专利名称：：LeEXP2提高纤维素酶降解纤维素材料效率的用途的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物工程领域，具体地涉及一种LeEXP2提高纤维素酶降解纤维素材料效率的用途。
背景技术：
：纤维素是植物细胞壁的主要成份，是地球上最大量的可再生碳源物质。利用其进行生物转化生产燃料乙醇等化学品，对于当前人类解决能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有极其重要的意义。纤维素特殊的晶体结构使纤维素酶分子很难靠近纤维素分子内部的糖苷键，酶解消耗大量的纤维素酶和时间已成为生物质转化的瓶颈[1]。目前运用化学试剂或高温高压等方式改变纤维结构不仅成本高和费时，而且也会带来环境污染。因此，寻找温和、高效、环保的改变纤维结构的方法尤为迫切。Expansins是高等植物的细胞壁中普遍存在的一类蛋白质，能增强细胞壁的延展能力，松弛植物细胞壁从而使细胞扩增，在植物的生长发育及应答胁迫中扮演重要角色。目前发现Expansins主要有四个基因家族，即α-expansin(EXPA)，β-expansin(EXPB)，expansin-likeA(EXLA)禾口expansin-likeB(EXLB)[4]Expansin的典型结构特点为N-端信号肽，Dl(Domainl)和D2(Domain2)两个结构域由Linker相连。最近在线虫[5]紫贻贝[6]，少数真菌和细菌等生物中也发现了一些在结构上类似于植物Expansin的同源蛋白[7_1(1]。细胞壁是棉、麻和纸等纤维素产品的原材料，若能利用膨胀素改善或降解纤维素，将会对清洁降解纤维素生产化工品有重要的意义。但从植物的总蛋白中纯化出单一的Expansin蛋白不仅步骤繁琐难度大而且纯化的量也较为有限，而且植物膨胀素难于在细菌的中大量表达及纯化[11]。这限制了Expansin的应用。番茄的Expansins家族有LeEXP1，LeEXP2，LeEXP3等蛋白，LeEXP2被报道在膨胀、成熟的组织中表达，参与细胞伸长等方面的生理角色[12_13]，但目前尚未用其协同纤维素酶提高纤维素的降解效率。参考文献1MerinoST,CherryJ.Progressandchallengesinenzymedevelopmentforbiomassutilization.AdvBiochemEngin/Biotechnol,2007,108:95-120.2SampedroJ,CosgroveDJ.Theexpansinsuperfamily.GenomeBiology,2005,6(12):1-11.3CosgroveDJ.Looseningofplantcellwallsbyexpansins.NATURE,2000,407(21):321-326.4CosgroveDJ,BedingerP,DurachkoDM.GroupIallergensofgrasspollenascellwalllooseningagents.PNASUSA,1997,94:6559-6564.5QinL,KudlaU,RozeEH,etal.Plantdegradation:anematodeexpansinactingonplants.Nature,2004,427(6969):30.6XuBZ,HellmanU,ErssonB,etal.Purification,characterizationandamino-acidsequenceanalysisofathermostable,lowmolecularmassendo_b_(l，4)-glucanasefrombluemussel,Mytilusedulis.EurJBiochem,2000,267(16)4970-4977.7KerffaF,AmorosoaA,HermanaR,etal.CrystalstructureandactivityofBacillussubtilisYoaJ(EXLXl),abacterialexpansinthatpromotesrootcolonization.PNAS,2008，105(44)16876-16881.8YaoQ,SunTT,IiuWF,ChenGJ.Genecloningandheterologousexpressionofanovelendoglucanase