一种简易纯化核酸的方法

专利名称：一种简易纯化核酸的方法
一种简易纯化核酸的方法技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种简易纯化核酸的方法。
技术背景
随着分子生物学的发展，核酸提取纯化已经成为分子生物学研究的必备工作，疾 病诊断、克隆、测序、扩增、杂交、分析等实验操作的首要步骤就是提取出完整的、高质量的 核酸。为此，人们发展了多种核酸的纯化方法，主要有酚氯仿抽提法、介质吸附等方法。其 中酚氯仿抽提法是最经典的传统方法，这种方法在使用过程中涉及多次离心操作，耗时长、 耗材多，复杂繁琐，不可避免使用挥发性有毒化学试剂，操作繁琐，易导致丢失，纯化质量不 高，对实验人员的技术要求较高。
介质吸附法中最常用的介质为二氧化硅。早在20世纪50年代，人们就知道在有 离液盐存在时核酸能与硅胶可逆结合，Vogelstein直接使用玻璃粉从琼脂糖凝胶中提取得 到DNA，而Marko使用玻璃粉成功提纯质粒DNA。Boom对该方法加以改进，用二氧化硅和硅 藻土为固相吸附剂，用来提取纯化人血清或尿液中的微量病原体基因组DNA。利用硅介质的 形式有两类，一类是颗粒状的，如二氧化硅粒子、玻璃珠等；另一类是柱式的，即介质被预先 装填在离心纯化柱中。目前已有多种商品试剂盒，将硅胶膜填充在离心纯化柱中，采用吸附 原理纯化核酸，该法大大地简化了实验步骤，所得核酸纯度高，试剂盒的成本不高，但由于 试剂盒厂家普遍封锁信息，所以试剂盒产品一般价格不低，提取样品每个成本为3 10元， 进口试剂盒则价格更高。
中国专利89104406. X，分离纯化DNA分子的方法及其装置。该装置包括一个用于 从培养基中分离细胞的离心装置、一个用于使分离细菌和去蛋白的溶液的供应装置、一个 含有分离细胞的溶液的旋转装置和一个从溶液中去除细胞碎片的离心装置。所述的自动化 设备分离是用质粒PUC观转化的大肠杆菌JM 101接种到双倍浓度的5ml肉汤中，在37°C 下培育过夜。培养物转移到离心管内，送到样品贮藏处。必要控制的参数系样品数量、离心 条件和所加各种试剂的数量等输入控制装置。按设备的开关钮，便开始质粒DNA的分离操 作。用传送装置将装有样品的离心管放进离心机转子的预定位置。当离心管预定数量放置 完毕，则按照控制装置的指令以4000rpm(1900g)的速度离心lOmin，以从培养基中分离含 有质粒细菌细胞。后用传送装置将进行离心作用的离心管传送到处理装置。通过倾注弃去 不需要的上清液。传送装置再将装有细菌细胞的离心管放回离心机。把装有50mM的葡萄 糖，IOmM的EDTA和P H为7. 5IOmM的Tris_cl溶液0. 4ml倒入离心管食中，用安装在离心机 上的旋转装置对混合液旋转30秒，使溶液中的细茵细胞悬浮。随后把合有1%SDS的0.2N 的NaoH溶液0. 6ml加到溶液里，用旋转装置在室温下慢慢旋转30秒钟。在这种溶液里加 入由48ml的5M乙酸钾与32ml的冰乙酸混合。另将9. 9ml酚，0. 重量的8-羟基喹啉， 9. 9ml三氯甲烷和0. 2ml异戊醇。这两种溶液混合在一起，从而形成一种PH值为8的稳定 的试剂组合物0. 6ml。用旋转装置在室温下使混合液旋转30秒，然后以4000rpm(1900g)离 心5min。这种旋转和离心步骤重复2-5次，最好是3次。用传送装置将进行离心的离心管4传送到倾注装置，将上清液灌注到事先用传送装置放置好的新的一套离心管中。用传送装 置把装有上清液的离心管放入离心机，并将1. 2ml异丙醇加到管内，使上述管子慢慢旋转。 以4000rpm(1900g)离心^iin即获得沉淀形式的质粒。将装有无用的上清液的离心管转移 到处理装置，用倾注法将上请液从管中除去。装有质粒的离心管被装在离心机上，管内加 入70%的乙醇1. Oml0管子旋转30秒，接着以4000rpm(1900g)离心lmin。用传送装置和 处理装置去掉这些洗涤过程中使用的乙醇。乙醇洗涤再重复3次，以保证完全除去污染物。 通过在装有质粒沉淀的离心管中加入0. 