 50、1. 00、2. 00、 4. 00mg/mL)，分别点接2 y L相同的His+转化子培养物。(11)静置30min，待菌悬液被吸干后，将YPD/G418平板于30°C倒置培养，在第2、 3、4、5天观察G418抗性转化子。2.具有弹性蛋白酶活性的高表达毕赤酵母转化子的快速筛选利用转化酵母表达的弹性蛋白酶具有广泛的蛋白酶活性，能够在含有酪蛋白的平 板上形成透明圈的特性，采用酪蛋白-MM平板(含有1. 34% YNB、0. 5%甲醇、4X 10_5%生物 素、1.5%脱脂奶粉、1.5%琼脂)的方法来筛选产酶活高的转化子。结果如图5所示，转有 空载体PPIC9K的酵母菌株虽然能够在酪蛋白-MM平板上生长，但是不会形成透明圈。根据 透明圈大小，可以初步判断产酶量的高低。(1)用无菌牙签将MD平板上的His+转化子分别点接在新鲜的酪蛋白匪平板上， 于30°C倒置培养。在操作中应注意，既要防止杂菌污染同时也应避免转化子之间的交叉污
^fe o(2)每隔24h补加甲醇，补加甲醇的量为培养基体积的2v/v%，补加的方法为，将 纯甲醇加入到培养基的盖子上，倒置培养。(3)第2、3、4、5天观察酪蛋白的降解情况。实施例6重组毕赤酵母菌的诱导表达1.重组毕赤酵母菌株的诱导表达将毕赤酵母菌株在新鲜YPD平板上划线，于30°C，倒置培养2天。分别挑取菌株的单菌落，接种于25mL BMGY(培养基中，用500mL三角瓶进行培养 直至细胞浓度达到0D6QQ = 2 6。培养条件为28°C、摇床转速为200rpm。于室温4000rpm 条件下离心5min，收集菌细胞，弃去上清液。用20mL BMMY培养基重悬细胞，开始诱导表达。诱导表达的培养条件为30°C，摇 床转速为250rpm，培养6天。每天取样0. 5mL，并补加100%甲醇至终浓度为lv/v%。在补加甲醇过程中应注意 到取样体积及蒸发带来的发酵液体积变化，以便加入适量的甲醇。将0. 5mL发酵液液置于1. 5mL微离心管中，4°C lOOOOrpm离心5min。再将上清液 转移到另一新离心管中，-20°C保存，备检。2.发酵上清的SDS-PAGE检测SDS-PAGE的蛋白感量约在几十微克范围，只要该蛋白有一定量的基础表达，且不 论其是有活性的还是无活性的蛋白，均可以通过此方法加以验证。准备样品及低分子量蛋白Marker (1)将各菌株培养液的上清液置于冰上化冻。(2)在1. 5mL微离心管中，将100 u L上清液和25 y L 5XSDS样品缓冲液充分混 合，在沸水浴中煮5min。(3)上样时尽量使样品在孔的底部成一薄层，样品上样量为20 y L，低分子量蛋白 Marker上样量为5 yL。空置的加样孔，需加等体积的空白1 X SDS样品缓冲液，以防止相邻泳道样品的扩散。(4)以80V恒压进行电泳，当样品进入浓缩胶后将电压升至120V。(5)待溴酚兰跑至胶的底部，取出凝胶，置于大小合适的容器中，用染色液覆盖凝 胶，缓慢摇动1 2h。(6)倾去染色液，以脱色液覆盖凝胶，缓慢摇动约2h，其间更换脱色液3 4次，直 至获得清晰的蓝色条带及干净背景。SDS-PAGE电泳结果如图6所示。从图中可以看出，在分子量为28kDa左右有一 条清晰的蛋白带，与已知的弹性蛋白酶分子量一致，且杂蛋白很少，这将非常有利于蛋白的 纯化。用band leader 3. 0软件对蛋白条带进行扫描分析，得出表达蛋白占上清总蛋白的 90%以上。3.发酵上清液蛋白含量的测定采用Brandford法测定培养基中总蛋白含量。(1)标准曲线的绘制 a)标准蛋白质溶液100 u g/mL牛血清白蛋白(BSA)b)考马斯亮兰G-250溶液称lOOmg考马斯亮兰G-250溶于50mL90%乙醇，加入 100mL 85w/v%的磷酸，用蒸馏水定容至1L，置于棕色瓶中，常温可保存1个月。c)标准曲线的绘制取6支带塞试管，按表1加入下列试剂表 1
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1234 56 -
标准蛋白质，mL 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水，mL1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0蛋白质含量，飓 0 20 40 60 80 100上述各管混合均勻后，向管中加入5mL考马斯亮兰G-250溶液，摇勻，放置3min，用 lcm光径比色皿在595nm下测定吸光值，以蛋白质浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标 准曲线。(2)样品测定吸取适量样品，加蒸馏水补至lmL，再加入5mL考马斯亮兰G-250溶液，反应3min 后在595nm下测吸光度。根据样品吸光度和标准曲线得出样品溶液中蛋白含量，得出培养 基中的总蛋白的含量为421 u g/mL。可以估算出弹性蛋白酶的含量约为375 y g/mL。 实施例7重组弹性蛋白酶2B的活性检测(1)弹性蛋白平板法用弹性蛋白酶2B的特异性底物弹性蛋白来检测弹性蛋白酶的活性。在含有弹性 蛋白的琼脂板上放置灭过菌的牛津杯，用枪加入200 u L的发酵上清液，在37°C温箱放置 48h，观察弹性蛋白琼脂板上是否有透明的降解圈形成。重组弹性蛋白酶2B对弹性蛋白板
