专利名称：一株桉树内生菌及其在缓解铝毒害中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株桉树内生菌及其用途，更具体地涉及一株桉树内生菌及其在缓解 铝毒害中的应用。
背景技术：
铝是地壳中含量最丰富的金属(约占7%)，是继氧(0)和硅(Si)之后的第三大元 素。近年来由于酸雨污染的加剧，许多作物发生了铝毒害。我国酸雨覆盖面积已经超过国 土面积的30%，土壤中的铝被逐渐的释放出来，严重危害了林木和作物的产量和质量[1_2]。自从上世纪二十年代Hartwell和Pember首次发现Al毒害以来，对铝毒害的研究 已经有九十多年了，但至今铝毒机制尚不是很清除，其主要原因是铝具有很复杂的化学性 质。铝一般形成各种无机或有机物，其化学性质随着土壤PH的变化而发生改变。当土壤溶 液的PH接近中性(PH = 7)时，铝主要以Al (OH)3沉淀的形式存在；在碱性土壤中，铝主要 以铝盐或Al (OH)4-的形式存在，这些物质对植物生长没有多少影响；在酸性土壤中，铝主要 以Al (0H)2 +、A1 (OH)2 + ,Al (H2O)63+和Al3+离子形式存在，而铝离子会对植物产生明显毒害。 因此，在铝毒机制的研究中，主要研究Al3+对植物的毒害[3]。菌根真菌吸收土壤中的养分和水分供植物生长需要，植物为寄生真菌提供真菌必 要的碳水化合物和其它营养物质，它们相互依存共同生存。外生菌根菌主要寄生在植物的 根表面形成一个紧密交错的菌套，在根皮层细胞间形成纵横交错的网络，但它们一般不进 入到细胞内部。绝大多数乔灌木为外生菌根植物。土壤在酸性条件下溶出的大量铝对菌根 有一定程度的伤害，但同时外生菌根对铝毒害也存在一定程度的缓解作用[4_7]。证实能缓解 铝毒害的内生菌方面尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一株桉树内生菌及其在缓解铝毒害中的应用。本发明所述桉树内生菌为青霉QPenicillium sp.)菌株2，所述菌株2的保藏号为 CGMCC No. 4278。该菌株2的分离、纯化包括
A、材料采集野外邓恩桉和尾巨桉植株直径0.5cm以下的根、直径0. 5cm以下的茎段和 成熟叶；
B、消毒叶片消毒采用70%酒精浸泡40s、0.升汞浸泡90s，茎段消毒采用70%酒精 浸泡30s、0. 升汞浸泡60s，根部消毒采用70%酒精浸泡50s、0. 升汞浸泡120s ；
C、分离将经严格表面消毒的野外邓恩桉、尾巨桉植株的根、茎段和成熟叶接入真菌固 体培养基进行内生真菌的繁殖；
真菌固体培养基为改良马丁固体培养基，配方为蛋白胨5. Og/L、酵母浸出粉2. Og/ L、葡萄糖20. Og/L、磷酸氢二钾1. Og/L、硫酸镁0. 5g/L、琼脂14. Og/L、其它为无菌水，pH值 6. 4士0. 2，培养温度为28°C，培养方式为平板培养，培养时间为48h ；D、将分离繁殖出的内生真菌接入平板培养基进行纯化，经过2-3次点接纯化、转接后， 从中选择得到单一菌种，通过桉树接种试验，进一步验证其具有缓解铝毒害的作用后，鉴定 并保存菌种；
点接种纯化将消毒后的接种环轻微点击菌体表面，然后将其点击接种面，该方法较传 统的点植培养法更易控制接种量，从而提高对内生真菌的接种效率与检出率。本发明所述的桉树内生菌的制种方法即内生菌液的制备方法，是将上述的菌株2 接入液体培养基，摇床振荡培养，培养温度为28°C，培养时间48 72h，利用血球计数板计 算菌液浓度，将菌液用超纯水稀释成1. 0-9. OX 106CfU/ml即为成品备用；所述液体培养基 为改良马丁培养基，其中蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾 1. Og/L、硫酸镁0. 5g/L、其它为无菌水、pH值6. 4士0. 2。本发明所述的桉树内生菌的用途，是将所述桉树内生菌接种桉树，用于缓解铝毒 害；具体操作是应用该菌株的菌液，用于林地浇根、组培进入炼苗期前蘸根或组培过程的切 芽阶段转入生根培养基前芽蘸。所述林地浇根是采用5. OX IO6CfuAil菌液，按每株IOOml在林地浇于每株桉树的根际。所述组培进入炼苗期前蘸根是应用该菌株的菌液3. OX IO6CfuAil在组培进入炼 苗期前蘸根l-5min。所述组培过程的切芽阶段转入生根培养基前芽蘸是应用该菌株的菌液 1. OX IO6CfuAil在组培过程的切芽阶段转入生根培养基前，将芽蘸菌液l-5min后接入生根