12ml包含IOm M pH 8的Tris_cl缓冲液和ImM的 RDTA的试剂溶液，就可得到质粒溶液。用传送装置按预定顺序将离心管装在离心管存放处。 将该溶液IOul进行凝胶电泳表明存在2. 7Kb的双链质粒DNA。凝胶电泳数据得到的结果与 按本发明方法的上述过程得到的结果相同。使用该发明的自动化设备能以显著更高的产率 分离D N A片段。然而，该发明是大规模用于生产质粒DNA的自动化装置，并不用于科学研 究、检验检测中的核酸提取纯化；第二，没有利用到离心柱方法；第三，使用酚类化学品，处 理流程长，操作复杂。
中国专利200510090184. 6，病毒核酸提取试剂及核酸纯化柱的制备方法。该制备方法是
1、以玻璃纤维深层截流滤膜作为核酸吸附介质，用打孔器制成直径为7mm膜片。 将膜片装入聚苯乙烯材料制各的中空柱体中，压入垫圈，将膜片固定在柱体底部即可。
2、裂解液是一种含盐酸服的变性剂取分析纯盐酸孤(Guaddlne Hy60CNOdde分 子式CH5N3HC1，分子量为95. 53)28克尿素0. 03克，三(羟甲基)氨基甲烷(Tns-HCL)O. 06 克、曲拉通(Tntonx-IOO)IO毫升，然后用蒸馏水20毫升溶解，用盐酸调至PH4即可。促吸 附液是纯异丙醇。去蛋白液是一种含醇和盐酸肌的溶液取盐酸肌23克、三(羟甲基)氨 基甲烷0. 12克，加入15毫升蒸馏水溶解，用盐酸调至PH 6，再加入20毫升95%乙醇即可。 洗涤液是一种含醇和氯化钠的溶液取氯化钠0.1克、三(羟甲基)氨基甲烷0. 025克、加 入20毫升蒸馏水溶解，再加入80毫升95%乙醇即可。洗脱液焦磷酸二乙酪(DEPC)处理 后的蒸馏水经高温灭菌即可。
3、按2制各好试剂后，核酸提取操作按以下方法进行a.裂解病毒在1. 5创离心 管中加入200pl含病毒的血浆，再加入500P1裂解液，混勻，置于70°C温浴lOmin。b.核酸 吸附在离心管中再加入600 μ 1的促吸附液，混勻。移取650 μ 1至纯化柱的柱体中，8000g 离心Imindf纯化柱柱体移入新收集管中。将剩下的650 μ 1裂解物移入纯化柱的柱体中， 8000g离心lmin。将纯化柱柱体移入新收集管中。c.洗涤加入500 μ 1去蛋白溶液，8000g 离心lmin。弃收集管中的液体，将纯化柱柱体移入新收集管中，加入500悍1洗涤液，SOOOg 离心lmin。将纯化柱的柱体移入新收集管中，加入500 μ 1洗涤液，8000g离心lmin。d.核 酸洗脱将纯化柱柱体移入新收集管中。在纯化柱的柱体的玻璃纤维膜中央加入50μ 1洗 脱液，室温静置Imin后，SOOOg离心lmin，收集洗脱液。
4、将含病毒(HIV、HBV及HCV)的血浆5倍梯皮稀释，共6个梯度，用本发明的核酸 提取试剂和纯化柱进行核酸提取，并且用常规的荧光实时定量PCR技术对所提取的核酸进 行病毒载量测定。结果显示，在一定范围内其提取量与初始病毒量具有良好的线性关系，相 关系数为0. 99。
5、将含病毒HIV的血浆用本发明的核酸提取试剂和纯化柱进行核酸提取并且做如下测定a.检测RNA溶液的吸光度(OD)似60/A280 = 1. 8，其比值在RNA纯度的正常质量 范围内。B.根据RNA溶液的吸光度(OD)似60 = 1的溶液其RNA含量约为40 μ g/ml的计算 公式，我们得出本试剂盒纯化柱核酸吸附力为140 μ g。C.对同一含病毒的血浆进行多个提 取，用常规的荧光实时定量PCR技术对所提取的核酸进行病毒载量测定，核酸提取量的变 异系数小于25%。d.试剂盒中的试剂裂解液、促吸附液、去蛋白溶液、洗涤液及洗脱液，置 室温保存，未开封可以保存一年，开封后半年内用完。样品起始量为200 μ 1血清/其它液 体样品，得率大于85%。该专利用于病毒核酸纯化，纯化柱吸附介质为玻璃纤维深层截流滤 膜，需要专门购置，从而带来诸多不便。
