一株金龟子绿僵菌转基因菌株及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株金龟子绿僵菌转基因菌株及其制备方法与应用，由金龟子绿僵菌基因与外源类枯草杆菌蛋白酶Pr1a基因融合构建的重组工程菌。该金龟子绿僵菌转基因菌株以金龟子绿僵菌为基础，利用Pgpd作为强的启动子，TTrpC作为终止子，Basta作为筛选标记，利用融合PCR的方法构建类枯草杆菌蛋白酶Pr1al过表达盒，然后制备真菌原生质体，利用CaCl2-PEG法进行基因工程改造，将过表达盒随机插入金龟子绿僵菌基因组中，进行过表达。本发明的金龟子绿僵菌转基因菌株对德国小蠊灭杀效果好，毒力较强，能够在短时间内实现对德国小蠊种群有效控制。
【专利说明】一株金龟子绿僵菌转基因菌株及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株金龟子绿僵菌转基因菌株及其制备方法与应用，具体的涉及一种 含有外源类枯草杆菌蛋白酶基因，经基因重组得到的金龟子绿僵菌及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 德国小蠊，俗称蟑螂，是常见的世界性卫生害虫之一，能够携带多种细菌、病毒及 寄生虫卵，导致疾病的传播，其分泌物或死亡虫体还能导致严重的机体过敏。自传入国内以 来，因其对栖息场所的适应性强、繁殖快，易对化学杀虫剂产生耐药性，对我国的侵害程度 日趋严重。
[0003]目前，对德国小蠊的防治仍以化学防治为主，但高毒、高残留的化学杀虫剂的长期 大量使用引起了一系列的环境和食品安全问题，因此减少化学杀虫剂的使用势在必行，以 生物防治为主的害虫防治策略逐渐受到广泛的重视。生物防治具有对人畜的安全性高，无 公害，无残留，有利于保持生态平衡和环保等优点，而被认为是对付高抗害虫的最有前途的 技术手段。
[0004]金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae)，属于半知菌亚门绿僵菌属，是一种昆 虫内寄生菌物。它对寄主的侵染过程包括粘附、孢子萌发、穿透虫体、体内发育和致死，这一 过程是附着胞、表皮降解酶和破坏菌素等物质的生理生化作用的综合结果，该菌通过体壁 接触感染导致害虫死亡，在侵染昆虫体壁过程中分泌一系列的胞外水解酶如蛋白酶，几丁 质酶等，降解昆虫体壁引起昆虫致病并死亡，其中研究最多的是胞外蛋白酶系。金龟子绿僵 菌产生的胞外蛋白酶在入侵寄主体壁的过程中起重要作用，其产生水平和活性高低是决定 金龟子绿僵菌侵染能力的重要因素。
[0005] 类枯草杆菌蛋白酶（subtilisin-likeproteaseA，Prla)是胞外蛋白酶的一类， 在降解昆虫体壁，并激活昆虫自毒免疫体系，引起害虫致病作用中起主要作用，已被证明是 重要的致病因子。已有研究证实，组成性表达在穿透昆虫体壁过程中起重要作用的Prla类 蛋白酶基因Prla显著提高了金龟子绿僵菌对烟草天蛾的毒力。
[0006] 自1973年Mishra和Tatum首次报道肌醇缺陷型粗糙链孢霉的DNA转化以来，丝状 真菌遗传转化研究发展非常迅速，目前已有100多种丝状真菌实现了转化。转化方法包括 CaCl2-PEG转化法，基因枪法，电激转化法及农杆菌介导转化法（ATMT)等。其中，CaCl2-PEG 转化法以原生质体作为受体细胞，具有群体数量大、容易获得纯合性的转化子等优点，近年 来在病原真菌的遗传转化中得到广泛应用。Bogo等通过PEG转化法，将带有苯菌灵抗性的 质粒pBT6导入金龟子绿僵菌，转化率为0.8?6. 9个转化子/μgDNA。Inglis等同样利 用PEG介导转化法将pBT6质粒导入玫烟色拟青霉和淡紫拟青霉中。Sandhu等采用PEG介 导法，成功的进行了白僵菌的遗传转化，线性和圆形的质粒Psv50的转化率分别为4和6个 转化子/μgDNA。