13的降解如图8所示，其中1 4代表不同批次的重组酵母诱导表达后的发酵上清液；CK代 表未诱导表达的重组酵母菌发酵上清液。(2)吸光度法准确称取10mg刚果红-弹性蛋白，加入pH7. 4，0. 2mol/L的硼酸缓冲液2mL，再加 lmL经过适当稀释的上清酶液，28°C振荡反应3h后，立即用pH6. 0，浓度为0. 7mol/L的磷酸 缓冲液2mL终止反应，lOOOOr/min离心5min后，取上清液于495nm处的测定光密度值，以不 加底物的上清酶液作为空白对照。在此反应条件下，每5mL反应混合液495nm处增加0. 01 个吸光度所需的酶量定义为1个弹性蛋白活性单位(u)弹性蛋白酶活性(U/mL)=(样品的0D495-空白对照的0D495) X 100X稀释倍数实施例5获得50株抗高浓度G418的菌株在发酵液中粗酶的酶活为最高为980U/ mL,最低为260U/mL，分别比铜绿假单胞菌发酵产物的酶活高24倍和6倍。实施例8重组弹性蛋白酶2B的纯化1、样品的准备(1)透析袋的活化将透析袋置于碱性EDTA 溶液(NaHC0320g/L，EDTA lmmol/L, pH 8.0)中煮沸 30min，然后用蒸馏水洗涤干净。(2)发酵液上清的透析收集发酵液上清，装于透析袋内，用蒸馏水透析24h，期间更换蒸馏水3 4次。(3)收集透析后的发酵液上清，根据透析后体积调整Tris浓度至0.02M，pH为 7. 2 (与平衡缓冲液相同)，准备上样。2、上样将准备好的蛋白样品以1. 3mL/min的流速用蠕动泵流过液，检测流出液中是否有 弹性蛋白酶活性从而判断弹性蛋白酶是否结合到柱上。3、淋洗用平衡缓冲液淋洗层析柱，在280nm处检测流出液的吸光度，直至A280达到0. 1 以下。4、梯度洗脱依次用含0.2M NaCl，0. 3M NaCl，0. 4M NaCl，0. 5M NaCl，0. 8M NaCl 的洗脱缓冲液 进行阶段梯度洗脱，每个浓度洗脱2 3个柱体积，控制流速为1. 3mL/min，用干净的试管分 步收集(每管2 3mL)。检测每管A280及弹性蛋白酶活性。洗脱纯化图如图7所示，通过SDS-PAGE电泳验证蛋白的纯度达到97%以上。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
含有ELA2B基因的表达载体，所述ELA2B基因具有Seq ID No1所示的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，出发载体为PPIC9K。
3.含有权利要求2所述表达载体的工程菌，其特征在于，出发菌株为毕赤酵母。
4.如权利要求3所述的工程菌，其特征在于，出发菌株为毕赤酵母GS115。
5.构建权利要求3或4所述工程菌的方法，其特征在于，其包括步骤1)从人体肾脏组织中提取总RNA，经RT-PCR扩增得到ELA2B基因；2)将步骤1)中得到的ELA2B基因插入到表达载体中；3)将步骤2)中构建的表达载体转入毕赤酵母，并筛选阳性克隆，得到重组毕赤酵母工 程菌。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述筛选阳性克隆包括用MD 培养基初步筛选阳性克隆，再用G418抗性进行二次筛选，得到具有弹性蛋白基因高拷贝数 的克隆，最后采用酪蛋白-MM平板诱导法，筛选得到高分泌表达的重组菌株。
7.权利要求3或4所述的工程菌在生产弹性蛋白酶2B中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种高效表达重组弹性蛋白酶2B的基因工程菌，其是通过反转录克隆了人肾脏组织中的弹性蛋白酶2B(elastase 2B，ELA2B)基因，构建表达载体，转入到毕赤酵母中，从中筛选出高效分泌表达的菌株。用该基因工程菌株发酵的重组弹性蛋白酶的表达量约为375μg/mL，发酵粗酶酶活可达980U/mL，是铜绿假单胞菌发酵产物酶活的24倍。
文档编号C12R1/84GK101974558SQ20101025878
公开日2011年2月16日 申请日期2010年8月20日 优先权日2010年8月20日
发明者商颖, 王海峰, 田洪涛, 罗云波, 许文涛, 谷欣晰, 黄昆仑 申请人:中国农业大学