李云峰等人发表论文，一种简捷的质粒DNA提取及纯化方法。该质粒提取及纯化 方法用接种提取少量大肠杆菌接种于3ml菌管的IB-AP100液体培养基内，37°C摇床培养过 夜。将菌液分两次收集于1. 5ml的Eppendorf管中，每次离心5min，弃上清液，空干后，加入 100 μ 1溶液I，并加入溶菌酶5 μ 1 (终浓度2. 5mg/ml)，彻底悬浮菌体，静置lOmin，加入溶 液II 200 μ 1，颠耐混勻至溶液清亮，0°C冰浴5min，再加入溶液III 150 μ 1，颠倒混勻，0°C 冰浴15 30min然后IOOOOrpm离心lOmin，取上清液于另一个干净的Eppendorf管中，加2 倍体积预冷的95%的乙醇，-20°C放置20min以上。将其于IOOOOrpm离心lOmin，弃上清液， 用200/xl TES将沉淀彻底溶解.于IOOOOrpm离心lOmin，取上清液于另一个Eppendorf 管 中，加入 2 3ulRNase A (终浓度为 10mg/ml)，37°C作用 30rain 以上，IOOOOtpm离心 IOmin, 弃上清液，沉淀用75乙醇洗涤，用30 40 μ 1 TE回溶，备用。利用质粒提取试剂盒提取质 粒的方法是按本实验提到的方法培养大肠杆菌和提取质粒空干后，依次加入试剂盒内的溶 液I、溶液II、溶液III，然后过柱吸附，最后得到含质粒的溶液30 40 μ 1，备用。经TES 纯化的质粒DNA的获得率与菌体数量和质粒的拷贝数有关.TES是一种低盐溶液，由于ρΗ 值及盐的相互作用，使得TES溶解DNA而不溶解蛋白，因此，经TES处理对质粒DNA精耗较 少。一般来说，对于3ml大肠杆菌对数期菌液，经上步骤提取以后，用30 40μ1 TE回溶 得到质粒DNA样品，在琼脂糖凝胶电泳上点样量仅需2 μ 1就可以看到清晰DNA区带利用这 样样品进行酶切，2 μ 1质粒可以得到较高的转化率。因此该方法是一种简单高效的质粒提 取方法。但该方法是针对质粒DNA提取而言，对植物、动物DNA、RNA提取并不适合，同时，其 没有自制和利用纯化柱。
综上所述，常规的核酸提取方法和已经商品化的核酸提取试剂盒尚存在如下问 题一是价格比较昂贵，不利于科学研究和常规医学检测。二是需要使用酚、氯仿等有毒物 质，不利于环保和操作人员的身体健康。因此，迫切需要研究开发价格便宜、高效、稳定和简 便核酸提取纯化装方法。为此，本发明人在前人的基础上，摸索总结了利用玻璃粉制作简易 离心纯化柱并用于核酸提取纯化的方法。发明内容
本发明为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种适用范围广、成本低、 操作简单、操作时间短、应用性强、便于普及的一种简易纯化核酸的方法。
本发明的技术方案是
利用常见的玻璃碎片研磨成直径为120 130 μ m的粉末，取1.5ml的离心管， 在管底穿几个小孔，然后在离心管内放入一小团棉花，塞到管底压实，再往离心管内加入0. 3 1. Og磨好的玻璃粉末，外面套一个去盖的2. Oml离心管做为收集管，即为简易离心纯 化柱。使用时，在核酸提取液中加入促吸附液，混勻、离心，上清液过简易纯化柱，倒去收集 管废液，然后向柱内加入洗涤液，离心，去掉收集液，将离心柱转到新的收集管，往柱内加入 洗脱液，离心，核酸被洗脱进入收集管，即得纯化核酸。本发明关键在于离心纯化柱得制作、 裂解液、促吸附液、洗涤液的成分以及核酸纯化的方法，适用于植物DNA和RNA、质粒DNA的 提取纯化。
本发明是这样实现的
本简易纯化核酸的方法，包括裂解、促吸附、洗涤和洗脱工序，其特征在于包括纯 化核酸专用的简易纯化柱、裂解液、促吸附液及洗涤液的制备方法、配方和纯化核酸的具体 操作方法，所述的简易纯化柱是采用1. 5ml底部有孔的离心管，管底压实一小团脱脂棉，加 入直径为120 130 μ m的玻璃粉末0.3 l.Og为纯化柱柱体，柱体外面套一个去盖的 2. Oml离心管做为收集管。
