专利名称：口蹄疫病毒O型、A型与Asia 1型三重RT-PCR检测试剂及其检测方法
技术领域：
本发明属于动物疫病检测检疫技术领域，涉及口蹄疫病毒0型、A型与Asia 1型三重RT-PCR检测试剂及其检测方法。
背景技术：
口蹄疫(Foot and Mouth Disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus, FMDV)引起的以偶蹄动物为主的急性、热性、高度传染性疫病，世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的动物传染病，我国规定为一类动物疫病。口蹄疫病毒能使多种动物患病，主要侵害偶蹄兽，以牛最易感，其次是猪，再次为绵羊、山羊和骆驼等动物。口蹄疫传播速度快，范围广，呈蔓延式也有跳跃式，一般呈地方流行性，也可形成周期性大流行。在自然状态下，数个感染性病毒颗粒即可引起牲畜发病，疫区发病率可达50 100%，幼畜死亡率较高，其他成年动物则较低。牲畜感染口蹄疫后，会造成牲畜休食量下降，机体抵抗力和免疫力降低，容易继发其他病毒性疾病和细菌性疾病，从而造成感染动物的生产性能严重下降。随着我国规模养殖业的不断发展，口蹄疫传播速度越来越快，范围也在不断扩大，加之流行毒株血清型的不断改变，使得口蹄疫控制难度不断加大。目前，我国每年均花费大量人力、物力和财力进行控制和消灭，但该病每年仍然时有发生。口蹄疫分0型、A型、C型、南非1型、南非2型、南非3型、Asia 1型(亚洲I型)7 个血清型，各主型又分若干亚型，各主型之间无交叉免疫性，且可在不同种动物间传播，同一主型内的不同亚型之间也只有部分有交互免疫性。目前我国已有猪、牛感染0型和Asia 1型口蹄疫的病例，2009年1月以来，我国奶牛已有感染A型口蹄疫的多例报道，因此A型口蹄疫对猪的潜在危害也非常大。规模化牲畜场将要面对Asia 1、0、A三种血清型口蹄疫的威胁，防控工作难度进一步加大。目前已有Asia 1型口蹄疫用液相阻断ELISA方法、0型口蹄疫用正向间接血凝试验或液相阻断ELISA方法、非结构蛋白(NSPs)间接ELISA方法等，这些血清学方法只能评价口蹄疫单一血清型抗体水平。RT-PCR诊断方法具有快速、特异、敏感等优点已在疫病病原学诊断中得到广泛应用，成为动物疫病病原学快速诊断方法之一。尽管国内已有研究者建立了针对0型、A型与Asia 1型的单一血清型口蹄疫RT-PCR诊断方法，但不能同时对三种血清型检测。针对口蹄疫病毒0型、A型与Asia 1型三种血清型设计共用反转录引物和型特异性引物，建立口蹄疫病毒0型、A型与Asia 1型三重RT-PCR检测方法，经过一个PCR 反应能同时对三种血清型口蹄疫病原进行鉴别确诊，方法快速、特异、敏感性高，对于临床上口蹄疫病毒0型、A型与Asia 1型快速鉴别诊断具有重要意义，目前还未见相关报道。
发明内容
本发明建立了口蹄疫病毒0型、A型与Asia 1型三重RT-PCR检测试剂及其检测方法，目的在于对口蹄疫病原三种血清型进行快速、特异地分型诊断，以便有针对性采取措施进行防控。 为实现本发明的目的，本研究采用共同的反转录引物，三对特异性PCR引物建立口蹄疫病毒0型、A型与Asia 1型三重RT-PCR，优化反应体系组份、反应条件，进行特异性、 灵敏度、重复性验证，利用建立成功的口蹄疫病毒0型、A型与Asia 1型三重RT-PCR检测方法进行初步应用检测。主要内容如下 1.引物序列
经大量比对GenBank中口蹄疫病毒0型、A型与Asia 1型全基因序列，选择口蹄疫病毒0型、A型与Asia 1三个血清型高度保守的2B基因为模板设计共用反转录引物P0，根据这3个血清型型特异性VPl基因序列，设计三对型特异性引物(P1/P2、P3/P4、P5/P6)，由大连(宝)生物工程有限公司合成，稀释至终浓度为20μπκ)1/ L0用于口蹄疫病毒0型、A型与Asia 1型三重RT-PCR引物序列如下
