专利名称：一种杀虫绿僵菌菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物新菌株，具体涉及一种杀虫绿僵菌菌株及其应用，属于生物农药领域。
背景技术：
稻纵卷叶螟是水稻主要害虫之一，国内稻纵卷叶螟广泛分布于全国各稻区，严重的威胁着我国粮食生产。目前，主要施用广谱性化学农药控制稻纵卷叶螟，不仅直接影响人体健康和水产养殖业的安全，而且由于稻纵卷叶螟产生抗药性和化学农药大量杀伤稻纵卷叶螟天敌，破坏稻田生态平衡，严重削弱田间自然控制能力，容易导致稻纵卷叶螟的再猖獗、难以控制。昆虫病原真菌是最重要的杀虫微生物类群，在自然条件下约70%的昆虫病害是真菌引起的，是唯一具有触杀特性和流行性的病原微生物，其致病机制复杂，因而尽管它是最早应用于害虫防治的微生物，但是仍未发现有抗性害虫产生，对解决害虫的抗药性问题极具潜力。因此，真菌作为重要的替代农药，近年来受到广泛关注；国内对生防真菌的研究始于20世纪50年代，目前在杀虫真菌液固两相生产技术、制剂研发和规模化生产等方面处于国际领先地位。迄今为止，国内外先后登记注册杀虫真菌农药100多个。杀虫真菌具有较强的垂直和水平扩散能力，容易形成流行病，有助于害虫的持续控制，对于迁飞性害虫稻纵卷叶螟的控制尤为有利，但利用真菌控制稻纵卷叶螟尚未见到相关报道，其主要原因之一是缺乏高毒力杀虫真菌菌株。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对稻纵卷叶螟具有杀虫效果好、生产性状好的绿僵菌菌株 CQMa421。本发明菌株是通过采集自然感染的稻纵卷叶螟僵虫直接分离筛选出的一株生产性状好、对稻纵卷叶螟具有高毒力的金龟子绿僵菌小孢变种(Me tarhizium anisopliae var. miso/^iae)菌株CQMa421，已于2011年02月25日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，地址北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO. 4609。本发明绿僵菌菌株CQMa421接种在1/4SDA平板上，培养观察菌落形态特征， 显示在1/4SDA培养基上培养初期菌落呈白色棉絮状，产孢时橄榄绿色；菌丝具有分隔和分支、透明，直径为1. 5-2. OMffl ；分生孢子孢子梗单生或聚集或紧密排列，呈帚状分支，直径约为2. OMffl，其末端产生瓶形小梗，8-16 X 1. 5-2Mfli ；从瓶梗的末端以向基式连续形成串链的分生孢子，分生孢子单细胞，长椭圆形，大小4. 8-7 X 2-3 Mm。本发明绿僵菌菌株CQMa421具体如下的有益效果
本发明从自然感染的稻纵卷叶螟僵虫直接分离筛选的绿僵菌菌株CQMa421，产孢能力强、产孢率可达6. 8%、其生产性状好、生长迅速，同时杀虫活性强、杀虫效果好。利用该菌株
3生产的杀虫真菌制剂，有效地控制了稻纵卷叶螟种群数量。
图1 CQMa421菌株产孢结构与孢子形态大小；
图2 绿僵菌属OfeiarAiziws)的ITSl — 5. 8S — ITS2 rDNA区域分支系统树； 图3 CQMa421对稻纵卷叶螟杀虫活性测定结果； 图4 CQMa421对稻纵卷叶螟室外防治生测结果。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1 菌株的分离
将采集到的自然感染的稻纵卷叶螟僵虫用70%酒精表面消毒，放入培养箱中保湿培养3-5天，使其昆虫表面生长出新鲜孢子；在无菌条件下，用接种环挑取微量新鲜孢子在含有100微克/毫升氨苄青霉素的1/4SDA培养基平板上划线；将划线好的培养皿翻转放置于恒温箱中培养；3—4日后挑选长出的典型而无杂菌的菌落，在菌落边缘用移菌针挑取带有菌丝的培养基一小块，转入试管斜面培养基中央，28°C恒温培养10-15天。实施例2菌株的鉴定 (1)、形态鉴定