以上所述的裂解液，其试剂组成及体积浓度为CTAB 2%, PVP 0 2%、氯化钠 0. 5 2. 0mol/L、LEDTA0· 020 0. 050mol/L、SDS 0 4%、亚精胺 0. 00 0. 05%禾Π Tris 0. 1 0. 2mol/L的混合水溶液，pH值为7. 0 8. 0 ；异硫氰酸胍裂解液的混合水溶液则是 异硫氰酸胍6mol/L、十二烷基肌氨酸钠0. 83% (W/V)和柠檬酸钠42mmol/L ；裂解液中添 加缓冲液醋酸钠0 3mol/L，以冰醋酸调节pH值至4. 0。
以上所述的裂解液，还包括溶液I、溶液II和溶液III。
以上所述的溶液I，其试剂组成及体积浓度为Tris 25mmol/L、EDTA lOmmol/L和 葡萄糖50mmol/L的混合水溶液，pH值为8. 0。
以上所述的溶液II，其试剂组成及体积浓度为氢氧化钠0. 2mol/L和SDS 1% (W/V)的混合水溶液。
以上所述的溶液III，其试剂组成及体积浓度为乙酸钾3mol/L和冰乙酸11. 5% (V/V)的混合水溶液。
以上所述的促吸附液，是体积浓度为5mol/L的氯化钠水溶液。
以上所述的洗涤液，是体积浓度为75%乙醇水溶液。
以上所述的用所是不含核酸酶的双蒸水。
本发明的具体操作方法为
一、裂解
1、待纯化的植物基因组DNA混合液的获得称取约0. 2 0. 4g植物材料，例如飞 机草或花生或山药等，剪碎放到研钵中，加入1.5ml CTAB裂解液或SDS裂解液研磨，其中 CTAB 裂解液包含有CTAB 2%、氯化钠 1. 4mol/L、EDTA 0. 02mol/L 和 Tris 0. lmol/L，pH 值 为 8. 0 ；SDS 裂解液包含有SDS 4%、氯化钠 0. 5mol/L、EDTA 0. 05mol/L、和 Tris 0. 2mol/ L, pH值为7. 2，取Iml研磨液到2ml的离心管中，65°C水浴60min。
2、待纯化的大肠杆菌质粒DNA混合液的获得取1.5ml的大肠杆菌培养物， 12000rpm离心lmin。吸取并弃去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥，将细菌沉淀重悬于 100 μ 1溶液I中，剧烈振荡，加入200 μ 1溶液II，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，该步不 能用力振荡，混勻后，室温放置5min，加入200 μ 1溶液III，盖紧管口，将管倒置，温和振荡 混勻后，室温放置5min。7
3、异硫氰酸胍裂解细胞获得待纯化的植物总RNA混合液把0. 03 0. 06g植物材 料剪碎放到研钵中，加入Iml包含有试剂及体积浓度为异硫氰酸胍6mol/L、十二烷基肌氨 酸钠0. 83% (W/V)和柠檬酸钠42mmol/L的异硫氰酸胍裂解液，研磨，取0. 5ml研磨液转移 到1. 5ml的离心管中，加入100 μ 1缓冲液，混勻，冰上放置5min。
4,CTAB裂解细胞获得待纯化的植物总RNA混合液称取0. 2 0. 4g植物材料剪碎 放到研钵中，加入1. 5mlRNA用含有试剂及体积浓度为CTAB 2%,PVP2%,EDTA 0. 025mol/ L、氯化钠 2. Omol/L、亚精胺 0. 05%和 Tris 0. lmol/L，pH8. 0 的 CTAB 裂解液，研磨，取 Iml 研磨液转移到2ml的离心管中，加入100 μ 1缓冲液，混勻，65°C水浴lOmin。
二、吸附
1、植物基因组DNA的提取往上述所得的待纯化的植物基因组DNA混合液中加入 等体积的促吸附液，混勻，12000rpm离心5min，取上清液。
2、大肠杆菌质粒DNA的提取往上述所得的待纯化的大肠杆菌质粒DNA混合液中 加入2倍体积的促吸附液，混勻，12000rpm离心5min，取上清液。
3、异硫氰酸胍裂解提取植物总RNA 往上述所得的异硫氰酸胍裂解获得的待纯化 植物总RNA混合液加入850 μ 1 DEPC处理水，混勻，12000rpm离心5min，取上清液，加入0. 5 倍体积的无水乙醇，混勻。
4XTAB裂解提取植物总RNA 往上述所得的CTAB裂解获得的待纯化植物总RNA混 合液加入等体积的促吸附液，混勻，12000rpm离心5min，取上清液，加入0. 5倍体积的无水 乙醇，混勻。
