专利名称：一种超氧化物岐化酶的制备方法
技术领域：
本发明涉及广泛存在于生物体内的金属酶的制备方法，尤其是一种超氧化物岐化 酶的制备方法。
背景技术：
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，简称SOD)，是一类广泛存在于生物 体内的金属酶，能够催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，平衡机体内的氧自由基，己成为 化学及生物化学研究领域中热门的研究课题。作为生物体内超氧阴离子自由基的清洁剂， SOD在防辐射、抗衰老、消炎、抑制肿瘤和癌症、自身免疫治疗等方面显示出独特的功能，在 医学、食品、化妆品等领域得到越来越多的应用。因此对于SOD的需求量也越来越大。到现在为止，人们已从细菌、原生动物、藻类、霉菌、植物、昆虫、鸟、鱼类和哺乳动 物等生物体内分离得到S0D，因此现在工业上人们提取SOD的来源也比较广泛，包括了动 物，植物和多种微生物。由于微生物容易培养，来源不受限制，因此相在人们更青睐于利用 微生物制备S0D。但细菌酶在基因表达后缺乏真核生物的修饰步骤，因此在实践中应用没有 真核生物来源的S0D对人类健康生活效果明显。
发明内容
本发明应用一种丝状真菌作为S0D的生产菌，在菌生长达到平台期后，加大通氧 量面诱导S0D大量表达。具体过程如下
一种超氧化物岐化酶的制备方法，包括种子培养、紫红曲发酵、菌体破碎、粗酶获得及 酶精制，具体为菌体的培养，然后高通氧诱导酶表达，均质机破除菌体，70%硫酸铵沉淀， Sephdex G-25胶盐，制得超氧化物岐化酶。所述种子培养采用丝状真菌，菌种保藏号为CGMCC 3. 5833。所述紫红曲发酵为在28°C条件下培养紫红曲，菌体生长到达平台期后，加大通氧 量30-50% 2-4小时，使酶表达，然后收集，得到培养菌液
所述培养菌液过滤后，经均质机破除菌体，加入PH 5. 5-6. 5的0. 05 mol/L的Tris缓 冲液，于4-10度快速振荡10分钟，让酶液完全与残余菌体分离溶解于缓冲液中，过滤去除 菌体，上清液加入硫酸铵使最终浓度达到70%，搅拌2小时使酶沉淀，离心，得到粗酶。所述粗酶经S印hdex G-25柱层析，分步收集，得超氧化物歧化酶。所述超氧化物歧化酶用奈氏试剂检测脱盐的S0D酶液，用NBT光化还原法测定S0D 活性。奈氏试剂的配制
将log碘化汞和7g碘化钾溶于10ml水中，另将24. 4g氢氧化钾溶于内有70ml水的 100ml容量瓶中，并冷却至室温。将上述碘化汞和碘化钾溶液慢慢注入容量瓶中，边加边摇 动。加水至刻度，摇勻，放置2天后使用。试剂应保存在棕色玻璃瓶中，置暗处。硫酸铵测定
3配制已知浓度标准硫酸铵溶液；以此系列硫酸铵溶液中加入奈氏试剂在420nm处比 色，绘制标准曲线，以此为基础，得出待测液中硫酸铵含量。
NBT光化还原法测定SOD活性
在盛有3 mL反应混合液的试管中，加入适量SOD酶液，混勻后放在试管架上。5500光 照度下照光15 min后，取出试管，采用UV2755B紫外分光光度计迅速测定OD56tl值。以不 加酶液(用相同体积的缓冲液代替)的反应液试管照光为最大还原管，不照光的作空白管。 SOD活性计算，以能抑制NBT光还原反应50%的酶量为1个酶活单位(U)，酶活性以U/ mg蛋白表示，按公式SOD活性=[(ODmax - OD560 ) /ODmaJ / [ (50 %) X 3 mL反应混合液中加 入的蛋白质的量(mg)]计算酶活。本发明相对于目前技术来说具有酶表达量及回收率高，节省能源，降低成本。
图1是紫红曲生产制备SOD工艺路线图
具体实施例方式
为了更好的说明该专利，下面结合实施案例，对本发明作详细说明。实施例1
(1)种子培养