[0007] 在德国小蠊生物防治的过程中，以昆虫病原真菌-绿僵菌ESC-I为主要成分的灭 蟑盒（Biopath毒饵）较为成功，在实际应用中也取得了一定的效果，但昆虫病原真菌杀虫 剂灭杀效果通常较慢，毒力较弱，难以短时间内实现对德国小蠊种群的有效控制。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种对德国小蠊灭杀效果好，毒力较强，能够在短时间内实 现对德国小蠊种群有效控制的金龟子绿僵菌转基因菌株。该金龟子绿僵菌转基因菌株以 金龟子绿僵菌为基础，利用Pgpd作为强启动子，TTrpC作为终止子，Basta作为筛选标记， 利用融合PCR的方法构建类枯草杆菌蛋白酶Prla过表达盒，然后制备真菌原生质体，利用 CaCl2-PEG介导法进行基因工程改造，将过表达盒随机插入金龟子绿僵菌基因组中，进行过 表达，进一步增强其对德国小蠊的灭杀效果。
[0009] 本发明的另一目的是提供该金龟子绿僵菌转基因菌株在防治德国小蠊中的应用。
[0010] 为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
[0011] 一株金龟子绿僵菌转基因菌株，由金龟子绿僵菌基因与外源类枯草杆菌蛋白酶 Prla基因融合构建的重组工程菌。
[0012] 具体的，上述金龟子绿僵菌转基因菌株的构建方法如下：
[0013] (1)根据GenBank上登录号为EU526905的类枯草蛋白酶Prla基因的序列，设计 PCR引物，引物序列如下：
[0014]5' -aacatatgcatctgtctgctcttct-3'，如序列表中SEQ.ID.NO1 所不；
[0015]5, -ggcctaggttaggcaccgttgtaggcaa-3,，如序列表中SEQ.ID.NO2 所示。
[0016] 根据上述引物序列，以金龟子绿僵菌（Metarhiziumanisopliae)菌株基因组DNA 为模板，扩增出Prla基因片段，片段长度为1378bp，序列片段如序列表中SEQ.ID.NO3所 示：
[0017](2)利用Pgpd作为强的启动子，TTrpC作为终止子，Basta作为筛选标记,利用融 合PCR的方法构建过表达盒。
[0018] (3)采用二级培养法收集金龟子绿僵菌菌丝体，制备金龟子绿僵菌湿菌丝原生质 体；
[0019] (4)将步骤（2)制备的过表达盒采用CaCl2-PEG介导法导入到步骤（3)制备的金 龟子绿僵菌原生质体中，将过表达盒随机插入金龟子绿僵菌基因组中，进行过表达；
[0020] (5)筛选分离basta抗性能够稳定遗传的金龟子绿僵菌重组菌株。
[0021] 步骤⑵中，用于扩增Pgpd启动子的引物序列为：
[0022] Ml号引物：CGGAGAATATGGAGCTTCATCG，如序列表中SEQ.ID.NO4 所示；
[0023]M2 号引物：AGAAGAGCAGACAGATGCATGGGAAAAGAAAGAGAAAAGA，如序列表中SEQ. ID.NO5 所示；
[0024] 用于扩增TTrpC终止子的引物序列为：
[0025]M5 号引物：ACAACGGCAACGGTGCCTAAGATCCACTTAACGTTACTGA，如序列表中SEQ. ID.NO8 所示；
[0026]M6 号引物：CAGTTCTTCTCGGCGTTAACCCAGGGGCTGGTGACGG，如序列表中SEQ.ID.NO9 所示；
[0027] 步骤⑶中，金龟子绿僵菌原生质体的制备方法为：以0. 7mol/L的NaCI溶液作为 渗透压稳定剂，20mL原生质体Buffer，30°C酶解处理5小时。
[0028] 本发明的金龟子绿僵菌重组菌株可以采用固体发酵法获取大量孢子用作防治德 国小蠊的生防材料。
[0029] 采用固体发酵优化培养基进行发酵，固体发酵优化培养基配方：以大米为发酵物 料，按质量比为1 :〇. 3加入质量百分数为0. 02%CuS04、l%硝酸钠、1 %微量元素混合液；