将步骤2中所得的各种混合液转移至简易纯化柱的柱体中，静置aiiin，SOOOrpm离 心lmin，倒去收集管内的液体，重复该步操作，直至混合液全部转移完毕。
三、洗涤
往简易纯化柱柱体中加入500 μ 1的洗涤液，8000rpm离心lmin，倒去简易纯化柱 收集管内的液体，重复该步骤1 2次，然后SOOOrpm离心lmin。
四、洗脱
将经洗涤简易纯化柱移到另一干净1. 5ml离心管中，加入50 μ 1经60°C的预热的 洗脱液，静置2min，8000rpm离心lmin，即得纯化的基因组DNA或质粒DNA或植物总RNA。
本发明的优点和积极效果
1、利用本方法提取纯化核酸，适用范围广，可用于基因组DNA、质粒DNA、总RNA提 取纯化，PCR产物回收，0拟60/0D280为1. 7 2. 0，纯度高，完整性好，时间短，提取纯化核酸 所需的时间，从传统方法的几小时缩短至几十min，每提取一个样本成本不超过0. 5元，与 现在常用的核酸提取纯化商业试剂盒相比，能节省成本3 9元，大大地降低了实验成本。
2、本纯化柱装置制作简单，采用常用的EP管、棉花、玻璃粉即可，直接用于核酸纯 化，操作步骤简洁，容易掌握，对实验操作技术要求不高。纯化过程中不用酚、氯仿等有毒物 质，环保节能。


图1 为简易纯化核酸工艺流程示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细说明，实施例仅是对本发明 作出更清楚的说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
植物基因组DNA简易纯化方法
(1)称取0. 3g飞机草叶片植物材料剪碎放到研钵中，加入1. 5ml CTAB裂解液或 SDS裂解液研磨，其中CTAB裂解液包含有CTAB 2%、氯化钠1. 4mol/L、EDTA 0. 02mol/L和 TrisO. lmol/L，pH 值为 8. 0 ；SDS 裂解液包含有SDS 4%、氯化钠 0. 5mol/L、EDTA 0. 05mol/ 1^和 Tris 0. 2mol/L, pH 值为 7. 2。
(2)研磨液转移到anl的离心管中，65°C水浴60min。
(3)加入等体积促吸附液氯化钠5mol/L，混勻，12000rpm离心5min，取上清液。
(4)将上清液转移至准备好的简易离心纯化柱中，静置anin，8000rpm离心lmin， 倒去收集管内的液体，重复该步操作，直至步骤C3)所得上清液全部转移完毕。
(5)往简易纯化柱柱体内加入500μ 1体积浓度为75%的乙醇水溶液洗涤液， 8000rpm离心lmin，倒去收集管内的液体，重复该步1 2次。
(6) 8000rpm 离心 lmin。
(7)将简易纯化柱移到另一干净1. 5ml离心管中，加入50 μ 1经60°C预热不含核 酸酶的双蒸水洗脱液，静置aiiin，8000rpm离心lmin，即得纯化的基因组DNA。
(8)取纯化好的DNA2 μ 1，用1 %琼脂糖凝胶电泳检测。
(9)取100 μ 1 DNA稀释6倍后，用分光光度计测其0D260及0拟80。经计算0拟60/ 0D280 = 1. 78。
(10)根据测定的0D260值，计算出DNA的浓度为217. 5ng/ μ 1。
实施例2
大肠杆菌质粒DNA的简易纯化方法
(1)取1. 5ml含ΡΒΙ121质粒的大肠杆菌JM109培养物，12000rpm离心lmin。吸取 并弃去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。
(2)将所得的细菌沉淀重悬于100 μ 1由试剂及体积浓度为Tris 25mmol/L、 EDTAlOmmo 1/L和葡萄糖50mmol/L组成pH值为8. 0的溶液I中，剧烈振荡。