,swollenin,fromTrichodermapseudokoningiiS38.BiosciBiotechnolBiochem,2008,72(11):2799-2805.9LeeHJ,LeeS,KoH,KimKH,ChoiI.AnExpansin-LikeProteinfromHahellachejuensisBindsCelluloseandEnhancesCellulaseActivity.Mol.Cells,2010,29:379-385.10SaloheimoM,PaloheimoM,HakolaS,etal.Swollenin,aTrichodermareeseiproteinwithsequencesimilaritytotheplantexpansins,exhibitsdisruptionactivityoneellulosicmaterials.EurJBiochem,2002,269(17)4202-4211.11KimES,LeeHJ,BangWGetal.FunctionalCharacterizationofaBacterialExpansinFromBacillussubtilisforEnhancedEnzymaticHydrolysisofCellulose.BiotechnologyandBioengineering,2009.12VoglerH,CaderasD,MandelT,KuhlemeieC.Domainsofexpansingeneexpressiondefinegrowthregionsintheshootapexoftomato.PlantMolecularBiology.2003,53:267-272.13ReinhardtD,WittwerF,MandelT,andKuhlemeierC.LocalizedUpregulationofaNewExpansinGenePredictstheSiteofLeafFormationintheTomatoMeristem.ThePlantCell,1998:10,1427-1437.
发明内容本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种LeEXP2提高纤维素酶降解纤维素材料效率的用途。本发明的技术方案概述如下LeEXP2提高纤维素酶降解纤维素材料效率的用途，LeEXP2的氨基酸序列如SEQIDN0.12所示。通过实验证明LeEXP2能协同纤维素酶提高纤维素降解产生还原糖的效率。自然界中有诸多的废弃的木质纤维素，利用LeEXP2蛋白协同纤维素酶降解纤维素避免了现有技术用高温高压和酸碱水解预处理纤维素等方法对环境造成的污染，这对清洁有效的利用废弃的纤维素生产能源，解决当前能源危机具有极其重要的意义。图1为LeEXP2基因的PCR产物凝胶电泳。泳道1所示的DNA标准分子量Marker；泳道2所示的为LeEXP2的PCR产物凝胶电泳结果。图2为含有番茄LeEXP2基因的质粒pGEM_LeEXP2的构建策略图。图3为pTLeEXP2质粒酶切凝胶电泳。图中泳道1为限制性内切酶EcoRI和)(baI双切pTLeEXP2质粒；泳道2为pTLeEXP2质粒对照；M为DNA标准分子量Marker。图4为pPIChlphaA质粒酶切凝胶电泳。图中M为DNA标准分子量Marker，泳道1为pPICZalphaA的EcoRI和XbaI双切产物泳道2为pPICZalphaA质粒对照。图5是将LeEXP2基因构建至巴斯德毕赤酵母表达载体时，转化后得到的重组质粒酶切鉴定结果图中泳道1是质粒对照；泳道2是限制性内切酶EcoRI单切质粒产生的4219bp片段；泳道3是XbaI单切质粒产生的4219bp；泳道4是EcoRI和XbaI双切质粒产生的!3530bp和689bp两个DNA片段；泳道M为DNA标准分子量Marker。图6为LeEXP2基因构建至巴斯德毕赤酵母表达载体的构建策略图。图7为质粒LeEXP2_pPICZalphaA酶切凝胶电泳。图中泳道1为pPICZalphaA-LeEXP2质粒对照；泳道2是质粒pPICZalphaA_LeEXP2的经PmeI单切产生的4219bp的DNA片段；泳道M为Marker。图8为PCR鉴定重组巴斯德毕赤酵母菌株。