专利名称：鸭疫里默氏菌用培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物领域，特别涉及鸭疫里默氏菌用培养基。
背景技术：
鸭疫里默氏菌病(Riemerella anatipestifer infection)是家鸭、火鸡和多种其它禽类的一种接触传染性疾病，也称为新鸭病、鸭败血症、鸭疫综合症、鸭疫巴氏杆菌病和鸭传染性浆膜炎。该病呈世界范围分布，几乎已在所有的集约化养鸭生产的国家发现，是目前危害世界各国养鸭业最为严重的传染病之一。鸭疫里默氏菌病呈急性或慢性败血症过程，病理变化主要是纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎。广8周龄鸭高度敏感，恶劣的环境条件或并发感染可促发该病。该病的发病率和死亡率都很高，死亡率最高可达759Γ100% ；部分感染鸭消瘦，生长发育迟缓；慢性耐过鸭有神经症状，可导致残鸭和僵鸭，淘汰率高，给养鸭业造成了巨大的经济损失。该病在我国已呈漫延之势，已经严重阻碍了我国养鸭业的发展。关于鸭疫里默氏菌病的诊断，已建立了许多方法。BIOLOG微生物自动鉴定系统是BIOLOG公司研制开发的新型自动化快速微生物鉴定系统，其通过在鉴定板上使用95种碳源进行试验，微生物利用碳源进行呼吸，将四唑类氧化还原染色剂，从无色还原成紫色， 从而在微生物鉴定板上形成微生物特征性的反应模式或指纹，通过光学读数设备根据光密度的吸收值的差异，来读取颜色变化，再将此指纹与数据库相比较，确定微生物的属名或种名。该系统操作标准化，简便快捷，其菌种数据库大、自动化程度高。BIOLOG微生物自动鉴定系统数据库包括鸭疫里默氏菌，因此可利用该系统对鸭疫里默氏菌病进行快速鉴定。由于该鉴定系统涉及本病病原鸭疫里默氏菌的培养，但鸭疫里默氏菌的培养条件苛刻，在体外培养需要较高的营养条件，通常需要加入血液进行培养，特别是在生产中初次分离病原菌。BIOLOG微生物自动鉴定系统操作要求须使用与该鉴定系统配套专用培养基BUG以及添加新鲜脱纤维绵羊血。一方面配套专用培养基依赖于进口， 购买耗时长，价格高，另一方面制备新鲜脱纤维绵羊血操作易污染，部分地区尚不能提供绵羊，这些限制了 BIOLOG微生物自动鉴定系统的应用。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种培养基添加剂，该添加剂可以用于替代BIOLOG 微生物自动鉴定系统中新鲜脱纤维绵羊血。为实现上述方案，本发明的技术方案为
培养基添加剂，所述培养基添加剂由非疫区健康鸭心脏或颈动脉来源的血液和抗凝剂组成。进一步，所述抗凝剂为浓度为3、g/L的柠檬酸钠； 进一步，所述抗凝剂为浓度为8(T150 mg/L的肝素钠；
本发明的目的之二在于提供一种培养基，该培养基可以用于鸭疫里默氏菌的培养，且生产成本低。为实现上述方案，本发明的技术方案为
含有所述的培养基添加剂的培养基，由基础培养基和培养基添加剂组成，所述培养基中含有质量分数为5 8%的培养基添加剂。进一步，所述基础培养基按重量千分比由以下成分组成 胰蛋白胨 15 17%。
大豆胨Γ7 0Z00
酵母提取物 4飞％。 NaCl5 6%0
琼脂15 20%。
余量为水，所述基础培养基的PH值为7. 2^7. 4。本发明的目的之三在于提供含有培养基添加剂的培养基的应用，该应用为分离和鉴定鸭疫里默氏菌提供了新思路。为实现上述目的，本发明的技术方案为