培养基继续培养。本发明的青霉QPenicillium sp.)菌株2的形态特征如下
在平面培养基上按常规方法培养，观察其形态。培养基的正面其菌落呈灰绿色，背面红 褐色，多个圆形；菌丝体有隔，分生孢子梗和孢子无色，末端生小梗，小梗直立，刷状，单胞， 卵圆形，表面光滑，分生孢子梗自菌丝单个地发生，在顶部附近分枝，形成典型的帚状特征 结构。参照真菌鉴定手册将菌株鉴定为青霉属iPenicillhm)。本发明的青霉(/如iciWi腫sp.)菌株2，已经于2010年10月28日保藏在中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路 1号院3号，保藏编号为CGMCC No. 4278。本发明通过分离筛选出一株桉树内生真菌，证实该菌株对铝毒害的缓解作用和影 响，由于我国大面积土壤受到酸雨的危害，铝毒害越来越严重，通过内生真的菌接种来提高 植株抗铝毒的能力是一种新的方法，为降低对桉树的铝毒害开辟了一条新途径。
图1为两种处理的桉树过氧化物酶活性变化图； 图2为两种处理的桉树丙二醛含量变化图3为两种处理的桉树游离脯氨酸含量变化图； 图4为两种处理的桉树植株铝含量变化图。
具体实施例方式实施例1
1菌液制备
本发明菌株2的分离、纯化包括
A、材料采集野外邓恩桉和尾巨桉植株直径0.5cm以下的根、直径0. 5cm以下的茎段和 成熟叶；
B、消毒叶片消毒采用70%酒精浸泡40s、0.升汞浸泡90s，茎段消毒采用70%酒精 浸泡30s、0. 升汞浸泡60s，根部消毒采用70%酒精浸泡50s、0. 升汞浸泡120s ；
C、分离将经表面消毒的野外邓恩桉、尾巨桉植株的根、茎段和成熟叶接入真菌固体 培养基进行内生真菌的繁殖；所述真菌固体培养基为改良马丁固体培养基，配方为蛋白 胨5. Og/L、酵母浸出粉2. Og/L、葡萄糖20. Og/L、磷酸氢二钾1. Og/L、硫酸镁0. 5g/L、琼脂 14. Og/L、其它为无菌水，pH值6. 4士0. 2，培养温度为28°C，培养方式为平板培养，培养时间 为 48h ；
D、将分离繁殖出的不同种类的内生真菌接入平板培养基进行纯化，经过2-3次点接纯 化、转接后得到单一菌种的上述的Penicillium sp.功能菌株；
点接种纯化将消毒后的接种环轻微点击菌体表面，然后将其点击接种面，该方法较传 统的点植培养法更易控制接种量，从而提高对内生真菌的接种效率与检出率。菌液的制备方法如下将上述的菌株2接入液体培养基，摇床振荡培养，培 养温度为28°C，培养时间48h，利用血球计数板计算菌液浓度，将菌液用超纯水稀释成 5.0X106cfu/ml即为成品备用；所述液体培养基为改良马丁培养基，其中蛋白胨5.0g/ L、酵母浸出粉2. 0g/L、葡萄糖20. 0g/L、磷酸氢二钾1. 0g/L、硫酸镁0. 5g/L、其它为无菌水、 pH 值 6. 4 士 0. 2。2试验材料和方法 试验设计
试验所用材料为福建省林科院组培中心的尾巨桉3229号无性系组培苗。根据试 验需要选择营养条件良好且生长一致的苗木。由于营养液培养试验可以控制植物生长所需的全部营养物质，该方法被应用于植 物营养科学研究的各个领域。营养液采用Hoagland不完全营养液配方[8]。将试验材料的 幼苗清洗干净，并用蒸馏水冲洗3次，然后将幼苗根系浸泡在菌液当中，放置30min，用蒸馏 水清洗3次，最后将幼苗转入营养液中。空白对照中用水代替菌液浇施。铝胁迫试验设置 3个铝离子处理水平，分别为0、50剛、100剛，在每个溶液中加入等量的CaCl2[9](表1)。