(3)加入200 μ 1由试剂及体积浓度为氢氧化钠0. 2mol/L和SDS 1 % (W/V)组成 的溶液II中，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，该步不能用力振荡，混勻后，室温放置5min。
(4)加入200 μ 1由试剂及体积浓度为乙酸钾3mol/L和冰乙酸11. 5% (V/V)组成 的溶液III中，盖紧管口，将管倒置，温和振荡混勻后，室温放置5min，12000rpm离心5min， 取上清液。
(5)往所得的上清液中加入2倍体积浓度为5mol/L的氯化钠促吸附液，混勻。
(6)将上述混合物转移到所准备的简易纯化柱柱体中，静置aiiin，SOOOrpm离心lmin，倒去收集管内的液体，重复该步操作，直至步骤( 所得混合物全部转移完毕。
(7)往简易纯化柱柱体中加入500μ 1体积浓度为75%的乙醇水溶液洗涤液， 8000rpm离心lmin，倒去收集管内的液体，重复该步骤1 2次。
(8) 8000rpm 离心 lmin。
(9)将经洗涤简易纯化柱移到另一干净1. 5ml离心管中，加入50 μ 1经60°C预热 不含核酸酶的双蒸水的洗脱液，静置aiiin，8000rpm离心lmin，即得纯化的质粒DNA。
(10)取纯化好的DNA 2 μ 1，用1 %琼脂糖凝胶电泳检测。
(11)取100 μ 1 DNA用不含核酸酶的双蒸水稀释6倍后，用分光光度计测其0拟60 及 0D280。经计算 0D260/0D280 = 1. 81。
(12)根据测定的0D260值，计算出DNA的浓度为180. 6ng/ μ 1。
实施例3
利用异硫氰酸胍裂解细胞提取植物总RNA的简易纯化方法
(1)把0. Ig飞机草叶片植物材料剪碎放到研钵中，加入Iml由试剂及体积浓度异 硫氰酸胍6mol/L、十二烷基肌氨酸钠0.83% (W/V)和柠檬酸钠42mmol/L组成的异硫氰酸 胍裂解液，研磨。
(2)取0. 5ml研磨液转移到1. 5ml的离心管中，加入100 μ 1体积浓度为3mol/L的 醋酸钠缓冲液，用冰醋酸调节PH值至4. 0，混勻，冰上放置5min。
(3)加入850 μ 1 DEPC处理水，混勻，12000rpm离心5min，取上清液。
(4)上清液中加入0. 5倍体积的无水乙醇，混勻。
(5)所得溶液转移到简易纯化柱，静置2min，SOOOrpm离心lmin，倒去简易纯化柱 收集管内的液体，重复该步操作，直至上述的混合物全部转移完毕。
(6)往简易纯化柱柱体中加入500μ 1体积浓度为75%的乙醇水溶液洗涤液， SOOOrpm离心lmin，倒去简易纯化柱收集管内的液体，重复该步骤1 2次。
(7) 8000rpm 离心 lmin。
(8)把简易纯化柱柱体移到另一干净1. 5ml离心管中，往简易离心纯化柱中加入 50 μ 1不含核酸酶的双蒸水的洗脱液，冰上静置aiiin，8000rpm离心lmin，即得纯化的总 RNA。
(9)取纯化好的RNA 2 μ 1，用1 %琼脂糖凝胶电泳检测。
(10)取40 μ 1 RNA用不含核酸酶的双蒸水稀释15倍后，用分光光度计测其0拟60 及 0D280。经计算 0D260/0D280 = 1. 96。
(11)根据测定的0D260值，计算出RNA的浓度为312. Ong/μ L·
实施例4
利用CTAB裂解细胞提取植物总RNA的方法
(1)称取0. 3g飞机草叶片植物材料剪碎放到研钵中，加入1. 5ml RNA用含有试剂 及体积浓度为CTAB 2%, PVP2%, EDTA 0. 025mol/L、氯化钠 2. Omol/L、亚精胺 0. 05%和 Tris 0. lmol/L, pH8. 0 的 CTAB 裂解液，研磨。
(2)取Im研磨液转移到2ml的离心管中，加入100 μ 1体积浓度为3mol/L的醋酸 钠缓冲液，用冰醋酸调节PH值至4. 0，混勻，65°C水溶lOmin。
(3)加入等体积体积浓度为5mol/L的氯化钠促吸附液，混勻，12000rpm离心5min，10取上清液。
(4)在上清液中加入0. 5倍体积的无水乙醇，混勻。