所述的含有培养基添加剂的培养基在分离或鉴定鸭疫里默氏菌中的应用。进一步，所述应用为所述的含有培养基添加剂的培养基在BIOLOG微生物鉴定系统中制备分离或鉴定鸭疫里默氏菌培养基的应用。本发明的有益效果在于由于本发明的鸭疫里默氏菌培养基采用多种成分的基础培养基和添加抗凝剂的鸭全血作为添加物，可应用于鸭疫里默氏菌的常规分离鉴定以及商业化的BIOLOG鉴定系统，克服了配套专用培养基依赖于进口的缺点，同时，因避免了常规的抽血需脱纤维操作步骤，在培养基制备过程中能减少杂菌污染，降低培养基成本。
图1为鸭疫里默氏菌在RCAD培养基菌落形态(整个平板)； 图2为鸭疫里默氏菌在RCAD培养基菌落形态(局部)；
图3为疫里默氏菌ATCC11845在BIOLOG微生物鉴定系统中指纹图谱； 图4为鸭疫里默氏菌ATCC11845在BIOLOG鉴定板中的颜色反应(24h)； 图5为鸭疫里默氏菌ATCCl 1845在BIOLOG微生物鉴定系统中读数结果截图。
具体实施例方式实施例1体积分数为5%的含有培养基添加剂的培养基
胰蛋白胨15 g、大豆胨5g、酵母提取物5 g、NaCl 5 g，溶于900mL蒸馏水，煮沸彻底溶解，冷却至室温(25°C);再称取琼脂20 g，加入前述溶液并补加蒸馏水至总体积1000 ml，混勻后121°C灭菌15 min，冷却至45 50°C时将所述添加物按体积比加入50ml含抗凝剂的鸭全血，倾倒平板。凝固后，倒置于37°C恒温箱24h，无菌检验后即得，其pH值为7. 2。添加物为采用心脏抽血或颈动脉放血的方法无菌采取非疫区健康鸭血，其中含抗凝剂80mg/L ( 80 150 mg/L均可)，于_20°C冻存，使用前解冻。实施例2体积分数为8%的含有培养基添加剂的培养基
胰蛋白胨15 g、大豆胨5g、酵母提取物5 g、NaCl 5 g，溶于850mL蒸馏水，煮沸彻底溶解，冷却至室温(25°C);再称取琼脂20 g，加入前述溶液并补加蒸馏水至总体积1000 ml，混勻后121°C灭菌15 min，冷却至45 50°C时将所述添加物按体积比加入80ml含抗凝剂的鸭全血，倾倒平板。凝固后，倒置于37°C恒温箱24h，无菌检验后即得，其pH值为7.4。添加物为采用心脏抽血或颈动脉放血的方法无菌采取非疫区健康鸭血，其中含抗凝剂柠檬酸钠3g/L (3-5g/L均可)，于-20°C冻存，使用前解冻。实施例3含有培养基添加剂的培养基的应用一材料
1菌株
鸭疫里默氏菌模式菌株ATCC11845，购自美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)，12株鸭疫里默氏菌供试菌株，四川农业大学动物疫病与人类健康四川省重点实验室提供。2 试剂
胰蛋白胨、大豆胨、酵母提取物购自BD公司，琼脂购自Biowest公司、BUG+B购自 BIOLOG公司，聚醚F-68和吉冷胶(Gellan Gum)购自Sigma公司，NaCl为国产分析纯，脱纤维绵羊血为自制。3其它耗材
鉴定板、浊度标准管(28%T，管规格为20Χ 150 mm)、V型加样槽均购自BIOLOG公司。4培养基及接种液
4. 1 BUG+B培养基(IOOOmL)的制备
称取57 g BUG培养基，加入900 ml蒸馏水，煮沸溶解，冷却至室温(25°C)后调整pH值至7. 4。121°C灭菌15分钟，冷却至45飞0°C，加50mL新鲜的脱纤维羊血，摇勻，倾倒平板。 凝固后，倒置于37°C恒温箱24h，无菌检验后即得BUG+B成品培养基。4. 2合成培养基配方采用实施例2所列配方制备。4. 3接种液制备