将分离到的CQMa421菌株接种在1/4SDA平板上，28°C培养观察菌落形态特征，产孢结构和孢子形状与大小。结果显示在1/4SDA培养基上培养初期菌落呈白色棉絮状，产孢时橄榄绿色。菌丝具分隔和分支，透明，直径为1.5-2. OMffl。分生孢子孢子梗单生或聚集或紧密排列，呈帚状分支，直径约为2. OMffl，其末端产生瓶形小梗，8-16 X1.5-2Mffl。从瓶梗的末端以向基式连续形成串链的分生孢子(参见图1中的左图)。分生孢子单细胞，长椭圆形，大小 4.8-7 X2-3 Mm (参见图1中的右图)。从以上特征看，菌株CQMa421应该为金龟子绿僵菌 ^""ife^ft Metarhizium anisopliae var. anisopliaeο(2)、CQMa421菌株的ITS序列扩增、序列测定及分子分类
将CQMa421在1/4SDAY液体培养基摇瓶培养3天(180rpmJ8°C)，离心(10000 g， 20min)收集菌丝，液氮研磨破碎后采用DNA提取试剂盒提取菌株CQMa421的总DNA。以总的DNA为模板，参照Curran扩增绿僵菌ITS1-5. 8S-ITS2 rDNA区域。所用引物为TW81 5‘ -gtttccgtaggtgaacctgc _3，和 AB28 5‘ -atatgcttaagttcagcgggt _3，，产生 547bp 扩增条带。PCR反应在PCR仪上的反应程序95°C 4min, 1个循环；94°C 0. 5min, 53°C 0. 5min， 72°C 0.5min，30循环；最后72°C IOmin0将扩增产物用凝胶回收试剂盒回收纯化，由上海生工进行双向脱氧法测序。CQMa421 ITS1-5. 8S-ITS2测序结果见SEQ ID No. 1。该序列与NCBI数据库中已之序列比对，符合预期长度，无与其序列相同的菌株。该序列5，端包含18S rDNA部分基因序列(1-34)，3，端包含部分^S rDNA基因序列 (504-549)，其余的分别为ITSl区域(35-167)，5. 8S rDNA基因全序列(168-3 )以及ITS2
4区域(327-519)。利用 MEGA v4. 1 (www.megasoftware.net)软件构建系统树(1000 次重复)证实CQMa421 W^kMetarhizium anisopliae·. anisopliae 金龟子绿僵菌小孢变种(图2所示)。
实施例3 CQMa421对稻纵卷叶螟室内杀虫活性的测定
收集在1/4SDA平板上培养的CQMa421成熟孢子，用0. 05% (W/V)吐温-80分散，配置成终浓度为IX IO8个孢子/ml的悬浮液。采用点滴法稻纵卷叶螟幼虫，每头试虫用微量点样器点滴药剂2 μ 1，接种30头，接种后在室温^°C，湿度50-70%的条件下饲养，设5个重复，以清水为空白对照。记录死虫数，计算存活率，经DPS2000软件统计分析得到真菌LT5tl (致死中时)和LT9tl (致死终时)。从图3可以看出，绿僵菌CQMa421菌株对稻纵卷叶螟有明显的杀虫活性。接种后 5-7天死亡高峰期，稻纵卷叶螟幼虫感病死亡后虫体僵硬，保湿培养3天后长出白色菌丝， 5-7天虫体长满绿色孢子。统计分析结果表明，其CQMa421菌株对稻纵卷叶螟幼虫的LT5tl (致死中时)和LT9tl (致死终时)分别为5. 3天和9. 1天。实施例4 CQMa421菌株产孢特性
将浓度为IX IO8个孢子/ml的CQMa421孢子悬浮液接种在1/4SDA平板上(100 μ 1/ 皿)，在不同温度(15°C，200C，240C ,26°C, 28°C，30°C，37°C )的培养条件下培养15天后测定单位面积上的产孢量，确定CQMa421菌株在条件下产孢最佳。分别配制pH为4. 5,5.0, 5. 5，6. 0，6. 5，7. 0，7. 5，8. 0，8. 5的1/4SDA平板，按上述方法测定产孢量，确定CQMa421菌株在pH为6. 5条件下产孢最佳。实施例5 CQMa421菌株固体发酵物料的优化