[0030] 培养条件为：发酵温度为26-28°C，初始pH值为5. 5-6. 5,发酵前期保持高湿，后期 降湿，发酵周期12-15天，得率平均达到16亿孢子/克。
[0031] 本发明的有益效果：
[0032] (1)本发明的金龟子绿僵菌转基因菌株，通过过表达类枯草杆菌蛋白酶，提高了对 德国小蠊的杀虫毒力，改善了其生物安全性，具有良好的生产应用前景。
[0033] (2)本发明制备的金龟子绿僵菌转基因菌株，在有丝分裂的过程中basta抗性能 够稳定遗传，转化体系高效、稳定、可靠。
[0034] (3)制备方法简单，重现性强。
【专利附图】
【附图说明】
[0035] 图1为过表达盒结构示意图；
[0036] 图2为过表达盒各片段电泳图；从左到右依次是marker，Pgpd， prla，TTrpc，Pgpd+prla+TTrpc，Basta0
【具体实施方式】
[0037] 结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本 发明，并不对其内容进行限定。
[0038] 实施例1
[0039] 一株金龟子绿僵菌转基因菌株的制备方法：
[0040] 首先，根据GenBank上登录号为EU526905的类枯草蛋白酶Prla基因的序列，设计 PCR引物，引物序列如下：
[0041] 5' -aacatatgcatctgtctgctcttct-3'，如序列表中SEQ.ID.NO1 所不；
[0042] 5, -ggcctaggttaggcaccgttgtaggcaa-3,，如序列表中SEQ.ID.NO2 所示。
[0043] 根据上述引物序列，以金龟子绿僵菌（Metarhiziumanisopliae)菌株基因组DNA 为模板，扩增出Prla基因片段，片段长度为1378bp，序列片段如序列表中SEQ.ID.NO3所 示：
[0044] 其次,利用Pgpd作为强的启动子,TTrpC作为终止子,Basta作为筛选标记,利用融 合PCR的方法构建过表达盒，构建的过表达盒的结构示意图如图1所示。过表达盒中各片 段的电泳图如图2所示。
[0045] 过表达盒构建的具体方法为：利用融合PCR的原理，设计引物，在引物中添加接 头，具体引物如下：
[0046]Ml号引物：CGGAGAATATGGAGCTTCATCG，如序列表中SEQ.ID.NO4 所示；
[0047]M2 号引物：AGAAGAGCAGACAGATGCATGGGAAAAGAAAGAGAAAAGA，如序列表中SEQ. ID.NO5 所示；
[0048]M3 号引物：ATGCATCTGTCTGCTCTTCT，如序列表中SEQ.ID.NO6 所示；
[0049] M4 号引物：TTAGGCACCGTTGCCGTTGT，如序列表中SEQ. ID. NO7 所示；
[0050] M5号引物：ACAACGGCAACGGTGCCTAAGATCCACTTAACGTTACTGA，如序列表中SEQ. ID. NO 8所示；
[0051] M6号引物：CAGTTCTTCTCGGCGTTAACCCAGGGGCTGGTGACGG，如序列表中SEQ. ID. NO 9 所示；
[0052] M7 号引物：AACGCCGAGAAGAACTG，如序列表中SEQ. ID. NO 10所示；
[0053] M8号引物：ACAAGTGTACCTGTGCATTCTGGG，如序列表中SEQ. ID. NO 11所示；
[0054] M9号引物：GGCAGTAAGCGAAGGAGAAT，如序列表中SEQ. ID. NO12 所示；
[0055] MlO号引物：GTATTGGGTGTTACGGAGCA，如序列表中SEQ. ID. NO13 所示。