表1 试验设计
Tab. 1 Experimental design铝离子浓度 50MI AlClz IOCM AlCl: 0. 5 ni CaCl
0, 5 mM CaCl； 0. 5 mH CaCl；
CAL)
CK 菌种2
CK-I AD-I
CK-2 AD-2
AD-
水培试验容器采用直径为20cm，体积3L的塑料小桶。使用前将塑料桶用黑色油漆涂 成黑色，漆2 3层，确保四面不透光(模拟土壤环境)。将塑料桶清洗干净，在桶盖上打 三个小孔，并将桶的边缘剪开，以便于苗木的放入，桶内盛有营养液。桶盖中央打1个大孔， 用于放入通气管道。苗木放入塑料桶前，用蒸馏水清洗干净根部，并吸干水分。装桶前测量 苗木株高，地径，尽量使植株保持大小均衡。每桶定植3株。定植后利用氧气泵每天7:00、 15 00、23 00给苗木通气30min，每隔3天更换一次营养液。在初始培养10天后，为避免铝离子与营养液中的磷酸盐形成沉淀物，根据谢国生 等_的方法修改后进行Al间隔处理将苗木根系浸泡于含ΙΟΟμΜ AlCl3的0. 5 mM CaCl2 溶液(pH4. 5 )和50μΜ AlCl3的0. 5 mM CaCl2溶液(pH4. 5 )中，处理一天，与此同时，对 照的根系置于0.5 mM CaCl2溶液(pH 4.5 )中，第二天将Al间隔处理和对照的根系置于 Hoagland营养液中培养一天，然后再进行Al间隔和对照的CaCl2处理，如此交叉处理10天 后，测量各项生理生化指标过氧化物酶(SOD)含量、超氧化物酶(POD)含量、丙二醛含量测 定、游离脯氨酸含量。收获植物，将其分为地上部和地下部，称量其鲜重，70°C烘干。小型粉 碎机将烘干样品磨细用于测定其中的Al含量。过氧化物酶含量分析
现有技术表明铝可以诱导植物产生大量的H202、02_、一 OH等活性氧，从而使核酸、膜脂 和蛋白质等生物分子过氧化而受到伤害，破坏细胞的代谢活动[11_12]。目前虽然植物对铝毒 的忍耐机制还不是很清楚，但很多研究表明，铝对植物的最初表现都是体现在细胞膜上，细 胞膜的过氧化程度与植株的铝抵抗力密切相关[13_14]。另一方面，当植株收到铝毒害时，植物 体内将产生一些抗氧化酶(如过氧化物酶，过氧化氢酶和超氧化物歧化酶)和非酶类物质 (如脯氨酸和抗坏血酸等)[15_16]。由此可见，植物对铝胁迫的耐性与它们的抗氧化能力密切 相关，通过研究植株在铝胁迫过程中抗氧化物酶和非酶类物质含量的变化可以揭示植株对 铝胁迫的耐受力[17]。如图1所示，随着低铝胁迫的加深，植株过氧化物酶的含量呈现上升或者先上升 后下降的趋势。与对照处理CK相比较，菌种处理的植株的过氧化物酶含量增加了 53. 11%。 这表明植株随着铝胁迫的加强，过氧化物酶含量呈现上升的趋势，植株体内的自我保护系 统启动，过氧化酶起着清除体内过多氧化自由基的作用，保护细胞膜不受伤害。菌种处理的 植株过氧化酶含量与对照相比呈现明显差异，这表明内生菌接种对提高植株抗铝胁迫起到 了一定作用。丙二醛含量分析
6随着低铝胁迫的加深，植株丙二醛的含量呈现上升的趋势(图2)。与对照处理CK相比 较，菌种处理的植株的丙二醛含量减少了 48. 33%。这表明植株由于受到铝毒害的作用，丙 二醛含量增加，对细胞膜系统形成了一定程度的伤害。但由于菌种的接种，植株在一定程度 减弱了丙二醛的伤害，起到保护植株的作用。可见，在铝胁迫下，一方面由于铝离子刺激植物产生更多的自由基，使膜脂过氧 化，导致体内MDA含量的增加；另一方面，刺激了植物体内的保护酶系统反应，使保护酶活 性增强，加快清除过多的自由基，减轻膜脂过氧化程度，降低了体内的MDA含量。当这两个 方面达到一个平衡状态，植物不体现出伤害症状。游离脯氨酸含量分析
