专利名称：基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶及其制备方法和该弹性蛋白酶的医药用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体是一种基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶及其制备方法和该弹性蛋白酶的医药用途。
背景技术：
弹性蛋白酶(elastase)是炎症过程中由分叶核中性粒细胞(neutrophil granulocyte)分泌的一种蛋白酶，检测弹性蛋白酶的含量能帮助诊断前列腺及其他附性腺器官细菌性感染的状况。弹性蛋白酶作为丝氨酸蛋白家族的一个亚科，可以作用于弹性蛋白。人体内目前有6个基因可表达结构和功能相似的弹性蛋白酶。中性粒细胞分泌的弹性蛋白酶具有降解外源蛋白的功能，已有研究表明弹性蛋白酶可降解大肠杆菌的外膜蛋白A (ompA)，外膜蛋白A —般认为是沙门氏菌等细菌的毒力因子，所以，弹性蛋白酶的水解功能在抗外部感染途径中发挥一定的作用。弹性蛋白酶共有267个氨基酸，如图1所示，对弹性蛋白酶的功能域进行分析，发现第7-22个氨基酸表达一段具有透膜功能的蛋白，第29-242个氨基酸表达具有丝氨酸蛋白酶活性的功能蛋白，如图1所示。人中性粒细胞弹性蛋白酶(human neutrophil elastase, HNE)在机体各种炎症反应、组织损伤重构(如肺炎)、成人呼吸窘迫综合征、肺纤维化、急(慢)性肺损伤、肺水肿、 动脉粥样硬化、硬皮病等病理过程中起重要作用，并且具有阻止病毒、细菌的侵入及癌细胞转移的功能。弹性蛋白酶作为前列腺炎鉴别诊断的指标依照美国国立卫生研究所标准，前列腺液白细胞计数被认为是诊断前列腺炎的主要指标，检测弹性蛋白酶可能对区别前列腺炎引起的炎症性骨盆疼痛症和由泌尿生殖器植物神经紊乱引起的非炎症性骨盆疼痛有帮助。以人中性粒细胞弹性蛋白酶为抗原，制备相应的抗体，用于诊断前列腺及其他附性腺器官细菌性感染，检测弹性蛋白酶的含量。但是，从人体获得中性粒细胞弹性蛋白酶的来源受限，远不能满足临床和试验检测的需要。
发明内容
本发明就是为了解决以人中性粒细胞弹性蛋白酶为抗原制备特异性抗体来源受限的问题，提供一种基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶及其制备方法和该弹性蛋白酶的医药用途。本发明是按照以下技术方案设计的。一种基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶，用BamHI和HindIII酶切构建弹性蛋白酶的表达质粒PET-28a-ELA2，如图2所示；该弹性蛋白酶的核酸序列如SEQUENCE LISTING 所示。
所述基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶，该弹性蛋白酶具有天然人中性粒细胞弹性蛋白酶的免疫原性。所述基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶的制备方法，其人中性粒细胞的裂解液， 取含有基因组DNA的上清液，用PCR方法扩增，获得中性粒细胞弹性蛋白酶的基因片段 ELA2，构建克隆质粒后转化大肠杆菌T0P10的感受态细胞，提取质粒DNA，构建弹性蛋白酶的PET-28a-ELA2表达质粒，并在大肠杆菌中的表达弹性蛋白酶，收集菌体，超声裂解菌液， 镍柱洗脱纯化后获得弹性蛋白酶。所述重组人中性粒细胞弹性蛋白酶的制备方法，其PCR方法扩增引物 Primerl 5’ _ agctgcgcgg aggccacttc_3’
Primer2 5’ -gga gccgt cacca 已ggctca_3’0所述基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶的制备方法，其PCR扩增的条件为94°C 变性50秒，55°C退火1分钟，72度延伸3分钟，共循环30次，最后72度保温10分钟。所述基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶的制备方法，其重组质粒PET-28a_ELA2 在大肠杆菌中表达，将含有重组质粒PET-28a-ELA2的大肠杆菌接种在含卡那霉素的IOml LB培养基中，37°C培养过夜；将所得菌液接种到含卡那霉素的1000ml LB培养基中，在37°C 培养约4h，使其A65tl OD值到0. 6-0. 8时，向菌液中加入异丙基硫化半乳糖苷，使其终浓度为 0. 5mM，继续培养6-8小时；收集菌体后制备超声裂解菌液。所述基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶的制备方法，其纯化弹性蛋白酶是将是将超声裂解菌液在12，000转/分，41离心IOmin后，将沉淀悬浮于由8M尿素、IOmM Tris, ρΗ8· 0制备的基础缓冲液30ml中；12, 000转/分，4°C离心lOmin，取上清液，使用300mM的 NaCl的洗脱浓度获得纯化的基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶。所述基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶作为特异性抗体的抗原，在制备高效抗体临床诊断试剂中的应用。这样设计的本发明，利用弹性蛋白酶的表达基因，获得足量稳定的基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶，为临床检测和试验研究弹性蛋白酶提供原料，为制备高效抗体提供特异性抗原。
