专利名称：一种鉴定耐盐棉花的方法及专用ssr标记的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种鉴定耐盐棉花的方法及专用SSR标记。
背景技术：
棉花的耐盐性是一个十分复杂的性状，涉及多种生理生化代谢途径和诸多基因调控，不但受棉花自身遗传因素影响，还受外界环境条件和栽培措施的影响，而且各栽培种之间、品种之间及同一品种的不同生育阶段、不同组织器官之间耐盐性都存在较大的差异，很可能存在多种不同的耐盐机制，至今尚未形成统一认识，在很多领域尚存在不同看法和争论。棉花耐盐性的复杂给耐盐品种的选育和鉴定带来极大困难。若能筛选到几个与棉花耐盐有关的标记，直接从分子水平上对棉花的耐盐性进行鉴定评价，将是棉花耐盐性鉴定方法的一大突破。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于辅助鉴定耐盐棉花的引物组合物。本发明所提供的用于辅助鉴定耐盐棉花的引物组合物，为如下中任意一种(1)HAU1918、HAU1058 和 TMB1288(2)HAU1918、NAU1085 和 HAU773(3)HAU1918、HAU1058 和 NAU1085(4)HAU1918、HAU1058 和 TMB1288(5) HAU1918, HAU1058, HAU773 和 NAU1085(6) HAU1918, NAU1085, HAU773 和 TMB1288(7) HAU1918, HAU1058, NAU1085 和 TMB1288(8) HAU1918, HAU1058, HAU773, NAU1085 和 TMB1288(9)HAU1918 和 TMB1288(10)NAU1085 和 TMB1288(11)HAU773 和 TMB1288(12)HAU1058 和 TMB1288 ；所述HAU1918的一条引物序列如SEQ ID NO :3所示，另一条引物序列如SEQ ID NO 4所示；所述HAU1058的一条引物序列如SEQ ID NO :5所示，另一条引物序列如SEQ IDNO 6所示；所述TMB1288的一条引物序列如SEQ ID NO 1所示，另一条引物序列如SEQ ID NO :2所示；所述NAU1085的一条引物序列如SEQ ID NO :7所示，另一条引物序列如SEQ IDNO 8所示；所述HAU773的一条引物序列如SEQ ID NO :9所示，另一条引物序列如SEQ ID NO:10所示。上述引物组合物在辅助鉴定耐盐棉花中的应用也属于本发明的保护范围。本发明的另一个目的是提供第一种辅助鉴定耐盐棉花的方法。本发明所提供的辅助鉴定耐盐棉花的方法，包括如下步骤分别用上述引物组合物中的每对引物对待测棉花单株进行PCR扩增，获得PCR扩增产物，对所述PCR扩增产物进行检测，根据如下方法确认所述待测棉花单株为耐盐棉花还是盐敏感棉花若所述引物组合物对应的所有PCR扩增产物中含有耐盐特征带T且无敏盐特征带 Si，则确认所述待测棉花单株候选为耐盐棉花；若所述引物组合物对应的所有PCR扩增产物中含有敏盐特征带Si，则确认所述待测棉花候选为盐敏感棉花；若所述引物组合物对应的所有PCR扩增产物中不含有敏盐特征带Sl也不含有任何耐盐特征带T，则确认所述待测棉花候选为盐敏感棉花；所述敏盐特征带Sl为60bp的DNA ；所述耐盐特征带T为T4、T3A、T3B、T5和T2中的至少一种；所述T4为210bp的DNA ；所述T3A为^Obp的DNA ；所述BB为MObp的DNA ；所述 T5 为 220bp 的 DNA ；所述 T2 为 160bp 的 DNA。上述第一种鉴定方法中，所述PCR扩增的体系由10XPCR buffer、dNTP、Taq DNA 聚合酶、SSR标记中的一条DNA分子、SSR标记中的另一条DNA分子和模板DNA组成；dNTP 在体系中的浓度为0. 2mmol/L,Taq DNA聚合酶在体系中的浓度为0. 05U/μ 1，SSR标记中的一条DNA分子在体系中的浓度为0. 5μπι01/1，SSR标记中的另一条DNA分子在体系中的浓度为0. 5 μ mol/1，模板DNA在体系中的浓度为5. Ong/ μ 1。上述第一种鉴定方法中，所述对所述PCR扩增产物进行检测的方法为测序或非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。本发明的另一个目的是提供另一种辅助鉴定耐盐棉花的方法。本发明所提供的另一种辅助鉴定耐盐棉花的方法，包括如下步骤取待测棉花的15个单株，按照上述第一种鉴定方法对每株棉花进行检测，若15个单株中有8株以上被鉴定为耐盐棉花，则确认所述待测棉花候选为耐盐棉花；若15个单株中有7株以下被鉴定为盐敏感棉花，则确认所述待测棉花候选为盐敏感棉花。上述另一种鉴定方法中，所述待测棉花为棉花常规种或棉花杂交种。上述任一所述鉴定方法在耐盐棉花品种的选育中的应用也属于本发明的保护范围。上述任一所述鉴定方法在棉花的遗传育种中的应用也属于本发明的保护范围。实验证明，本发明的鉴定方法结果稳定可靠、操作简单、经济高效，相比形态学鉴定法具有高效准确、省时省力、不受季节限制等优点，展示了较好的应用前景，更好地服务于生产实践中棉花耐盐性的鉴定和评价。因此，本发明SSR标记组合物及耐盐棉花鉴定方法在棉花的耐盐性鉴定领域将有广阔的应用前景，对其它相关作物的耐盐性鉴定研究具有借鉴作用。