(5)将上述混合液转移至简易纯化柱柱体中，静置aiiin，8000rpm离心lmin，倒去 简易离心纯化柱收集管内的液体，重复该步操作，直至步骤(4)所得混合液全部转移完毕。
(6)往简易纯化柱柱体中加入500μ 1体积浓度为75%的乙醇水溶液洗涤液， SOOOrpm离心lmin，倒去简易纯化柱收集管内的液体，重复该步1 2次。
(7) 8000rpm 离心 lmin。
(8)把简易纯化柱柱体移到另一干净1. 5ml离心管中，往简易纯化柱柱体的中间 加入50 μ 1不含核酸酶的双蒸水的洗脱液，冰上静置aiiin，8000rpm离心lmin，即得纯化的 植物总RNA。
(9)取纯化好的RNA 2 μ 1，用1 %琼脂糖凝胶电泳检测。
(10)取40 μ L RNA用不含核酸酶的双蒸水稀释15倍后，用分光光度计测其0拟60 及 0D280。经计算 0D260/0D280 = 1. 92。
(11)根据测定的0D260值，计算出RNA的浓度为四8. 6ng/y L·
备注提取纯化核酸的纯度和浓度评价方法
1、将提取到的核酸用紫外分光光度计测定样品在^Onm和^Onm的吸光度(0D 值)，根据0拟60/0拟80比值判断核酸的纯度，DNA的比值为1. 8左右，RNA的比值在1. 7 2.0之间时，表示纯度较高。
2、根据测定样品的0D260按以下公式计算所得核酸的浓度
DNA样品的浓度(ng/μ 1) = 0D260X稀释倍数X 50。
RNA样品的浓度(ng/μ 1) = 0D260X稀释倍数X40。
权利要求
1.一种简易纯化核酸的方法，包括裂解、促吸附、洗涤和洗脱工序，其特征在于包括纯 化核酸专用的简易纯化柱、裂解液、促吸附液及洗涤液的制备方法、配方和纯化核酸的具体 操作方法，所述的简易纯化柱是采用1. 5ml底部有孔的离心管，管底压实一小团脱脂棉，加 入直径为120 130 μ m的玻璃粉末0.3 l.Og为纯化柱柱体，柱体外面套一个去盖的 2. Oml离心管做为收集管。
2.根据权利要1所述的简易纯化核酸的方法，其特征在于所述的裂解液，其试剂 组成及体积浓度为CTAB 2%, PVP 0 2%、氯化钠0. 5 2. Omol/L、L EDTA 0. 020 0.050mol/L、SDS 0 4%、亚精胺 0. 00 0. 05%禾口 Tris 0. 1 0. 2mol/L 的混合水溶液， PH值为7. 0 8. 0 ；异硫氰酸胍裂解液的混合水溶液则是异硫氰酸胍6mol/L、十二烷基肌 氨酸钠0. 83% (W/V)和柠檬酸钠42mmol/L ；裂解液中添加缓冲液醋酸钠0 3mol/L，以冰 醋酸调节PH值至4.0。
3.根据权利要1或2所述的简易纯化核酸的方法，其特征在于所述的裂解液还包括 溶液I、溶液II和溶液III ；所述的溶液I，其试剂组成及体积浓度为Tris 25mmol/L、EDTA lOmmol/L和葡萄糖 50mmol/L的混合水溶液，pH值为8. 0 ；所述的溶液II，其试剂组成及体积浓度为氢氧化钠0.2mol/L和SDS 1% (W/V)的混 合水溶液；所述的溶液III，其试剂组成及体积浓度为乙酸钾3mol/L和冰乙酸11. 5% (V/V)的 混合水溶液。
4.根据权利要1所述的简易纯化核酸的方法，其特征在于所述的促吸附液，是体积浓 度为5mol/L的氯化钠水溶液。
5.根据权利要1所述的简易纯化核酸的方法，其特征在于所述的洗涤液，是体积浓度 为75%乙醇水溶液。
6. 根据权利要1所述的简易纯化核酸的方法，其特征在于具体操作方法为(1)裂解a、待纯化的植物基因组DNA混合液的获得称取约0.2 0. 4g植物材料，剪碎放到研 钵中，加入1.5ml CTAB裂解液或SDS裂解液研磨，其中CTAB裂解液包含有CTAB 2%、氯化 钠 1. 4mol/L、EDTA 0. 02mol/L禾口 Tris 0. lmol/L，pH值为 8. 0 ；SDS裂解液包含有=SDS 4%, 氯化钠 0. 5mol/L、EDTA 0. 05mol/L、禾口 Tris 0. 2mol/L，pH 值为 7. 