专利名称：OsMIOX蛋白及其编码基因与抗旱应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及一种OsMIOX蛋白及其编码基因与抗旱应用。
背景技术：
随着全球性水资源贫乏问题日趋严重，干旱缺水给粮食生产造成严重威胁。众所周知，我国是世界最缺水的13个国家之一，现人均水资源拥有量2400立方，仅为世界人均水平的1/4，并且分布极不均匀，特别是华北地区常遭遇干旱，南方地区也有“伏旱”和“夹秋旱”等现象发生，严重影响了我国稻作生产。水稻是我国和世界上的主要粮食作物之一，是我国60%以上人口的主粮。据统计，水稻用水占农业用水的70%左右，我国水稻栽培面积从1997年以来持续缩减，并且每年还有2千多万亩水稻受旱，甚至还有上千万亩水稻无法种植。因此培育抗旱水稻品种以达到高产稳产的目的将成为解决粮食问题的重要途径。众所周知，利用传统育种方法培育抗旱水稻品种周期长、偶然性大，所培育的品种不稳定，进展比较缓慢；而利用基因工程技术可以直接在基因水平上改造植物的遗传背景，定向改造植物的遗传性状。外源基因的转入丰富了基因资源，弥补了常规育种方法的不足，是抗旱品种选育的有效途径之一。到目前为止，利用转基因技术获得的转基因抗旱植物已有数十种。这类基因按照功能可以分为两类，第一类是功能基因1)增加植物渗透性代谢产物合成能力，使植物在水分胁迫下能合成更多的渗透调节物质(如脯氨酸、甜菜碱、海藻糖、甘露醇、多胺类等)，以提高植物的渗透调节能力，从而增强植物的抗旱性；2)增强植物对活性氧自由基的清除能力，使植物在水分胁迫下增强一些关键酶的活性(如SOD，POD，CAT等)，可以有效地排除有害的活性氧自由基，从而提闻细胞耐脱水的能力；3) LEA等抗旱相关蛋白基因；另一类是调节基因，如DREB类转录因子，MYB类转录因子，NAC基因家族等，这类基因可以在逆境信号转导中发挥作用，迅速传递信息让植物在逆境中作出反应来抵抗恶劣环境。利用转基因技术将不同功能基因转入水稻，获得抗旱性转基因植株，已取得了一定的研究进展。P5CS基因编码脯氨酸合成酶，是合成脯氨酸的关键基因。在水稻中胁迫诱导和组成型超表达P5CS基因，高盐和水分胁迫条件下，转基因植株的脯氨酸含量比对照明显提高，根和芽生长速率提高，表现出抗旱性；Zhu等(1997)利用ABA或逆境诱导的特异启动子超表达P5CS基因，在逆境胁迫条件下，转基因植株的脯氨酸含量比对照提高I. 5倍，根和茎的鲜重增加，生物产量也增加。ADC基因编码燕麦精氨酸脱羧酶，是多胺合成的关键基因。水稻中组成型表达ADC基因，在干旱条件下，转基因植株的叶绿素含量明显高于对照，抗旱性明显提高。Xiao等(2007)将0sLEA3-l基因转入水稻，与对照相比转基因水稻不但提高了抗旱性，而且也提高了田间产量。Hu等(2006)同源克隆了 SNACl基因并将其转入水稻，苗期进行干旱、高盐处理，表现出相对较高的抗旱、耐盐性，开花期在田间进行重度干旱处理，转基因后代结实率比对照提高了 22-34% Jeong等(2010)将水稻NAC家族中的另一个转录因子OsNACIO转入水稻，在水稻中组成型和根特异超表达该基因，苗期均表现抗旱性，在田间干旱条件下，根特异超表达的转基因后代单株产量比对照提高了 25-42%。到目前为止，虽然只有三个水稻转基因材料在田间表现出抗旱性且产量提高，但其它抗旱转基因材料的获得丰富了抗旱育种资源，为抗旱育种工作带来希望。因此，为了使抗旱育种工作取得突破性进展，需要不断发现新抗旱基因并获得新的抗旱转基因材料，从而最终解决干旱引发的粮食危机。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种OsMIOX蛋白及其编码基因。本发明提供蛋白，名称为OsMIOX，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由(a)衍生的蛋白质。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。序列表中的序列2由308个氨基酸残基组成。编码所述蛋白的基因也属于本发明的保护范围。所述基因是如下⑴或⑵或(3)的DNA分子(I)序列表中序列I所示的DNA分子；(2)在严格条件下与(I)限定的DNA序列杂交且编码与植物耐逆性相关蛋白的DNA分子；(3)与(I)限定的DNA分子序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码与植物耐逆性相关蛋白的DNA分子。所述严格条件为在6XSSC，0. 5% SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2XSSC，
O.I % SDS 和 I X SSC, O. I % SDS 各洗膜一次。序列表中的序列I由1288个核苷酸组成。含有所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。所述重组载体是将所述基因插入PMDC32载体Asc I和Pac I识别位点间得到的
