专利名称：与鸡300日龄产蛋量相关的garnl1基因上的位点及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程和遗传工程领域，具体涉及与鸡300日龄产蛋量相关的 GARNLl基因上的位点及其应用
背景技术：
我国优质鸡资源丰富，但绝大部份的地方品种的繁殖性能普遍低下，年产蛋量平 均只有70-90枚，且具有顽固的就巢性(yang and jiang, 2005)。繁殖性能低下已经成为 制约优质鸡产业发展的瓶颈，提高优质鸡繁殖性能是优质鸡育种中需要重点解决的问题。 传统的育种方法对鸡繁殖性能的提高卓有成效，经过多年的高强度的选育提高，育成了专 门化的商品蛋鸡配套系，年产蛋量在280枚以上。但传统的育种方法需要完整记录整个母 鸡生产周期的产蛋情况，世代间隔长，这也限制了优质鸡繁殖性能的育种进展。若要进一步 提高优质鸡的繁殖性能，必须对其遗传机理有更为深入的了解。因而，应用分子标记的现代 育种技术对于提高优质鸡产蛋量是先进有效的办法。将DNA分析做为主要的研究手段应用 于优质鸡的育种中，主要目的是通过在DNA分子水平上寻找与优质鸡繁殖性状密切相关的 遗传标记，用于早期的选育，从而加快育种进程。鸡的繁殖性状是一个复杂的性状，具有遗传力低，易受环境影响等特点。通过对鸡 神经内分泌的研究分析，表明了多个基因参与了鸡的繁殖行为，如就巢行为被认为是雌激 素、孕酮和催乳素相互作用的结果(Gruaz et al，1993; Yasin et al, 1995; El Halawani et al, 2000)，而促性腺激素释放激素(Gonadotrophin Releasing Hormone, GnRH)被认为 是控制产蛋的关键神经肽激素，鸡基因组研究进展为家禽繁殖性状的遗传基础提供可能。 候选基因法和QTL (Quantitative trait locus, QTL)定位被广泛运用于鸡繁殖性能的研 究上。鸡的繁殖性状已有研究被定位到了不同的染色体区域，但由于大部份的QTL定位研 究采用的都是杂交群体，因而限制了 QTL定位的结果在商业群体的直接应用。GARNLl基因目前的研究非常少，人上GARNLl基因的研究表明，它与神经表型和家 方矣基底节 丐化症(Familial idiopathic basal ganglia calcification, IBGC ；XI^Fahr disease)相关(Schwarzbraun 等，2004)，且与脑部发育廷滞相关(Shimojima 等，2009)； 在鸡上面的研究仅见于Chen等(2006,2007)通过消减杂交cDNA文库筛选与产蛋量相关 基因，结果表明G^&VD基因在同一品系高产和低产组中表达差异极显著，该研究表明了鸡 GARNLl基因在mRNA水平上与鸡繁殖性能的关系。
迄今为止，尚未将鸡基因做为鸡繁殖性状的分子标记。
发明内容
本发明的目的在于根据现有优质繁殖性能鸡的选育中存在的不足，提供一个与鸡 300日龄产蛋量相关的似记见7基因上的位点，该位点可以作为分子标记，用于选育优质繁 殖性能鸡。本发明还有一个目的在于提供上述与鸡300日龄产蛋量相关的β^Ρ 基因上的位点的应用。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现
与鸡300日龄产蛋量相关的GARNLl基因上的位点，所述位点位于鸡的GARNLl基因外 显子15上第138bp处的一个C — G突变，所述β^Ρ 基因外显子15的核苷酸序列如SEQ ID Ν0:1 所示。
GARNLl基因外显子15上上第138 bp处存在有1个的碱基突变，但没有引起酶切 位点的变化。我们使用质谱分型的方法来研究该位点的多态性。本发明与鸡300日龄产蛋量相关的β^Ρ 基因上的位点作为分子标记，该位点等 位基因型为CC型个体的300日龄总产蛋量要极显著高于GC型和GG型P < 0. 01，因而等位 基因C为300日龄总产蛋量优势等位基因，可用于筛选具有优质繁殖性能的鸡品种的具体 步骤如下
(1)从待测鸡血液样本中提取鸡基因组DNA；
(2)根据NCBIdbSNP数据库提供的鸡似7&见7基因外显子15上的位点序列，由深 圳华大基因科技有限公司根据序列设计引物扩增出待测SNP所在的核苷酸片段，利用 MALDI-T0F-MS质谱检测平台进行基因分型。质谱分型的原理是利用样品分子在电场中的飞 行时间与分子的荷质比成正比的原理，通过检测样品分子的飞行时间，测得分子量，检测出 SNP位点；
(3)根据基因分型所得到的图谱，得到待测样品的基因型。上述步骤(2)中，所述引物如SEQ ID NO:2^3所示。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
本发明标记为鸡繁殖性能特别是300日龄总产蛋量的选育提供了一种新的分子标记。 实验证明基因对鸡300日龄总产蛋量有一定的影响，可以做为候选基因或300日龄 产蛋量的遗传标记。
图1为本发明的选育优质繁殖性能鸡品种的技术流程图； 图2为纯合子CC质谱分型图谱结果；
图3为杂合子GC质谱分型图谱结果； 图4为纯合子GG质谱分型图谱结果。
具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施例1
1、鸡血样的采集和DNA的提取