PO:tgtcctcctgcatctggttg20P1gtccagagacgccaacacacg 21P2ggtgttgtccaacgctgtcteg 22P3agccccacgcacgtcattgac 21P4acccgcgccgcgagagacc 19P5agcccaagagcacccaaaccc 21P6acggcggtcttgtgtggtgtc 212.模板RNA的制备
经灭活的口蹄疫病毒0型、A型和Asia 1型标准株细胞培养物单一和等量混合物为阳性对照、正常BHK-21细胞为阴性对照，与待检测样品同时采用Trizol法提取总RNA。具体操作如下分别取灭活病毒细胞培养物单一培养物和等量混合物、阴性对照及待检样品 (如为组织时先加适量PBS研磨后取上清)各200 μ L于1. 5mL离心管中，再加入600 μ L的 Trizol于涡旋器震荡2-;3min，加入200 μ L氯仿，离心后，取上清转入另一 1. 5mL离心管中， 加200 μ L异丙醇沉淀，质量百分比75%的乙醇洗涤沉淀，干燥，最后用20 μ L DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶解沉淀，取10 μ L用于反转录，其余一 20°C保存。反转录
每管反转录反应体系含如下成份5XM-MLV缓冲液4 μ ；2. 5mmol/L dNTPs (三磷酸脱氧核苷酸)4 μ ；M-MLV反转录酶0. 5 μ ；RNA酶抑制剂0. 5 μ ；PO引物1 μ ，总体积 10 μ 。向每管反转录反应体系中分别加入步骤2所制得的RNA 10 μ ，37°C水浴Ih或置于PCR仪中37°C反应lh，反应结束后，70°C，15 min灭活反转录酶，直接用于下面的PCR扩增或一 20°C冻存备用。PCR扩增及鉴定
以反转录产物为模板进行三重PCR扩增。通过对PCR反应体系及反应条件的优化，确定反应体系如下采用25 μ L反应体系，其中-A^XExTaq缓冲液2. 5 μ L，2. 5mM dNTPs 2 μ L，ExTaq聚合畜2. 5 U，3对型特异性引物(P1/P2、P3/P4、P5/P6)各0. 5 μ L，步骤3所制得的0型、A型和Asia 1型的单一细胞培养物和等量混合物、正常BHK-21细胞反转录产物各2 μ L，用去离子水补至25 μ L，置PCR仪上进行反应。扩增条件为94°C，5min后，94°C45s, 620C 45s, 72°C 45s，；35个循环，最后72°C延伸lOmin。PCR产物经1. 5 %琼脂糖电泳
观察结果。将口蹄疫病毒O型、A型和Asia 1型标准株阳性扩增的产物片段分别克隆入 PGEM-T easy载体，筛选阳性重组质粒送大连宝生物工程有限公司采用T7和SP6引物进行测序。特异性试验
按步骤2所述方法对猪水泡病病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪水疱性口炎病毒、猪瘟病毒等提取RNA并按步骤3进行反转录，猪伪狂犬病毒、猪链球菌2型及弓形虫等则直接提取DNA，同时设经灭活的口蹄疫病毒O型、A型和Asia 1型标准株细胞培养物等量混合物为阳性对照，正常BHK-21细胞cDNA为阴性对照，按照步骤4所述的方法进行PCR扩增以验证该方法的特异性。进行了如下验证试验 (a)敏感性试验
将步骤4所得的口蹄疫病毒O型、A型和Asia 1型pGEM_T easy重组质粒分别作10 倍系列稀释，三种质粒1:1:1比例混合，每种质粒终浓度调整为1. O X IO7 1. O X 10°拷贝 / μ L，按步骤4中的模板加入量加至PCR反应体系，按照步骤4方法进行PCR扩增，以确定该方法检测的模板最低限度。(b)稳定性和重复性试验
分别将6个浓度的、10倍系列稀释的口蹄疫病毒O型、A型和Asia 1型pGEM_T easy 重组等量质粒混合物(每种质粒终浓度1.0 X IO7 1.0 X IO2)按照步骤4方法进行PCR扩增，每个系列设定3个重复，以验证该方法的稳定性和重复性。(C)应用试验