图1为以4个材料的DNA为模板进行的SSR引物筛选(从左至右每4个样品为同一引物的扩增)。图2为CSHES149对48份种质资源的扩增图谱。图3为HAU773对48份种质资源的扩增图谱。图4为HAU1058对48份种质资源的扩增图谱。图5为HAU1918对48份种质资源的扩增图谱。图6为NAU1085对48份种质资源的扩增图谱。图7为TMB1288对48份种质资源的扩增图谱。图8为HAU1918对11份鉴定材料的扩增图谱。图9为HAU1058对11份鉴定材料的扩增图谱。图10为TMB1288对11份鉴定材料的扩增图谱。图11为HAU1918、HAU1058和TMB1288对J2的15个单株的扩增图谱。图12为HAU1918、HAU1058和TMB1288对J7的15个单株的扩增图谱。图13为HAU1918、HAU1058和TMB1288对J8的15个单株的扩增图谱。 图14为PCT扩增反应程序。图中，“V”标出了耐盐和敏盐特征带。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。如下各个实施例中，用标记进行PCR扩增和检测的步骤如下1.棉花育苗。随机选取约30粒供鉴材料的种子，均勻撒播于装有普通大田土壤或沙质的发芽盒中，然后置于30°C左右的光照培养箱中发芽。播种前，棉种最好用清水浸泡一天，可促使棉种吸水提早萌发。2.棉花基因组DNA提取。待棉苗长出子叶后，对每个材料的单株分别取2片子叶， 装入预先放有1粒小钢珠的2ml离心管。采用改良的CTAB法结合自动磨样机快速磨样，提取每个单株的基因组DNA。由于SSR标记对模板DNA的纯度要求不高，所以不需纯化DNA即可直接进行SSR-PCR扩增。3. SSR-PCR扩增和产物检测。由于SSR标记对模板DNA用量要求不高，陈勋基等报道模板浓度为4 12ng/y 1时均扩增出条带；陈浩东等的研究表明，模板浓度为1 5ng/ μ 1时均扩增出清晰的条带。因此在进行大批量棉种检测时不需测DNA浓度。DNA风干后， 用200 μ 1 1 X TE (ρΗ值8. 0)或灭菌的双蒸水ddH20溶解DNA，然后取少量的DNA原液，稀释 5倍后，用作PCR扩增的模板。PCR扩增体系在实验中不断摸索调试，最终确定SSR-PCR最佳反应体系，反应总体积为10μ 1， 各组分具体浓度见表1。表1、PCR反应体系immmmmmwKwKwTm......................................................................................................................................................................................................................................
PCR反应试剂终浓度用量
灭菌 ddH20-5.60μ1
IOxPCRbuffer (含 15mmol/L Mg2+)1χΙ.ΟΟμΙ
dNTP (10mmol/L)0.2 mmol/L0.20μ1(ATP、GTP、CTP、TTP 均0.2 mmol/L)TaqDNA 聚合酶(2.5U/pL)0.05 U/μΙ0.20μ1Forward Primer (5pmol/L)0.5 μιηο / Ι.ΟΟμΙReverse Primer (5pmol/L)0.5 μιηο /lΙ.ΟΟμΙ模板 DNA (50ng/(iL)5.0 ng/μ Ι.ΟΟμΙ
wmmmmKsaaasaaasaostigggggggggsww 冊冊 ...........................................................................................................................................................................................................................................具体反应程序如图14所示。由于每对SSR引物都有其特定的退火温度，因此扩增程序中的退火温度根据不同引物的实际Tm值而略有改动，其他程序均不变。PCR扩增产物的检测采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染显色。如下各个实施例中，盐池鉴定方法的步骤如下盐池鉴定方法采用0. 4%盐量胁迫法(叶武威等，1998)鉴定供试材料的耐盐性。 目前已利用该方法对我国棉花种质资源8200余份材料进行了耐盐性鉴定，是行业内通用的方法。具体操作流程如下(1)将供试材料随机排列种植在盐池内(平底水泥池，规格为90mXaiiX0. 15m)。 地尽量整平，每行种1个材料，各设3次重复，对照为耐盐材料中07。(2)棉花出苗后定苗，尽量均勻。等到三叶一心期时记载每行有效苗数，同时测定盐池内土壤含盐量。(3)扣除土壤中原来含有的盐量，按土壤最终含盐量0. 4%的标准，每行均勻撒盐 (NaCl)，然后用喷壶均勻喷洒清水，使盐分完全溶解入土。(4)撒盐10天后，调查每行成活苗数(以生长点活算作活苗)，计算各材料的成活苗率和相对成活苗率，根据相对耐盐成活苗率(salinity-resistance index，简称SRI)将棉花的耐盐性分为4级(叶武威，2007)。计算公式