重组载体。扩增所述基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围；所述引物对中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列3，所述弓I物对中的另一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列4。本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。本发明提供的方法，是将所述基因导入目的植物中，得到耐逆性高于所述目的植物的转基因植物。所述基因通过所述重组载体导入所述目的植物中。所述耐逆性为耐旱性。
所述耐旱性通过增强CAT活性、增强POD酶活性和/或提高脯氨酸含量体现。所述目的植物为双子叶或单子叶植物；所述单子叶植物具体为水稻。本发明的实验证明，本发明通过超表达OsMIOX基因，获得了耐旱转基因水稻，其CAT活性、POD酶活性和脯氨酸含量均高于未转入OsMIOX基因的野生型水稻，为抗旱品种的选育提供了一个新材料，丰富了抗旱育种资源，加速了育种速度，具有操作简单，周期短的优点。本研究获得的抗旱转基因水稻为抗旱育种工作提供了一个新资源。
图I为转基因水稻的PCR鉴定图2为转基因水稻的RT-PCR鉴定图3为甘露醇处理及复水后转基因后代表型变化图4为处理前后转基因后代CAT和POD酶活性变化图5为处理前后转基因后代脯氨酸含量变化
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I、基因的获得OsMIOX利用软件primer 5. 0，依据OsMIOX cDNA序列设计引物MIOXF和MI0XR，以旱稻材料 IRAT109 (Comparison of gene expression between upland and lowland ricecultivars under water stress using cDNA microarray ；HaiRuanR ffanR, HonRl ianRZhang, FenRhua Gao， Junxia Li and Zichao Li (Theoretical and Applied Genetics ；115(8) :1109-1126, 2007，公众可从中国农业大学获得。)cDNA为模板进行PCR扩增。超表达引物MI0XF5’ A GGCGCGCC GATGACCATCACCATTG 3’ (Asc I，序列 3)MIOXR 5，G TTAATTAA TCACCATCTCAACTTGG 3，(Pac I，序列 4)PCR体系如下
权利要求
1.一种蛋白，是如下(a)或(b) (a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由(a)衍生的蛋白质。
2.编码权利要求I所述蛋白的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下⑴或(2)或(3)的DNA分子 (1)序列表中序列I所不的DNA分子； (2)在严格条件下与(I)限定的DNA序列杂交且编码与植物耐逆性相关蛋白的DNA分子； (3)与(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码与植物耐逆性相关蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于所述重组载体是将权利要求2或3所述基因插入PMDC32载体的多克隆位点得到的重组载体。
6.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入目的植物中，得到耐逆性高于所述目的植物的转基因植物。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于权利要求2或3所述基因通过权利要求5所述重组载体导入所述目的植物中。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于所述耐逆性为耐旱性。
9.如权利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于所述耐旱性通过增强CAT活性、增强POD酶活性和/或提高脯氨酸含量体现。
10.如权利要求6-9中任一所述的方法，其特征在于 所述目的植物为双子叶或单子叶植物。
全文摘要
本发明公开了一种OsMIOX蛋白及其编码基因与抗旱应用。本发明提供了一种蛋白，名称为OsMIOX，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由(a)衍生的蛋白质。本发明的实验证明，本发明通过超表达OsMIOX基因，获得了耐旱转基因水稻，其CAT活性、POD酶活性和脯氨酸含量均高于未转入OsMIOX基因的野生型水稻，为抗旱品种的选育提供了一个新材料。
文档编号C12N15/63GK102827262SQ20111016349
公开日2012年12月19日 申请日期2011年6月17日 优先权日2011年6月17日
发明者李自超, 段俊枝, 李金杰, 张洪亮 申请人:中国农业大学