图中M为Marker；泳道1到9分别对应L7,L9,L10,Lll,L12,L13,L14,L15,L16等菌株的PCR结果；泳道10是用X-33的DNA作为PCR阳性对照扩增产生的2.2kb的片段，泳道11是用水为模板作为PCR阴性对照的结果。图9为不同诱导时间重组菌株L15分泌的总蛋白电泳图。泳道1为蛋白Marker，泳道2-9为重组菌1-8天分泌表达的LeEXP2，泳道10为对照菌株巴斯德毕赤酵母宿主菌X33在第8天分泌的蛋白。具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的说明。实施例1番茄LeEXP2基因的克隆用Trizol试剂按照试剂盒说明提取番茄的总RNA取2ug总RNA，用反转录试剂盒将其反转录成cDNA(Promega公司)，以该cDNA为模板，用序列表中SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示核苷酸序列为上游引物和下游引物进行PCR，扩增出序列表中SEQIDNO.3所示的744bp的LeEXP2基因(见图1)。回收PCR产物，连接至TA载体pGEM_T(Promega公司)得到新的质粒，经测序证实该质粒含有番茄LeEXP2基因，质粒命名为pGEM-LeEXP2，即获得含有番茄LeEXP2基因的质粒pGEM-LeEXP2。构建策略见图2。实施例2LeEXP2基因构建至巴斯德毕赤酵母表达载体以质粒pGEM_LeEXP2为模板，以序列表中SEQIDNO.4所示核苷酸序列为上游引物，以序列表中SEQIDN0.5所示核苷酸序列为下游引物进行PCR扩增，获得序列表中SEQIDN0.6所示的703bp片段，将所述703bp片段与TA克隆载体pGEM_T连接转化大肠杆菌T0P10F'得到的转化子，经鉴定转化子中的质粒是由LeEXP2基因与pGEM-T连接而成，将转化子获得的新质粒命名为pTLeEXP2，并从上述转化子提取质粒pTLeEXP2，并从含有酵母表达载体pPICZalphaA质粒的大肠杆菌中提取pPICZalphaA质粒，用EcoRI和)(bal同时酶切质粒pTLeEXP2和pPIChlphaA；琼脂糖凝胶电泳酶切产物(图3和图4)，经琼脂糖凝胶电泳后回收酶切pTLeEXP2质粒得到SEQIDNO.7所示的689bp片段(图3)和酶切pPICZalphaA质粒得到的SEQIDNO.8所示的3530bp片段(图4)。回收产物连接后转化到大肠杆菌TOPlOF'的感受态细胞中，涂含&0(^11(购自hvitrogen公司)25μg/mL的LB平板，37°C倒置培养12-16h，菌落长至直径为l-2mm；挑选平板上的单克隆，通过菌裂解PCR筛选阳性克隆，提取质粒后用EcoRI和^ChaI酶切验证载体上外源基因的插入单切质粒皆产生片段4219bp，双切质粒皆产生3530bp和689bp片段(图5)，验证结果与预期一致，经测序证实后，命名为pPICZalphaA_LeEXP2，即得到含pPICZalphaA_LeEXP2质粒的大肠杆菌。提取大肠杆菌中pPIChlphaA-LeEXP2质粒，即得到含有番茄LeEXP2基因的重组载体。构建策略见图6。实施例3LeEXP2基因整合至巴斯德毕赤酵母染色体取10-15μgpPICZalphaA_LeEXP2质粒，用PmeI酶切成线性的SEQIDNO.9所示的4219bp片段，电泳检测如图7所示产生4219bp片段，经酚/氯仿抽提后，乙醇沉淀线性SEQIDNO.9所示的线性DNA片段，干燥后溶于无菌水，制成DNA浓度为0.5-1μg/μL线形DNA溶液；参照精编分子生物学实验指南(第四版)(Ρ512-5;3)中的电穿孔转化制备酵母感受态细胞方法制备巴斯德毕赤酵母宿主菌Χ-33的感受态细胞，将80μL巴斯德毕赤酵母宿主菌Χ33的感受态细胞与10μL的0.5-1μg/μL线形DNA溶液混勻后，转移到4°C预冷的电极杯中，冰浴5min，电压1500V，用印pendorf公司的电转仪进行电击，电击5ms，电击后立即加入ImL冰冷的IM山梨醇水溶液到电转杯中，混勻，将混合液转移到15mL离心管中，28-30°C静置培养lh，在含100μg/mL的Zeocin(Invitrogen公司出售)的YPD平板上涂100μL培养后的混合液，30°C倒置培养直至重组菌出现。YPD培养基为酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂18g/L。