依据建立的口蹄疫病毒O型、A型和Asia 1型三重RT-PCR检测方法，配制检测试剂， 以灭活的口蹄疫病毒O型、A型、Asia 1型标准株细胞培养物等量混合物为阳性对照，正常 BHK-21细胞为阴性对照，由国内口蹄疫病毒分离培养研究资质的实验室对其保存的10份临床怀疑样品(样品编号为=Sl-SlO)进行检测，并与其以前的分离鉴定结果比较。
图1 口蹄疫病毒O型、A型和Asia 1型三重RT-PCR产物电泳图；图注说明Μ. IOObp梯度DNA分子量标记，Pl. 口蹄疫病毒O型、A型、Asia 1型细胞培养物等量混合物阳性对照，P2. 口蹄疫O型培养物阳性对照，P3. 口蹄疫A型培养物阳性对照，P4. 口蹄疫 Asia 1型培养物阳性对照，N.阴性对照。图2: 口蹄疫病毒O型、A型和Asia 1型三重RT-PCR特异性试验；图注说明 M. IOObp梯度DNA分子量标记，1.阳性对照，2.阴性对照，3.猪水泡病病毒，4.猪繁殖与呼吸综合症病毒，5.猪水泡性口炎，6.猪瘟病毒，7.猪伪狂犬病毒，8.猪链球菌2型， 9.弓形虫。图3: 口蹄疫病毒O型、A型和Asia 1型三重RT-PCR敏感性试验；图注说明 M. IOObp梯度DNA分子量标记，1 8为10倍系列稀释的口蹄疫病毒三个血清型(O型、A 型、Asia 1型)重组阳性质粒等量混合物(1.0 X IO7 1.0 X 10°拷贝/ μ L)。图4 口蹄疫病毒O型、A型和Asia 1型三重RT-PCR应用试验；图注说明M. IOObp梯度DNA分子量标记，P:阳性对照，N:阴性对照，1. Si,2. S2，3. S3,4. S4，5. S5，6. S6，7. S7，8. S8，9. S9,10. S10。
具体实施例方式材料与方法
1.1材料 1. 1. 1毒株
经灭活的口蹄疫病毒0型、A型和Asia 1型标准株细胞培养物，来自国内某单位生产的口蹄疫检测试剂盒；其他对照病毒或细菌株由河南省动物疫病预防控制中心实验室保存。仪器和试剂
PCR扩增仪，德国Biometra公司产品；凝胶成像分析系统，美国Alpha Innotech公司产品；恒温水浴震荡器(HZQ-Q)，哈尔滨东联电子技术开发有限公司产品；台式高速冷冻离心机，美国Heraeus公司产品；ExTaq DNA聚合酶、dNIPs、DNA回收试剂盒等均购自大连 (宝)生物工程有限公司，pGEM-T Easy载体、JM109感受态细胞购自Promega公司。方法
1.2.1引物设计和合成
经大量比对GenBank中口蹄疫病毒0型、A型与Asia 1型全基因序列，选择口蹄疫病毒0型、A型与Asia 1三个血清型高度保守的2B基因为模板设计共用反转录引物P0，根据这3个血清型型特异性VPl基因序列，设计三对型特异性引物(P1/P2、P3/P4、P5/P6)，由大连(宝)生物工程有限公司合成，稀释至终浓度为20μπκ)1/ L0用于口蹄疫病毒0型、A型与Asia 1型三重RT-PCR引物序列如下 PO :tgtcctcctg catctggttg 20 P1 :gtccagagac gccaacacac g 21 P2 :ggtgttgtcc aacgctgtct eg 22 P3 :agccccacgc acgtcattga c 21 P4 :acccgcgccg cgagagacc 19 P5 :agcccaagag cacccaaacc c 21 P6 :acggcggtct tgtgtggtgt c 21 1.2.2模板RNA的制备
经灭活的口蹄疫病毒0型、A型和Asia 1型标准株细胞培养物单一和等量混合物为阳性对照、正常BHK-21细胞为阴性对照，与待检测样品同时采用Trizol法提取总RNA。具体操作如下分别取灭活病毒细胞培养物单一培养物和等量混合物、阴性对照及待检样品(如为组织时先加适量PBS充分研磨后取上清)各200 μ L于1. 5mL离心管中，再加入600 μ L的 Trizol于涡旋器震荡2-;3min，加入20(^1^氯仿，41，12000rpm离心IOmin后，取上清转入另一 1. 5mL离心管中，加200 μ L异丙醇沉淀，质量百分比75%的乙醇洗涤沉淀，干燥，最后用20 μ L DEPC水溶解沉淀，取10 μ L用于反转录，其余一 20°C保存。反转录