脯氨酸(Pro)作为一种有机溶剂，广泛存在于植株体内。脯氨酸一般被看作细胞渗透 调节物质，植物体内游离氨基酸可以增加细胞液的浓度，对原生质形成保护作用。游离脯氨 酸也能促进蛋白质的水合作用，使蛋白质胶体的亲水面积增大，能使可溶性蛋白质含量增 多。它能维持细胞结构、渗透调节和物质运输等[18]。它的增加有助于细胞或组织的保水， 同时还可作为碳水化合物的来源，酶和细胞结构的保护剂，可以防止活性氧对膜脂和蛋白 质的过氧化作用[19]。汤章城_的研究认为脯氨酸主要有两个来源，一是鸟氨酸，二是谷氨 酸。逆境胁迫使脯氨酸增加的原因主要因为氧化受抑、合成受刺激和蛋白质合成受阻。而 植物体内脯氨酸的用处主要有参与蛋白质合成或被氧化。随着低铝胁迫的加深，植株游离脯氨酸的含量呈现先上升后下降的趋势(图3)。与 对照处理CK相比较，菌种处理的植株的游离脯氨酸含量增加了 50.84%。菌种处理的植株 脯氨酸含量与对照相比具有明显的区别，这表明菌种处理的植株内在生理生化特性产生了 一定程度的变化，在一定程度提高了植株的抗性。叶绿素含量分析
菌种处理的植株的总叶绿素含量增加了 34.33%。菌种处理的植株叶绿素含量与对照 相比有一定程度的增加，这表明经过菌种在一定程度上保护了植株组织不受铝毒害，延缓 了叶绿素体组织受到的伤害。植株铝含量分析
在铝胁迫下，一些耐铝植物的根系会分泌有机酸[21_22]。这些有机酸与铝离子形成有机 鳌合物，毒性较低，从而达到降低铝离子浓度的作用[23]。随着低AL胁迫的加深，植株体内AL的含量逐渐增加(图4)。与对照处理CK相比 较，菌种处理的植株的铝含量分别减少了 74. 52%。菌种处理的植株体内铝含量与对照相比 具有显著的区别，这表明菌种对植株铝的吸收产生一定程度的调控。生物量分析
植株总生物量分析，与对照处理CK相比较，菌种处理的植株的生物量增加了 34. 72%。 这表明菌种处理的植株与对照相比，由于内在生理特征在一定程度上抑制了铝离子产生的 毒害，从而达到促进植株正常生理特征的目的，因此植株的生物量与对照相比得到一定程 度的增加。结果分析
综上所述，接种菌株2后植株各方面生理指标均体现出一定程度的抵御铝毒害的能 力。今后可以考虑将其推广应用于现实生产中。
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权利要求
一株桉树内生菌，其特征在于所述桉树内生菌为青霉(Penicillium sp.)菌株2，保藏号为CGMCC No.4278。
2.如权利要求1所述的桉树内生菌的制种方法，其步骤包括，将菌株2接入液体培养 基，摇床振荡培养，培养温度为28°C，培养时间48 72h，利用血球计数板计算菌液浓度，将 菌液用超纯水稀释成1. 0 9. OX 106cfu/ml。
3.根据权利要求2所述的桉树内生菌的制种方法，其特征在于所述液体培养基为 改良马丁培养基，其中蛋白胨5. Og/L、酵母浸出粉2. Og/L、葡萄糖20. Og/L、磷酸氢二钾 1. Og/L、硫酸镁0. 5g/L、其它为无菌水、pH值6. 4士0. 2，培养温度为28°C，200rpm/min振荡 培养，培养时间为48h。
4.如权利要求1所述的桉树内生菌在缓解铝毒害中的应用。
全文摘要
本发明提供了一株青霉菌株及其用途，所述桉树内生菌为青霉(Penicilliumsp.)菌株2，保藏号为CGMCC No.4278。将所述桉树内生菌接种桉树，能缓解桉树铝毒害。本发明通过分离筛选出一株桉树内生真菌，证实该菌株对铝毒害的缓解作用和影响，由于我国大面积土壤受到酸雨的危害，铝毒害越来越严重，通过内生真的菌接种来提高植株抗铝毒的能力是一种新的方法，为降低对桉树的铝毒害开辟了一条新途径。
文档编号C12N1/14GK101974437SQ20101054896
公开日2011年2月16日 申请日期2010年11月18日 优先权日2010年11月18日
发明者吴承祯, 洪伟, 谢安强 申请人:福建农林大学