配制种子培养基(葡萄糖30 g、豆粉20 g、甘油70 g、蛋白栋2 g、NaNO3 2 g、MgSO4 1 g、水1000 mL) 300 mL，置于1000 mL三角瓶中，在1. lkg/cm2压力下灭菌30分钟，然后 按10% (ν/ν)接种pH3-5的吐温洗下的紫红曲(ifoaasc^s purpureus Went.，菌种保藏号 为CGMCC 3. 5833)斜面的培养物菌悬液。于28°摇瓶200转/分钟培养3_4天。(2)紫红曲发酵
发酵培养基为以下成份比例组成马铃薯浸取液1000 mL、葡萄糖20 g，自然pH。取 去马铃薯200克，切成小块，加水1. 0升煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液补足至1. 0升。取上述培养基3 L放入5 L发酵罐，在1. lkg/cm2压力下灭菌30分钟。把上述培 养种子液按10% (ν/ν)接种，搅拌速度为300 rpm，通氧量为2升/分钟，培养3天后，将通 氧量提高30%，达到2. 6升/分钟，再培养2小时。(3)菌体破碎
终止发酵，所得到培养菌液经过四层沙布过滤收集到菌体，经均质机破除菌体，加入PH 5. 5的0. 05 M的Tris缓冲液，于4°快速振荡10分钟，让酶液完全与残余菌体分离溶解于 缓冲液中。(4)粗酶获得
过滤去除菌体，上清液加入硫酸铵使终浓度达到70%，搅拌2小时使酶沉淀，离心，得到 粗酶。(5)酶精制
上述得到粗酶溶解于最少量的0. 05mol/L Tris缓冲液(pH 5. 5)中，经Sephdex G-25 柱层析，分步收集，用奈氏试剂检测脱盐的SOD酶液中硫酸铵含量，用NBT光化还原法测定 SOD活性。得到的酶喷雾干燥，得到酶蛋白质10. 2 g，测得酶比活为1250 U /g。
权利要求
一种超氧化物岐化酶的制备方法，其特征是包括种子培养、紫红曲发酵、菌体破碎、粗酶获得及酶精制，具体为菌体的培养，然后高通氧诱导酶表达，均质机破除菌体，70%硫酸铵沉淀，Sephdex G 25胶盐，制得超氧化物岐化酶。
2.根据权利要求1所述的超氧化物岐化酶的制备方法，所述种子培养采用丝状真菌， 菌种保藏号为CGMCC 3. 5833。
3.根据权利要求1所述的超氧化物岐化酶的制备方法，其特征是所述紫红曲发酵为 在28°C条件下培养紫红曲，菌体生长到达平台期后，加大通氧量30-50% 2-4小时，使酶表 达，然后收集，得到培养菌液。
4.根据权利要求3所述的超氧化物岐化酶的制备方法，其特征是所述培养菌液过滤 后，经均质机破除菌体，加入PH 5. 5-6. 5的0. 05mol/L的Tris缓冲液，于4-10°快速振荡 10分钟，让酶液完全与残余菌体分离溶解于缓冲液中，过滤去除菌体，上清液加入硫酸铵使 最终浓度达到70%，搅拌2小时使酶沉淀，离心，得到粗酶。
5.根据权利要求4所述的超氧化物岐化酶的制备方法，其特征是所述粗酶经 Sephdex G-25柱层析，分步收集，得超氧化物歧化酶。
6.根据权利要求5所述的超氧化物岐化酶的制备方法，其特征是所述超氧化物歧化 酶用奈氏试剂检测脱盐的SOD酶液，用NBT光化还原法测定SOD活性。
全文摘要
本发明涉及广泛存在于生物体内的金属酶的制备方法，尤其是一种超氧化物岐化酶的制备方法。包括种子培养、紫红曲发酵、菌体破碎、粗酶获得及酶精制，具体为菌体的培养，然后高通氧诱导酶表达，均质机破除菌体，70%硫酸铵沉淀，SephdexG-25胶盐，得到超氧化物岐化酶产品。本产品相对于目前技术来说具有酶表达量及回收率高，节省能源，降低成本。
文档编号C12R1/645GK101974497SQ20101054883
公开日2011年2月16日 申请日期2010年11月18日 优先权日2010年11月18日
发明者周国富, 许晓东, 郭锋利 申请人:苏州邦安新材料科技有限公司