每管反转录反应体系含如下成份5XM-MLV Reaction buffer 4 μ ；2. 5mmol/L dNTPs 4 μ ；M-MLV 反转录酶 0. 5 μ ；RNA 酶抑制剂 0. 5 μ ；P0 引物 1 μ ，总体积 10 μ 。向每管反转录反应体系中分别加入步骤2制得的RNA 10 PL，37°C水浴Ih或置于PCR仪中 37°C反应lh，反应结束后，70°C，15 min灭活反转录酶，直接用于下面的PCR扩增或一 20°C 冻存备用。PCR扩增及鉴定
以反转录产物为模板进行三重PCR扩增。通过对PCR反应体系及反应条件的优化，确定反应体系如下采用25 μ L反应体系，其中10 X份7 Buffer 2.5 μ L, 2. 5mM dNTPs 2 μ U ExTaq M ·^ 2. 5 U，3 对型特异性引物(Ρ1/Ρ2、Ρ3/Ρ4、Ρ5/Ρ6)各 0. 5 μ L，步骤 1. 2. 3 所制得的0型、A型和Asia 1型的单一细胞培养物和等量混合物、正常BHK-21细胞反转录产物各2 μ L，用去离子水补至25 μ L，置PCR仪上进行反应。扩增条件为94°C，5min后，94°C 45s, 62°C 45s, 72°C 45s，；35个循环，最后72°C延伸lOmin。PCR产物经1. 5 %琼脂糖凝胶电泳，置凝胶成像分析系统观察结果。将口蹄疫病毒O型、A型和Asia 1型标准株阳性扩增的产物片段分别克隆入 PGEM-T easy载体，筛选阳性重组质粒送大连宝生物工程有限公司采用T7和SP6引物进行测序。特异性试验
按1. 2. 2方法对猪水泡病病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪水疱性口炎病毒、猪瘟病毒等提取RNA并按1. 2. 3进行反转录，猪伪狂犬病毒、猪链球菌2型及弓形虫等则直接提取 DNA，同时设经灭活的口蹄疫病毒O型、A型和Asia 1型标准株等量细胞培养物混合物为阳性对照，正常BHK-21细胞cDNA为阴性对照，按照1. 2. 4方法进行PCR扩增以验证该方法的特异性。敏感性试验
将1. 2. 4中得到的口蹄疫病毒O型、A型和Asia 1型pGEM_T easy重组质粒分别作10 倍系列稀释，三种质粒1:1:1比例混合，每种质粒终浓度调整为1. OX IO7 1. OX 10°拷贝 / μ L，按1. 2. 4中的模板加入量加至PCR反应体系，按照1. 2. 4方法进行PCR扩增，以确定该方法检测的模板最低限度。稳定性和重复性试验
分别将6个浓度的、10倍系列稀释的口蹄疫病毒O型、A型和Asia 1型pGEM_T easy 重组质粒等量混合物(每种质粒终浓度1. OX IO7 1.0X IO2)按照1.2.4方法进行PCR扩增，每个系列设定3次重复，以验证该方法的稳定性和重复性。应用试验
根据建立的口蹄疫病毒O型、A型和Asia 1型三重RT-PCR检测方法，配制检测试剂， 以灭活的口蹄疫病毒O型、A型、Asia 1型标准株细胞培养物等量混合物为阳性对照，正常 BHK-21细胞为阴性对照，由国内具有口蹄疫病毒分离培养研究资质的实验室对其保存的 10份临床怀疑样品(样品编号为=Sl-SlO)进行检测，并与其以前的分离鉴定结果比较。结果
2. 1 口蹄疫病毒O型、A型和Asia 1型三重RT-PCR诊断方法的建立经灭活的口蹄疫病毒O型、A型和Asia 1型标准株等量细胞培养混合物同时扩增出了预期的230bp、330bp和470bp左右大小的三条目的片段，单一毒株细胞培养物均扩增出了相应的单一条带；阴性对照没有扩增出任何条带；判定检测结果成立；此时，若检测样品在与阳性扩增条带分子量大小一致的位置出现特异性扩增条带，则判定为检测结果阳性，否则判为阴性。对以上三条不同大小的PCR扩增产物克隆后测序，0型、A型和Asia 1型的PCR扩增产物的确切长度分别为234bp、3^bp和467bp。将序列输入GenBank中与已登录的口蹄疫病毒基因序列进行BLAST比对，三个片段基因序列与0型、A型和Asia 1型VPl基因序列同源性均在98%以上。特异性试验