预冷的电极杯的温度也可以是0-4°C中的任意一值；28-30°C静置培养的时间也可以是1-中的任意一值；在平板上涂培养后的混合液的体积也可以是50μL-200yL中的任意一值。以上实验均可获得含有LeEXP2基因的重组巴斯德毕赤酵母菌。实施例4LeEXP2巴斯德毕赤酵母转化子的PCR鉴定提取实施例3中所获得的重组菌的基因组DNA，以重组菌的基因组DNA为模板，用SEQIDNO.10和SEQIDNO.11所示核苷酸序列为上、下游引物进行PCR，以检测外源DNA的插入，巴斯德毕赤酵母宿主菌X33的染色体基因组DNA为模板的PCR作为阳性对照，以水为模板的PCR作为阴性对照。PCR扩增条件为95°C变性30s，退火30s，72°C延伸3min。PCR产物电泳，如图8所示L7，L9，L10,Lll,L12，L13，L14，L15，L16等菌株皆能扩增出插入到巴斯德毕赤酵母宿主菌X33染色体上的包括LeEXP2基因的1.215kb的片段，以及巴斯德毕赤酵母宿主菌X33的AOXl基因的2.2kb基因片段，说明上述重组菌皆整合有LeEXP2基因。实施例5甲醇诱导巴斯德毕赤酵母转化子的LeEXP2基因表达①接种经实施例4鉴定的含有LeEXP2基因的重组巴斯德毕赤酵母菌L7，L9，L10，Ll1，L12，L13，L14，L15，L16和巴斯德毕赤酵母宿主菌X33分别转接至2ml,pH=4.8的BMGY培养基预培养，220转/分钟，培养至0D_=4；②按1100的体积比分别将步骤①的经预培养的菌液转接至25mlBMGY培养基6中，220转/分钟，29°C培养至OD600=4；③将步骤②培养的菌液分别转接加入至50mlpH=4.8的含体积浓度为0.5%甲醇的BMMY培养基中，使菌液的浓度OD6tltl=1，在220转/分钟，29°C摇床中培养，每24h补甲醇至0.5%，诱导重组菌分泌表达LeEXP2。为检测LeEXP2能有效地表达且将目的蛋白分泌到重组巴斯德毕赤酵母菌的细胞外，从诱导后第1天至8天取重组菌生长的培养基进行蛋白电泳。取样及电泳方式如下取100μ1培养基，离心后，取上清16μ1与4μ1的上样缓冲液混合，沸水煮5分钟后，取12ul电泳。如图9所示，随着诱导时间的增加，目的蛋白LeEXP2分泌的越多(分泌的目的蛋白LeEXP2的氨基酸序列如SEQIDNO.12所示)，而对照菌株巴斯德毕赤酵母宿主菌X33则没有目的蛋白LeEXP2的分泌(图9为不同诱导时间重组菌株L15分泌的总蛋白电泳图)，各个菌株分泌表达的LeEXP2的量也有所差异，其中重组菌L15分泌的重组蛋白LeEXP2的量较大，因此，将重组巴斯德毕赤酵母菌(Pichiapastoris)L15CGMCCNO.4123进行保藏，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2010年8月27日，(见保藏存活证明)。步骤①和②中培养的转速也可以是200-250转/分钟中的任意一值；培养温度也可以是-30°c中的任意一值；培养菌的浓度0D_也可以是2-6中的任意一值。步骤③中BMMY培养基中含甲醇的浓度也可以是0.5%-1%中的任意一值；菌体的浓度0D_也可以是0.8-1.5范围中任意一值；转速也可以是200-250转/分钟中的任意一值；培养温度也可以是-30°C中的任意一值，每24h补甲醇的浓度也可以是0.5%-1%中的任意一值。通过电泳证明这些条件下也可以完成诱导巴斯德毕赤酵母转化子的LeEXP2基因表达。BMGY培养基为酵母提取物，2%蛋白胨，1.34%酵母氮基，IOOmM磷酸钾，乜10-5%生物素，甘油，余量为水。BMMY培养基为酵母提取物，2%蛋白胨，1.34%酵母氮基，IOOmM磷酸钾，4xl0_5%生物素，0.5%-1%甲醇，余量为水。上样缓冲液为15.lg/L的Tris，94g/L甘氨酸；5.Og/L十二烷基硫酸钠(SDS)，余量为水。实施例6LeEXP2提高纤维素酶降解滤纸的效率用实施例5的方法诱导巴斯德毕赤酵母宿主菌X33和重组巴斯德毕赤酵母菌(Pichiapastoris)L15CGMCCNO.4123(简称重组菌L15)，当诱导第六天时，分别取巴斯德毕赤酵母宿主菌X33和重组菌L15分泌表达的培养基2毫升，12000转/分钟离心1分钟后，取1.5ml上清与50mg的新华滤纸条在25ml具塞试管中室温下温浴48h，再加入0.5ml的7U/L纤维素酶(GC220，杰能科公司)液进行反应，50°C水浴Ihr后，每管加入;3mlDNS溶液，沸水浴加热5min，冷却至室温后定容至25ml，测定OD54tl的值，依据葡萄糖的标准曲线来确定释放的葡萄糖的量(葡萄糖标准曲线的测定方法如下分别将2毫升浓度为0，0.5，1，1.5,2.0,2.5,3.0.3.5,4.Omg/ml的葡萄糖溶液与3毫升DNS混勻，沸水浴加热5min,冷却至室温后定容至25ml，测定OD540的值，以浓度为横坐标，以各OD54tl的值为纵坐标绘制标准曲线)。