300日龄繁殖性状测定完成后，采用一次性注射器从鸡翅下静脉中抽取约1 mL血液， 注入经高压灭菌并装有约 200 μ L 2% 无菌 EDTA (Ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)抗凝剂的1. 5 mL离心管中，轻轻摇勻，记录翅号，_80°C保存备用。基因组DNA的抽提采用苯酚_氯仿抽提法(奥斯泊F等，1998)(1)取全血30μ L置于1. 5 mL离心管，分别加入470 μ L 1 X SET缓冲液、12.5 μ L 20% SDS和6 μ LlO mg/mL蛋白酶K，混合均勻后放于55°C水浴过夜；
(2)取出样本于1.5mL离心管，加入500μ L饱和苯酚，轻摇20 min，10，000 rpm离心 10 min ；
(3)取上清，再次加入500μ L饱和苯酚，轻摇20 min, 10, 000 rpm离心10 min ；
(4)取上清，加入500μ L氯仿-异戊醇( 23 :1)轻摇20 min, 10, 000 rpm离心10 min ；
(5)取上清，加入1mL冰无水乙醇(_20°C)，来回摇摆以沉淀DNA，10，000 rpm离心10 min后倒出乙醇；
(6)用1mL 75%乙醇清洗DNA —次，倒掉乙醇，置于50°C干燥箱内烘干；(7)待DNA完 全干燥后加入300 μ L灭菌后的双蒸水溶解，50°C水浴锅中过夜以溶解DNA ；
(8)存放于-20°C冰箱中保存备用。2、目的片段的获得及质谱分型 (1)扩增含待测位点的核苷酸片段
根据序列，委托深圳华大基因科技有限公司设计引物，扩增出待测位点的核苷酸片段。 该引物序列如SEQ ID N0:2 3所示。(2)针对待测位点，设计单条特异引物 引物核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示。当退火时，特异引物的3’端的碱基刚好与待测位点的前一个碱基结合。(3)单(双)碱基延伸SNP位点
在反应体系中加入ddNTP和DNA聚合酶，当某一 ddNTP与待测位点碱基互补并结合 时，链延伸反应终止，得到延伸一个碱基的样品分析物。(4)质谱检测，自动分型
将制备的样品分析物与晶片基质共结晶后放入质谱仪的真空管，用瞬时纳秒(10-9s) 强激光激发；由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热而使基质晶体 升华，核酸分子解吸附并转变为亚稳态离子，产生的离子多为单电荷离子，在加速电场中获 得相同的动能，进而在一非电场漂移区内按照其质荷比率加以分离，在真空小管中飞行到 达检测器。MALDI产生的离子通过飞行时间(Time-of-Flight，T0F)检测器来检测，离子质 量越小，就越快到达。3、基因型判定及关联分析
根据质谱的结果判定该位点在检测群体中的基因型。实施例2
m% GARNLl基因位点不同基因型与鸡繁殖性状进行关联分析的检测应用。1% GARNlA 基因位点分析结果如表1所示。由表1可以得到基因型间对鸡300日龄产蛋量(EN300)的 影响达到了极显著水平(P < 0. 01)。表1 GARNLl基因rsl4532787位点与鸡300日龄产蛋量的关联分析
权利要求
与鸡300日龄产蛋量相关的GARNL1基因上的位点，其特征在于所述位点位于鸡的GARNL1基因外显子15上138bp处的一个C→G突变，所述GARNL1基因外显子15的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述与鸡300日龄产蛋量相关的GARNLl基因上的位点的应用，其特征在 于所述与鸡300日龄产蛋量相关的GARNLl基因上的位点作为分子标记，该位点等位基因型 为CC型个体的300日龄总产蛋量要极显著高于GC型和GG型，因而等位基因C为300日龄 总产蛋量优势等位基因，用于筛选具有优质繁殖性能的鸡品种。
3.根据权利要求2是所述与鸡300日龄产蛋量相关的GARNLl基因上的位点的应用，其 特征在于所述筛选方法包括如下步骤(1)从待测鸡血液样本中提取鸡基因组DNA；(2)根据鸡GARNLl基因外显子15上第138bp处的C/G突变位点，设计引物扩增出待测 SNP所在的核苷酸片段后，进行基因分型；(3)根据基因分型所得到的图谱，得到待测样品的基因型。
4.根据权利要求3所述与鸡300日龄产蛋量相关的GARNLl基因上的位点的应用，其特 征在于步骤(2)中，所述引物如SEQ ID N0:2 3所示。
5.根据权利要求3所述与鸡300日龄产蛋量相关的GARNLl基因上的位点的应用，其特 征在于步骤(2)中，所述基因分型是通过MALDI-T0F-MS质谱检测平台完成的。
全文摘要
本发明公开了一个与鸡300日龄产蛋量相关的GARNL1基因上的位点及其应用。本发明鸡300日龄产蛋量相关的GARNL1基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，所述位点位于GARNL1基因外显子15上第138bp处的一个C/G突变。该位点与鸡300日龄总产量极显著相关(P＜0.01)，且等位基因C为300日龄总产量中高产蛋量的优势等位基因。本发明与鸡300日龄产蛋量相关的GARNL1基因上的位点可用于筛选具有优质繁殖性能的鸡品种。
文档编号C12Q1/68GK101948831SQ20101028038
公开日2011年1月19日 申请日期2010年9月14日 优先权日2010年9月14日
发明者张细权, 曾华, 沈栩, 谢亮 申请人:华南农业大学