液体培养CQMa421菌丝作为发酵种子。固体发酵物料配置在培养固体物料大米或碎玉米或小麦中分别加入15%或20%或25%或30% (V/W)的营养液(pH 6.5)或水；营养液为1/4SDAY或1/8SDA或1/6SDA或1/32SDAY。拌勻后装入两端透气的聚丙烯袋袋中，121°C高压湿热灭菌30 min ；自然冷却后加入按培养物料与菌液=10 1的比例(W/V) 接种绿僵菌CQMa421菌液并拌勻均勻，置于^TC的发酵室中静止发酵15天后升温干燥 (30°C _34°C)，至物料含水量低于5%。随机抽取物料发酵样品，混勻后取5g左右的样品，放入装有20mL 0. 05%Tween-80的50ml三角瓶中，充分混勻后用血球计数板测定产品的含孢量，按200 X IO8个/g换算出固体发酵的产孢率。以产孢率为优化指标，最后确定CQMa421 的固体发酵物料配方为大米加入25% (V/W)的1/16SDA营养液(pH 6. 5)。实施例6 CQMa421菌株的室外防治效果
CQMa421接种在1/4SDAY平板上液体培养基摇瓶培养3天(180rpm，28 V )；将菌液接种在灭菌的大米上，拌勻后^TC下培养15天；收集孢子后用色拉油配制成终浓度为2 X 101° 个孢子/ml油悬浮剂。选择稻纵卷叶螟幼虫发生较重的稻田，随机选择4个IOmX IOm小区，间隔5米。 每个小区放置1个观测网罩(lmXaii，间距1米以上)，采集幼虫接种于网罩内(50-100头 /网罩)，24小时后采用泰山-18型机动喷雾器进行超低容量喷施CQMa421孢子油悬浮剂 QX IO13个孢子/公顷)。以喷施清水为空白对照。施药后每天调查网罩内虫情。根据室外生测结果表明施药后12天，绿僵菌CQMa421菌株对稻纵卷叶螟的防治效果达到90%以上(图4)。绿僵菌CQMa421菌株处理组的成虫数(/百丛)约为1. 5只，而对照组的成虫数(/百丛)达到13. 6只。实施例7 CQMa421菌株固体发酵产孢率
配制PH初始值为6.5的1/16SDA营养液，按25% (V/W)的比例加入大米中，拌勻后装入两端透气的聚丙烯袋中，121°C高压湿热灭菌30 min;自然冷却后按1:10 (菌液大米， V /W)比例接种绿僵菌CQMa421菌液并拌勻均勻，置于^TC的发酵室中静止发酵15天后升温干燥(30°C _34°C)，至物料含水量低于5%。随机抽取10袋发酵料，混勻后每袋混勻后各取5g左右的样品，放入装有20mL 0. 05%Tween-80的50ml三角瓶中，充分混勻后用血球计数板测定产品的含孢量，按200 X IO8个/g换算出固体发酵的产孢率。以清水代替1/16SDA 营养液设为对照。表1 CQMa421菌株固体发酵产孢率
固体培养物料_产孢率(％)显荖性检验(P=OiOl)
权利要求
1.一ft^iBliiliitt {Metarhizium anisopIiae var. anisopIiae) CQMa421, 1 ! j^f 为 CGMCC NO. 4609。
2.如权利要求1所述的绿僵菌菌株，其特征在于该菌株的适宜产孢温度为^TC,适宜产孢PH为6. 5。
3.如权利要求1所述菌株在对稻纵卷叶螟防治中的应用。
全文摘要
一种绿僵菌菌株(Metarhiziumanisopliaevar.anisopliae)CQMa421，保藏编号为CGMCCNO.4609，其在对稻纵卷叶螟防治中的应用。本发明菌株生产性状好、生长迅速，产孢能力强、产孢率可达6.8%，具有高毒力；从而利用该菌株生产的杀虫真菌制剂，有效地控制了稻纵卷叶螟种群数量。
文档编号C12N1/14GK102212483SQ20111010546
公开日2011年10月12日 申请日期2011年4月26日 优先权日2011年4月26日
发明者夏玉先, 彭国雄 申请人:重庆大学