重组菌L15的培养基中含有LeEXP2蛋白，其与纤维素酶作用滤纸产生的还原糖是1.34mg；而对照巴斯德毕赤酵母宿主菌X33的培养基中未有LeEXP2分泌，与纤维素酶作用滤纸产生的还原糖是0.88mg。重组菌L15诱导表达的LeEXP2与纤维素酶协同作用滤纸产7糖是纤维素酶单独作用的1.52倍。所述的DNS试剂成份如下在1升DNS溶液中含IOg的3,5-二硝基水杨酸，IOgNaOH,200g的酒石酸钾钠，2g的苯酚，5g的NaHSO3，余量为水。将重组菌L7，L9，L10,Lll,L12，L13，L14或L16采用本实施例的方法进行上述实验，并证明LeEXP2协同纤维素酶降解滤纸纤维素比纤维素酶单独作用强。该试验说明了LeEXP2能提高纤维素酶降解纤维素材料-滤纸的效率。实施例7LeEXP2提高纤维素酶降解结晶纤维的效率用实施例5的方法诱导巴斯德毕赤酵母宿主菌X33和重组菌L15，当诱导第六天时，分别取毕赤酵母宿主菌和重组菌L15分泌表达的培养基2毫升，12000转/分钟离心1分钟后，取1.5ml上清与50mg的结晶纤维(Sigma公司)在25ml具塞试管中室温下温浴48h，再加入0.5ml的7U/L纤维素酶(GC220，杰能科公司)液进行反应，50°C水浴Ihr后，每管加入;3mlDNS溶液，沸水浴加热5min，冷却至室温后定容至25ml，通过测OD54tl的值来确定释放的葡萄糖的量。重组菌L15的培养基中含有LeEXP2蛋白，其与纤维素酶作用结晶纤维产生的还原糖是8.99mg；而对照毕赤酵母宿主菌X33的培养基中未有LeEXP2分泌，与纤维素酶作用结晶纤维产生的还原糖是6.34mgoLeEXP2与纤维素酶协同作用结晶纤维产糖是纤维素酶单独作用的1.42倍。将重组菌L7，L9，L10,Ll1，L12，L13，L14或L16采用本实施例的方法进行上述实验，并证明LeEXP2协同纤维素酶降解结晶纤维比纤维素酶单独作用强。该试验说明了LeEXP2能提高纤维素酶降解纤维素材料-结晶纤维的效率。实施例8LeEXP2提高纤维素酶降解秸杆的效率用实施例5的方法诱导巴斯德毕赤酵母宿主菌X33和重组菌L15，当诱导第六天时，分别取毕赤酵母宿主菌X33和重组菌L15分泌表达的培养基2毫升，12000转/分钟离心1分钟后，取1.5ml上清与50mg的秸杆粉末在25ml具塞试管中室温下温浴48h，再加入0.5ml的7U/L纤维素酶(GC220，杰能科公司)液进行反应，50°C水浴Ihr后，每管加入3mlDNS溶液，沸水浴加热5min，冷却至室温后定容至25ml，通过测OD54tl的值来确定释放的葡萄糖的量。重组菌L15的培养基中含有LeEXP2蛋白，其与纤维素酶作用秸杆产生的还原糖是8.IOmg；而对照毕赤酵母宿主菌X33的培养基中未有LeEXP2分泌，与纤维素酶作用秸杆产生的还原糖是6.10mg。LeEXP2与纤维素酶协同作用秸杆产糖是纤维素酶单独作用的1.32倍。将重组菌L7，L9，L10,Ll1，L12，L13，L14或L16采用本实施例的方法进行上述实验，结果表明LeEXP2协同纤维素酶降解纤维素材料-秸杆比纤维素酶单独作用强，即LeEXP2能提高纤维素酶降解纤维素材料-秸杆的效率。权利要求1.LeEXP2提高纤维素酶降解纤维素材料效率的用途。全文摘要本发明公开了LeEXP2提高纤维素酶降解纤维素材料效率的用途。通过实验证明LeEXP2能协同纤维素酶提高纤维素降解产生还原糖的效率。自然界中有诸多的废弃的木质纤维素，利用LeEXP2蛋白协同纤维素酶降解纤维素避免了现有技术用高温高压和酸碱水解预处理纤维素等方法对环境造成的污染，这对清洁有效的利用废弃的纤维素生产能源，解决当前能源危机具有极其重要的意义。文档编号C12P19/14GK102071237SQ20101027993公开日2011年5月25日申请日期2010年9月13日优先权日2010年9月13日发明者井欣,张敏华,张鲲,洪解放,皱少兰,马媛媛申请人:天津大学