[0056] 通过Ml和M2号引物，M5和M6号引物，M7和M8号引物分别扩增出Pgpd启动子， TTrpC终止子和basta抗性基因（抗草胺膦），提取金龟子绿僵菌（中国普通微生物菌种保 藏管理中心保存，菌种编号3, 3676,在中国科学院微生物研究所可以购买得到）的染色体， 利用M3和M4号引物扩增出prla片段。
[0057] 利用KOD Fx酶将扩增出的Pgpd，prla，TTrpC这三个片段按摩尔比1 :3 :1的比例 加入到PCR的反应体系中融合。
[0058] PCR反应体系为：
【权利要求】
1. 一株金龟子绿僵菌转基因菌株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 根据GenBank上登录号为EU526905的类枯草蛋白酶Prla基因的序列，设计PCR引 物，引物序列如下： 5' -aacatatgcatctgtctgctcttct-3'，如序列表中 SEQ. ID. NO 1 所不； 5, -ggcctaggttaggcaccgttgtaggcaa-3,，如序列表中 SEQ. ID. NO 2 所示； 根据上述引物序列，以金龟子绿僵菌菌株基因组DNA为模板，扩增出Prla基因片段，序 列片段如序列表中SEQ. ID. NO 3所示； (2) 利用Pgpd作为强的启动子，TTrpC作为终止子，Basta作为筛选标记，利用融合PCR 的方法构建过表达盒。 (3) 采用二级培养法收集金龟子绿僵菌菌丝体，制备金龟子绿僵菌湿菌丝原生质体； (4) 将步骤（2)制备的过表达盒采用CaCl2-PEG介导法导入到步骤（3)制备的金龟子 绿僵菌原生质体中，将过表达盒随机插入金龟子绿僵菌基因组中，进行过表达； (5) 筛选分离basta抗性能够稳定遗传的金龟子绿僵菌重组菌株。
2. 如权利要求1所述的金龟子绿僵菌转基因菌株的制备方法，其特征在于，步骤（2) 中，用于扩增Pgpd启动子的引物序列为： Ml 号引物：CGGAGAATATGGAGCTTCATCG，如序列表中 SEQ. ID. NO 4 所示； M2 号引物：AGAAGAGCAGACAGATGCATGGGAAAAGAAAGAGAAAAGA，如序列表中 SEQ. ID. NO 5 所示； 用于扩增TTrpC终止子的引物序列为： M5 号引物：ACAACGGCAACGGTGCCTAAGATCCACTTAACGTTACTGA，如序列表中 SEQ. ID. NO 8 所示； M6 号引物：CAGITCTTCTCGGCGTTAACCCAGGGGCTGGTGACGG，如序列表中 SEQ. ID. NO 9 所 /_J、i 〇
3. 如权利要求1所述的金龟子绿僵菌转基因菌株的制备方法，其特征在于，步骤（2) 中，构建的过表达盒的全长序列如序列表中SEQ. ID. NO 15所示。
4. 如权利要求1所述的金龟子绿僵菌转基因菌株的制备方法，其特征在于，步骤（3) 中，金龟子绿僵菌原生质体的制备方法为：以0. 7mol/L的NaCI溶液作为渗透压稳定剂， 20mL原生质体Buffer，30°C酶解处理5小时。
5. 权利要求1至4任一项所述的方法制备的金龟子绿僵菌转基因菌株。
6. 权利要求5所述的金龟子绿僵菌转基因菌株在制备防治德国小蠊的生物防治材料 中的应用。
7. -种用于德国小蠊生物防治的菌剂，其特征在于，由权利要求1所述的金龟子绿僵 菌转基因菌株经固体发酵法制得。
8. 如权利要求7所述的用于德国小蠊生物防治的菌剂，其特征在于，发酵培养条件为： 发酵温度为26-28°C，初始pH值为5. 5-6. 5,发酵周期12-15天。
【文档编号】C12R1/645GK104357475SQ201410542584
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月14日 优先权日:2014年10月14日
【发明者】张凡, 廖慧萍, 张洁, 刘新, 祝金宝, 卢敏 申请人:山东师范大学