专利名称：一种修复石油污染盐碱土壤的微生物复合菌剂的制作方法
技术领域：
本发明属于环境保护技术领域，涉及一种适用于石油污染盐碱土壤修复的微生物复合菌剂及其制备方法。
背景技术：
我国大庆油田、大港油田、胜利油田等多个油田的土壤因其特定的地质条件和不合理的人类活动均有不同程度的盐碱化。在石油开采和油井施工作业过程中，易造成石油烃泄漏，污染土壤。盐碱土壤本身土壤理化性质差，石油污染进一步恶化了盐碱土壤理化性质，对土壤微生物造成显著胁迫，干扰土壤物质循环。此外，石油中含有的多环芳烃等污染物具有“三致”效应，具有较高的生态风险，对人类健康具有潜在威胁。因此，石油污染盐碱土壤的修复是一项紧迫任务。然而目前的土壤修复方法大多集中在石油或者盐碱单一胁迫方面，针对石油和盐碱复合胁迫下的土壤修复制剂罕见报道。目前，石油污染土壤的修复方法主要有萃取法、淋洗法、堆肥法、植物修复法、微生物修复法等。微生物由于具有繁殖能力强、适应性强、降解谱广等优点，常用于清除有机污染物；从土壤环境中筛选出来的土著石油降解菌也常用于石油污染土壤的修复。例如 中国专利O00410038053. 9)公开了一株可以降解石油烃的短短芽孢杆菌Brevibacillus brevis HTCGMCC No. 1142;中国专利(200710059755. 9)公开了一株低温解烃的极小单胞菌PUSillim0nassp.T7-7。除此以外，目前报道的可以降解石油烃、修复石油污染土壤的微生物还有假单胞菌(Pseudomonas sp.)、棒杆菌(Corynebacterium sp·)、微球菌 (Micrococcus sp.)、产碱杆菌(Alcaligenes sp.)、芽孢杆菌(Bacillus sp·)、无色杆菌 (Achromobacter sp.)、诺卡氏菌(Nocardiasp.)，等等。从土壤中分离筛选高效石油烃降解菌，特别是适应特定土壤环境的降解菌，仍是石油污染土壤修复的研究热点之一。通常情况下，石油烃降解菌不太适应盐碱土壤环境，盐碱胁迫影响其降解效果的发挥。从石油污染盐碱土壤中分离得到的耐盐碱的石油烃降解菌，比较适应盐碱土壤环境，可以在高盐碱条件下高效地降解石油烃。表面活性剂对石油等疏水性有机污染物具有较好的分散效果，增大石油与微生物的接触面积，提高微生物对石油烃的降解效果，在石油污染土壤的修复中具有广阔的应用前景。如中国专利O00910027359. 7)公开了一种产脂肽短小芽孢杆菌Bacillus pumilus Y8A，该菌株能高效稳定的产生脂肽类表面活性剂，有效促进石油的生物降解过程；中国专禾Ij (200710055897. 8)公开了一种采用降解菌 Rhodococcus erythropolis 禾口 Pseudomonas aeruginosa修复石油污染土壤的方法，该方法通过添加表面活性剂促进微生物降解石油。在修复过程中，氮磷等营养元素的添加可以增强土壤微生物的代谢活性，进而促进土壤中石油的降解。如中国专利O00710060166. 2)公开了一种应用于石油污染修复的缓释肥料。该肥料由颗粒状氮肥、磷酸二氢钙、微量元素等组成，可以缓慢释放养分维持菌体生长，提高石油污染修复的效率。盐碱土壤中营养元素较少，土壤肥力低，微生物活性差， 不利于石油烃的降解。施加氮肥和磷肥可以弥补盐碱土壤这一缺陷。特别是施加磷酸二氢钾、硫酸铵等酸性肥料，还可以中和土壤碱性，降解土壤PH值，改善土壤理化性质。
发明内容
针对目前石油污染盐碱土壤修复中的问题，本发明提供一种适用于修复石油污染盐碱土壤的微生物复合菌剂，可以快速有效地修复石油污染盐碱土壤。本发明所使用的菌株是由发明人从石油污染的盐碱土壤中分离筛选出来的3株高效降解石油烃且耐盐碱的细菌，于2010年10月25日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。菌株包括巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)P9菌株(保藏编号为 CGMCCNo. . 4270)，假单胞菌(Pseudomonas sp. )P4 菌株(保藏编号为 CGMCC No. 4269)和木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans) P2 菌株(保藏编号为 CGMCC No. 4268)。修复石油污染盐碱土壤的微生物复合菌剂是由上述3株细菌的复合微生物菌液、 营养物质和表面活性剂组成。3种组分的重量比例为30 200 1 2 0. 1 1，较好的是80 120 1 2 0.2 05。本发明所述的复合微生物菌液由巨大芽孢杆菌P9、假单胞菌P4和木糖氧化无色杆菌P2组成。各菌株的活菌体重量比例为1 3 1 3 1 3，较好的是1 1.5 1 15 1 2。本发明所述的营养物质由硫酸铵等氮肥和磷酸二氢钾等磷肥组成。氮肥和磷肥重量比例为1 20 1 2，较好的是5 10 1 1.5。本发明所述的表面活性剂由Triton-XlOO和十二烷基磺酸钠组成。2种组分重量比例为1 3 1 3，较好的是1 2 1 2。本发明所述的复合微生物菌液可以由以下方法制备将巨大芽孢杆菌P9、假单胞菌P4和木糖氧化无色杆菌P2菌株分别接入牛肉膏蛋白胨培养基(组分比例为牛肉膏5g、 蛋白胨10g、NaCl 5g、水1000ml, ρΗ7· 0 7· 2，121°C灭菌20分钟)，35 37°C恒温摇床 100 150r/min培养24 48小时。5000r/min离心10分钟，取下层菌体沉淀，用pH7. 0 7. 5的磷酸盐缓冲液(浓度为0. 02 0. lmol/1)洗涤2次。将所得到的菌体沉淀按重量比为1 3 1 3 1 3的比例混合，重悬于与培养基等体积的pH7. 0 7. 5磷酸盐缓冲液(浓度为0. 02 0. lmol/1)中，即可得到复合微生物菌液。将复合微生物菌液、营养物质、表面活性剂按重量比为30 200 1 2 0. 2 0. 5的比例混合即可得到本发明所述的石油污染盐碱土壤的修复材料。本发明以环境生物学为理论依据，针对石油污染盐碱土壤的特性，设计修复材料配方，可以高效地修复石油污染盐碱土壤。本发明具有以下优点①对盐碱土壤中的石油污染具有较高的去除效率；②可以提高盐碱土壤肥力，降低土壤PH值，改善土壤理化性质，提高土壤微生物活性，促进土壤微生物生长繁殖，对环境不造成二次污染；③选用的菌种来自石油污染的高度盐碱化土壤，活性高、抗逆性强，适合盐碱土壤修复。