加0. 2g吉冷胶至1升蒸馏水中，煮沸并持续搅拌，直至吉冷胶完全溶解；加4g NaCl, 搅拌至完全溶解；加0. 3g聚醚F-68，搅拌至完全溶解；分装到20 χ 150mm的试管中，每管装19mL ;121°C灭菌30 min。冷却后备用。5 方法 5.1细菌培养
将保存的菌株活化后，接种按上述方法制备好的培养基，37°C烛缸培养24小时。5. 2菌悬液制备及微平板接种培养
用无菌棉签蘸生理盐水湿润后轻轻擦下培养基上的菌落，转入制备好的接种液，混勻得到菌悬液，调整其浊度，控制在25%浊度标准的士5%以内，接种培养用8孔自动移液器将菌悬液加入GN2鉴定板中，每孔150 μ 1，共96孔，盖上鉴定板盖，置37°C培养箱湿盒培养。5. 3微平板读数
打开BIOLOG鉴定系统的应用程序，初始化后，放入鉴定板，选择合适的参数，自动读数并判定结果。培养4飞h后读一次，如果此次读数没有结果，培养至16 24小时后再读取结
6 结果
6.1细菌培养结果
在含有培养基添加剂的培养基培养基上生长良好，培养24小时菌落呈圆形，凸起、边缘整齐、透明、有光泽的奶油状、无色素的光滑型菌落(附图1和2)。6.2两种不同培养基的BIOLOG鉴定结果
1 MOL<>3徵生《 薹定系统鉴定结果
使用所述含有培养基添加剂的培养基及BIOLOG微生物鉴定系统配套专用培养基的能够对鸭疫里默氏菌进行准确鉴定。
6.3培养基成本核算
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
权利要求
1.培养基添加剂，其特征在于所述培养基添加剂由非疫区健康鸭心脏或颈动脉来源的血液和抗凝剂组成。
2.根据权利要求1所述的培养基添加剂，其特征在于所述抗凝剂为浓度为3、g/L的柠檬酸钠。
3.根据权利要求1所述的培养基添加剂，其特征在于所述抗凝剂为浓度为8(Γ150 mg/L的肝素钠。
4.含有权利要求广3中的任一项所述的培养基添加剂的培养基，由基础培养基和培养基添加剂组成，其特征在于所述培养基中含有体积分数为5 8%的培养基添加剂。
5.根据权利要求4所述的含有培养基添加剂的培养基，其特征在于，所述基础培养基按重量千分比由以下成分组成胰蛋白胨 15 17%。大豆胨Γ7 0Z00酵母提取物 4飞％。NaCl5 6%0琼脂15 20%。余量为水，所述基础培养基的PH值为7. 2^7. 4。
6.权利要求4或5所述的含有培养基添加剂的培养基在分离或鉴定鸭疫里默氏菌中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述应用为所述的含有培养基添加剂的培养基在BIOLOG微生物鉴定系统中制备分离或鉴定鸭疫里默氏菌培养基的应用。
全文摘要
本发明涉及微生物领域，特别涉及鸭疫里默氏菌用培养基，所述培养基包括基础培养基和培养基添加剂两部分，所述基础培养基按千分比由以下成分组成胰蛋白胨15~17‰，大豆胨4~7‰，酵母提取物4~6‰，NaCl5~6‰，琼脂15~20‰及余量的水；所述的含有培养基添加剂的培养基在分离或鉴定鸭疫里默氏菌中的应用；由于本发明的鸭疫里默氏菌培养基采用多种成分的基础培养基和添加抗凝剂的鸭全血作为添加物，可应用于鸭疫里默氏菌的常规分离鉴定以及商业化的BIOLOG鉴定系统，克服了配套专用培养基依赖于进口的缺点，同时在培养基制备过程中能减少杂菌污染，降低培养基成本。
文档编号C12N1/20GK102250792SQ20111016374
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月17日 优先权日2011年6月17日
发明者朱德康, 汪铭书, 程安春, 陈孝跃 申请人:四川农业大学