图1是弹性蛋白酶类胰蛋白酶的丝氨酸蛋白酶功能域(Tryp_SPc)图； 图2是PET-28a-ELA2质粒图3是表达的弹性蛋白酶SDS-PAGE电泳图； 图4是纯化的弹性蛋白酶SDS-PAGE电泳图5是纯化的弹性蛋白酶具有天然人中性粒细胞弹性蛋白酶免疫原性的 western-blot 图。
具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明进行详细的说明。一.人中性粒细胞弹性蛋白酶的基因获得
1.使用人中性粒细胞的裂解液1ml，离心，12，000转/分，5分钟，取含有基因组DNA的上清液为模板，进行PCR扩增。使用一对引物是
Primerl 5’ _ agctgcgcgg aggccacttc_3’ Primer2 5’ -gga gccgt cacca aggctca-S' 2.以基因组DNA为模板，PCR扩增的条件为 94°C变性50秒 55°C退火1分钟 72度延伸3分钟，
共循环30次，最后72度保温10分钟。3. PCR产物经1%琼脂糖电泳确证得到目标基因后，用酚氯仿抽提回收。二.构建人中性粒细胞弹性蛋白酶基因的克隆质粒
1.将PCR产物用胶回收纯化；
2.将A-T克隆载体(如pUCm-T载体等)和PCR产物连接，连接反应体系如下
权利要求
1.一种基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶，其特征在于用BamHI和HindIII酶切质粒DNA构建弹性蛋白酶的表达质粒PET-28a-ELA2，如图2所示；该弹性蛋白酶的核酸序列如图6所示。
2.根据权利要求1所述基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶，其特征在于该弹性蛋白酶具有天然人中性粒细胞弹性蛋白酶的免疫原性。
3.如权利要求1所述基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶的制备方法，其特征在于人中性粒细胞的裂解液，取含有基因组DNA的上清液，用PCR方法扩增，获得中性粒细胞弹性蛋白酶的基因片段ELA2，构建克隆质粒后转化大肠杆菌T0P10的感受态细胞，提取质粒 DNA，构建弹性蛋白酶的PET-28a-ELA2表达质粒，并在大肠杆菌中的表达弹性蛋白酶，收集菌体，超声裂解菌液，镍柱洗脱纯化后获得弹性蛋白酶。
4.根据权利要求3所述基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶的制备方法，其特征在于 PCR方法扩增引物Primerl 5’ _ agctgcgcgg aggccacttc_3’Primer2 5’ -gga gccgt cacca 已ggctca_3’0
5.根据权利要求3所述基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶的制备方法，其特征在于 PCR扩增的条件为94°C变性50秒，55°C退火1分钟，72度延伸3分钟，共循环30次，最后 72度保温10分钟。
6.根据权利要求3所述基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶的制备方法，其特征在于 重组质粒PET-28a-ELA2在大肠杆菌中表达，是含有重组质粒PET-28a_ELA2的大肠杆菌接种在含卡那霉素的IOml LB培养基中，37°C培养过夜；将所得菌液接种到含卡那霉素的 1000ml LB培养基中，在37°C培养约4h，使其A650 OD值到0. 6-0. 8时，向菌液中加入异丙基硫化半乳糖苷，使其终浓度为0. 5mM,继续培养6-8小时；收集菌体后制备超声裂解菌液。
7.根据权利要求3所述基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶的制备方法，其特征在于 纯化弹性蛋白酶是将超声裂解菌液在12，000转/分，4°C离心IOmin后，将沉淀悬浮于由8M 尿素、IOmM Tris，pH8. 0制备的基础缓冲液30ml中；12，000转/分，4°C离心lOmin，取上清液，使用300mM的NaCl的洗脱浓度获得纯化的基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶。
8.根据权利要求1所述基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶在制备弹性蛋白酶特异性抗体临床诊断试剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶及其制备方法和该弹性蛋白酶的医药用途，属于基因工程领域。本发明利用人中性粒细胞裂解液，取含有基因组DNA的上清液，扩增获得中性粒细胞弹性蛋白酶的基因片段ELA2，连接克隆质粒转化大肠杆菌，构建弹性蛋白酶的PET-28a-ELA2表达质粒，在大肠杆菌中表达弹性蛋白酶，收集菌体，超声裂解菌液，镍柱洗脱后获得纯化的弹性蛋白酶。这样设计的本发明，利用弹性蛋白酶的表达基因，获得足量稳定的基因重组人中性粒细胞弹性蛋白酶，为临床检测和试验研究提供弹性蛋白酶原料，并为制备弹性蛋白酶高效抗体提供特异性抗原。
文档编号C12N15/70GK102250863SQ201110163759
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月17日 优先权日2011年4月29日
发明者张楷, 阎智慧 申请人:天津金斯坦生物科技有限公司