2，取 Iml 研磨液到 2ml 的 离心管中，65°C水浴60min ；b、待纯化的大肠杆菌质粒DNA混合液的获得取1.5ml的大肠杆菌培养物，12000rpm 离心lmin，吸取并弃去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥，将细菌沉淀重悬于100 μ 1溶液I 中，剧烈振荡，加入200μ 1溶液II，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，该步不能用力振荡，混 勻后，室温放置5min，加200 μ 1溶液III，盖紧管口，将管倒置，温和振荡混勻后，室温放置 5min ；c、异硫氰酸胍裂解细胞获得待纯化的植物总RNA混合液把0.03 0. 06g植物材料 剪碎放到研钵中，加入Iml包含有试剂及体积浓度为异硫氰酸胍6mol/L、十二烷基肌氨酸 钠0. 83% (W/V)和柠檬酸钠42mmol/L的异硫氰酸胍裂解液，研磨，取0. 5ml研磨液转移到.1.5ml的离心管中，加入100 μ 1缓冲液，混勻，冰上放置5min ；d、CTAB裂解细胞获得待纯化的植物总RNA混合液称取0. 2 0. 4g植物材料剪碎放到 研钵中，加入1. 5mlRNA用含有试剂及体积浓度为CTAB 2%,PVP2%,EDTA 0. 025mol/L、氯 化钠2. Omol/L、亚精胺0. 05%和Tris 0. lmol/L，pH值为8. 0的CTAB裂解液，研磨，取Iml 研磨液转移到2ml的离心管中，加入100 μ 1缓冲液，混勻，65°C水浴IOmin ；(2)吸附a、植物基因组DNA的提取往上述所得的待纯化的植物基因组DNA混合液中加入等体 积的促吸附液，混勻，12000rpm离心5min，取上清液；b、大肠杆菌质粒DNA的提取往上述所得的待纯化的大肠杆菌质粒DNA混合液中加入 2倍体积的促吸附液，混勻，12000rpm离心5min，取上清液；c、异硫氰酸胍裂解提取植物总RNA往上述所得的异硫氰酸胍裂解获得的待纯化植物 总RNA混合液加入850 μ 1 DEPC处理水，混勻，12000rpm离心5min，取上清液，加入0. 5倍 体积的无水乙醇，混勻；d、CTAB裂解提取植物总RNA往上述所得的CTAB裂解获得的待纯化植物总RNA混合液 加入等体积的促吸附液，混勻，12000rpm离心5min，取上清液，加入0. 5倍体积的无水乙醇， 混勻；将步骤O)中所得的各种混合液分别转移至简易纯化柱的柱体中，静置aiiinjOOOrpm 离心lmin，倒去收集管内的液体，重复该步操作，直至混合液全部转移完毕；(3)洗涤往简易纯化柱柱体中加入500 μ 1的洗涤液，SOOOrpm离心lmin，倒去简易纯化柱收集 管内的液体，重复该步骤1 2次，然后8000rpm离心Imin ； 、洗脱将经洗涤简易纯化柱移到另一干净1. 5ml离心管中，加入50 μ 1经60°C的预热的洗脱 液，静置2min，8000rpm离心lmin，即得纯化的基因组DNA或质粒DNA或植物总RNA。
全文摘要
本发明公开了一种简易纯化核酸的方法，包括裂解、促吸附、洗涤和洗脱工序，其特征在于纯化核酸专用的简易纯化柱、裂解液、促吸附液和洗涤液的制备方法和使用方法，简易纯化柱是采用1.5ml底部有孔的离心管，管底压实一小团脱脂棉，加入直径为120～130μm的玻璃粉末0.3～1.0g为纯化柱柱体，柱体外面套一个去盖的2.0ml离心管做为收集管，制作简单，采用常用的EP管、棉花、玻璃粉即可，适用范围广，直接用于基因组DNA、质粒DNA、总RNA提取纯化，PCR产物回收离心纯化，操作步骤简洁，容易掌握，对实验操作技术要求不高，纯化纯度高、完整性好，纯化时间短，实验成本低，纯化过程中不用酚、氯仿等有毒物质，环保节能。
文档编号C12N15/10GK102031249SQ201010279800
公开日2011年4月27日 申请日期2010年9月14日 优先权日2010年9月14日
发明者何海旺, 何龙飞, 李创珍 申请人:广西大学