采用所建立的多重RT-PCR方法对0型、A型和Asia 1型标准株cDNA混合物进行扩增可获得大小为234bp、326bp和467bp的三条目的带，但正常BHK-21细胞、猪水泡病病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪水泡性口炎、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪链球菌2型、弓形虫均未能扩增出任何条带。敏感性试验
三重RT-PCR方法对口蹄疫病毒0型、A型和Asia 1型重组质粒最低检出极限均为100 个拷贝/ μ L，出现大小为234bp、3^bp和467bp的目的条带，表明所建立的口蹄疫病毒0 型、A型和Asia 1型三重RT-PCR检测方法可检测最低限度为100个拷贝/ μ L。稳定性和重复性试验
重复性试验结果表明，浓度为1. OX IO7 1.0Χ IO2拷贝/yL的6个浓度的口蹄疫病毒0型、A型和Asia 1型重组质粒等量混合物3次重复试验结果均为阳性，浓度为1. 0 X IO1 拷贝/PL和1.0X10°拷贝/yL重组质粒等量混合物3次重复试验结果均为阴性。说明建立的口蹄疫病毒0型、A型和Asia 1型三重RT-PCR检测方法具有很好的稳定性和重复性。应用试验
对10份临床怀疑样品进行三重RT-PCR扩增，结果口蹄疫病毒0型核酸阳性样品4份、 口蹄疫病毒A型核酸阳性样品1份、口蹄疫Asia 1型核酸阳性样品3份、阴性样品2份。此检测结果与已前已进行的分离鉴定和测序结果符合率为100%。
权利要求
1.一种口蹄疫病毒0型、A型与Asia 1型三重RT-PCR检测试剂，其特征在于，包含1 条共用反转录引物P0，针对0型、A型与Asia 1型3对型特异性引物P1/P2、P3/P4、P5/ P6，扩增目标片段长度分别为234bp、326bp和467bp ；所用的7条引物DNA序列为弓丨物 PO :tgtcctcctg catctggttg 20 弓I物 Pl :gtccagagac gccaacacac g 21 弓丨物 P2 :ggtgttgtcc aacgctgtct eg 22 弓I物 P3 :agccccacgc acgtcattga c 21 弓丨物 P4 :acccgcgccg cgagagacc 19 弓I物 P5 :agcccaagag cacccaaacc c 21 弓I物 P6 :acggcggtct tgtgtggtgt c21 。
2.如权利要求1所述的口蹄疫病毒0型、A型与Asia1型三重RT-PCR检测方法，其特征在于提取三重RT-PCR待检测样品总RNA，以已知的经灭活的口蹄疫病毒0型、A型和Asia 1型细胞灭活毒标准株细胞培养物单一和等量混合物为阳性对照样品、正常BHK-21细胞为阴性对照样品，与待检测样品同时进行总RNA提取操作；通过口蹄疫病毒0型、A型与Asia 1型三重RT-PCR检测方法获得型特异性扩增产物以引物PO为共用反转录引物配制反转录体系进行反转录，以P1/P2、P3/P4、P5/P6引物对为扩增引物加入同一反应体系中配制0 型、A型和Asia 1三重PCR反应体系，以口蹄疫病毒0型、A型和Asia 1型标准株细胞培养物混合物总RNA的反转录产物为阳性对照样品，以BHK-21细胞总RNA反转录产物为阴性对照样品，与待检样品cDNA同时进行三重PCR扩增操作；取扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，PCR阳性对照样品呈扩增阳性、PCR阴性对照样品呈扩增阴性，判定检测结果成立，此时，若检测样品在与阳性扩增条带分子量大小一致的位置出现特异性扩增条带，则判定为检测阳性，否则判为阴性；设计的共用反转录引物PO和3对型特异性引物对P1/P2、P3/P4、 P5/P6, DNA 序列为弓I物 P0:tgtcctcctg catctggttg 20弓I物 Pl :gtccagagac gccaacacac g 21弓丨物 P2 :ggtgttgtcc aacgctgtct eg 22弓I物 P3 :agccccacgc acgtcattga c 21弓丨物 P4 :acccgcgccg cgagagacc 19弓I物 P5 :agcccaagag cacccaaacc c 21弓I物 P6 :acggcggtct tgtgtggtgt c21。