成活苗数
成活苗率/% =--X 100
每行总苗数
权利要求
1.一种用于辅助鉴定耐盐棉花的引物组合物，为如下中任意一种(1)HAU1918、HAU1058和 TMB1288(2)HAU1918、NAU1085和 HAU773(3)HAU1918、HAU1058和 NAU1085(4)HAU1918.HAU1058和 TMB1288(5)HAU1918, HAU1058, HAU773 和 NAU1085(6)HAU1918, NAU1085, HAU773 和 TMB1288(7)HAU1918, HAU1058, NAU1085 和 TMB1288(8)HAU1918, HAU1058, HAU773, NAU1085 和 TMB1288(9)HAU1918和 TMB1288(10)NAU1085和 TMB1288(11)HAU773和 TMB1288(12)HAU1058和 TMB1288 ；所述HAU1918的一条引物序列如SEQ ID NO :3所示，另一条引物序列如SEQ ID NO 4 所示；所述HAU1058的一条引物序列如SEQ ID NO :5所示，另一条引物序列如SEQ IDNO :6所示；所述TMB1288的一条引物序列如SEQ ID NO :1所示，另一条引物序列如SEQ IDNO :2所示；所述NAU1085的一条引物序列如SEQ ID NO :7所示，另一条引物序列如SEQ IDNO 8 PJf示；所述HAU773的一条引物序列如SEQ ID NO :9所示，另一条引物序列如SEQ ID NO 10所示。
2.权利要求1所述引物组合物在辅助鉴定耐盐棉花中的应用。
3.一种辅助鉴定耐盐棉花的方法，包括如下步骤分别用权利要求1所述引物组合物中的每对引物对待测棉花单株进行PCR扩增，获得 PCR扩增产物，对所述PCR扩增产物进行检测，根据如下方法确认所述待测棉花单株为耐盐棉花还是盐敏感棉花若所述引物组合物对应的所有PCR扩增产物中含有耐盐特征带T且无敏盐特征带Si， 则确认所述待测棉花单株候选为耐盐棉花；若所述引物组合物对应的所有PCR扩增产物中含有敏盐特征带Si，则确认所述待测棉花候选为盐敏感棉花；若所述引物组合物对应的所有PCR扩增产物中不含有敏盐特征带Sl也不含有任何耐盐特征带T，则确认所述待测棉花候选为盐敏感棉花； 所述敏盐特征带Sl为60bp的DNA ； 所述耐盐特征带T为T4、T3A、T3B、T5和T2中的至少一种；所述jM为2IObp的DNA ；所述T3A为^Obp的DNA ；所述BB为MObp的DNA ；所述T5 为 220bp 的 DNA ；所述 T2 为 160bp 的 DNA。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述PCR扩增的体系由10XPCRbuffer、dNTP、Taq DNA聚合酶、SSR标记中的一条DNA分子、SSR标记中的另一条DNA分子和模板 DNA组成；dNTP在体系中的浓度为0. 2mmol/L, Taq DNA聚合酶在体系中的浓度为0. 05U/ μ 1, SSR标记中的一条DNA分子在体系中的浓度为0. 5μπιο1/1，SSR标记中的另一条DNA 分子在体系中的浓度为0.5 μ mol/Ι，模板DNA在体系中的浓度为5. Ong/μ L·
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述对所述PCR扩增产物进行检测的方法为测序或非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
6.一种辅助鉴定耐盐棉花的方法，包括如下步骤取待测棉花的15个单株，按照权利要求3-5中任一所述方法对每株棉花进行检测，若 15个单株中有8株以上被鉴定为耐盐棉花，则确认所述待测棉花候选为耐盐棉花；若15个单株中有7株以下被鉴定为盐敏感棉花，则确认所述待测棉花候选为盐敏感棉花。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述待测棉花为棉花常规种或棉花杂交种。
8.权利要求3-7中任一所述方法在耐盐棉花品种的选育中的应用。
9.权利要求3-7中任一所述方法在棉花的遗传育种中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种鉴定耐盐棉花的方法及专用SSR标记。本发明的用于辅助鉴定耐盐棉花的引物组合物，为HAU1918、HAU1058和TMB1288。实验证明，本发明的鉴定方法结果稳定可靠、操作简单、经济高效，相比形态学鉴定法具有高效准确、省时省力、不受季节限制等优点，展示了较好的应用前景，更好地服务于生产实践中棉花耐盐性的鉴定和评价。因此，本发明SSR标记组合物及耐盐棉花鉴定方法在棉花的耐盐性鉴定领域将有广阔的应用前景。
文档编号C12Q1/68GK102251029SQ20111016390
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月17日 优先权日2011年6月17日
发明者叶武威, 张丽娜, 樊保相, 王俊娟, 王帅, 王德龙 申请人:中国农业科学院棉花研究所