具体实施例方式以下通过具体实施例阐述本发明，目的在于帮助读者更好地理解本发明的精神实质，但不作为对本发明实施范围的限定。
具体实施方式
如下
实施例 1 将巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)P9、假单胞菌(Pseudomonas sp. )P4和木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)P2菌株分别接入牛肉膏蛋白胨培养基(组分比例为牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaCl 5g、水1000ml,pH7. O 7. 2，121°C灭菌20分钟)，37°C恒温摇床150r/min培养48小时。5000r/min离心10分钟，取下层菌体沉淀，用pH7. O 7. 5的磷酸盐缓冲液(浓度为0. 02 0. lmol/1)洗涤2次。将所得到的菌体沉淀按重量比为1 3 1 3 1 3的比例混合，重悬于与培养基等体积的pH7. O 7. 5磷酸盐缓冲液(浓度为0. 02 0. lmol/1)中，即可得到复合微生物菌液。将复合微生物菌液、硫酸铵、磷酸二氢钾、Triton-XlOO和十二烷基磺酸钠按100 1.5 1 0. 3 0. 3 的比例混合，得到本发明所述的修复石油污染盐碱土壤的微生物复合菌剂。实施例2 按的施加量将制备得到的微生物复合菌剂加入石油污染盐碱土壤中，混合均勻。10天后，测定土壤石油烃含量。烷烃含量由3870mg/kg降至2748mg/kg，下降了；芳香烃含量由79;3mg/g降至605mg/kg，下降了对％。再向石油污染盐碱土壤中加入的微生物复合菌剂，混合均勻。10天后，烷烃含量降至2060mg/kg，20天累计降低了 47% ；芳香烃含量降至507mg/kg，累计降低了 36%。实施例3 按2%的施加量将制备得到的微生物复合菌剂加入石油污染盐碱土壤中，混合均勻。7天后，测定土壤理化性质。烷烃含量由3870mg/kg降至2718mg/kg，下降了 30% ；芳香烃含量由79;3mg/g降至60;3mg/kg，下降了对％。再向石油污染盐碱土壤中加入2%的微生物复合菌剂，混合均勻。10天后，烷烃含量降至1823mg/kg，20天累计降低了 53% ；芳香烃含量降至430mg/kg，累计降低了 46%。
权利要求
1.一种适用于修复石油污染盐碱土壤的微生物复合菌剂，其特征在于，复合菌剂是由微生物复合菌液、营养物质和表面活性剂3种成分组成，3种组分的重量比为30 200 1 2 1 2。
2.权利要求1所述的微生物复合菌剂，其特征在于，选用的菌种于2010年10月25 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101 ；包括巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium) P9 菌株(保藏编号 CGMCC No. · 4270)，假单胞菌(Pseudomonas sp. )P4 菌株 (保藏编号CGMCC No. . 4269)和木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans) P2菌株 (保藏编号 CGMCC No. · 4268)。
3.权利要求1所述的微生物复合菌液，其特征在于，复合微生物菌液由巨大芽孢杆菌 P9、假单胞菌P4和木糖氧化无色杆菌P2的活菌体按照重量比为1 3 1 3 1 3 悬浮与磷酸盐缓冲溶液制成。
4.权利要求1所述的营养物质，其特征在于，由硫酸铵和磷酸二氢钾等混合而成，重量比为1 20 1 2。
5.权利要求1所述的表面活性剂，其特征在于，由Triton-XlOO和十二烷基磺酸钠混合而成，重量比为1 3 1 3。
全文摘要
本发明涉及一种适用于修复石油污染盐碱土壤的微生物复合菌剂及其制备方法，属于环境保护技术领域。它主要由复合微生物菌液、营养物质和表面活性剂3种成分组成。复合微生物菌液是由3株石油烃降解菌，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)P9菌株(保藏编号CGMCC No.4270)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)P4菌株(保藏编号CGMCC No.4269)和木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)P2菌株(保藏编号CGMCC No.4268)，通过液态培养得到的微生物菌体，与营养物混合而成。菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。复合微生物菌液与营养物质、表面活性剂按30～200∶1～2∶0.2～0.5的比例混合，获得微生物复合菌剂。本发明制备的微生物复合菌剂对盐碱土壤中的石油污染具有较高的去除效率；可以同时降低盐碱土壤的pH值，改善土壤理化性质。
文档编号C12N1/00GK102453678SQ20101051929
公开日2012年5月16日 申请日期2010年10月26日 优先权日2010年10月26日
发明者姜丹, 庄国强, 朱永官, 王新新, 白志辉, 韩祯 申请人:中国科学院生态环境研究中心