3.如权利要求2所述的口蹄疫病毒0型、A型与Asia1型三重RT-PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤(1)总RNA的制备以口蹄疫病毒0型、A型和Asia 1型细胞灭活毒标准株细胞培养物单一和等量混合物为阳性对照、正常BHK-21细胞为阴性对照，与待检测样品同时采用Trizol法提取总RNA，具体操作如下分别取灭活病毒细胞培养物单一培养物和等量混合物、阴性对照及待检样品各200 μ L于1. 5ml离心管中，再加入600 μ L的Trizol于涡旋器震荡2_;3min，加入200 μ L 氯仿，4°C，12000rpm离心IOmin后，取上清转入另一 1. 5ml离心管中，加200 μ L异丙醇沉淀，质量百分比75%的乙醇洗涤沉淀，干燥，最后用20 μ L DEPC水溶解沉淀，取10 μ L用于反转录，其余一 20°C保存； ⑵反转录每管反转录反应体系含如下成份5XM-MLV Reaction buffer 4 μ ；2. 5mmol/L dNTPs 4 μ ；M-MLV 反转录酶 0. 5 μ ；RNA 酶抑制剂 0. 5 μ ；P0 引物 1 μ ，总体积 10 μ ； 向每管反转录反应体系中分别加入步骤(1)所得的RNA 10 PL，37°C水浴Ih或置于PCR仪中37°C反应lh，反应结束后，70°C，15 min灭活反转录酶，直接用于下面的PCR扩增或一 20°C冻存备用；⑶PCR扩增及鉴定以反转录产物为模板进行三重PCR扩增，通过对PCR反应体系及反应条件的优化，确定反应体系如下采用25 μ L反应体系，其中10Χ位Taq Buffer 2. 5 μ L，2. 5mM dNTPs 2 v-UEx Ti^f合酶2.5 U，6条引物各0.5 μ L，0型、A型和Asia 1型的反转录产物各 2 μ L，用去离子水补至25 μ L，置PCR仪上进行扩增反应，扩增条件为94°C，5min后，94°C 45s, 62°C 45s, 72°C 45s, ；35 个循环，最后 72°C延伸 IOmin ； ⑷结果判定经灭活的口蹄疫病毒0型、A型和Asia 1型标准株等量细胞培养混合物同时扩增出了预期的234bp、3^bp和467bp大小的三条目的片段，单一毒株细胞培养物扩增出了相应的单一条带；阴性对照没有扩增出任何条带，判定检测结果成立；此时，若检测样品在与阳性扩增条带分子量大小一致的位置出现特异性扩增条带，则判定为检测结果阳性，否则判为阴性。
全文摘要
本发明属动物疫病检测检疫技术领域，公开了一种用于口蹄疫病毒O型、A型与Asia1型三重RT-PCR检测试剂及其检测方法。本发明所述的口蹄疫病毒O型、A型与Asia1型三重RT-PCR检测试剂包含一条共用反转录引物和3对型特异性引物，扩增目标片段长度分别为234bp、326bp和467bp；所述的三重RT-PCR检测方法包含引物序列、总RNA的制备、反转录、PCR扩增及鉴定、结果判定等与方法建立相关的步骤。本发明经过一个PCR反应可同时检测口蹄疫病毒三个血清型，可对口蹄疫病原进行快速、特异的血清分型诊断，方法快速、特异、敏感性高，对于临床上口蹄疫病毒O型、A型与Asia1型快速鉴别诊断具有重要意义。
文档编号C12Q1/70GK102230029SQ20111016393
公开日2011年11月2日 申请日期2011年6月17日 优先权日2011年6月17日
发明者刘光辉, 吴志明, 张健, 张志凌, 方先珍, 王东方, 谢彩华, 赵明军, 闫若潜 申请人:河南省动物疫病预防控制中心