专利名称：一种多级固定化酶膜反应装置及利用其制备酪蛋白磷酸肽的方法
技术领域：
本发明涉及酪蛋白磷酸肽的制备装置与方法，具体涉及一种多级固定化酶膜反应
装置及利用其制备酪蛋白磷酸肽的方法。
背景技术：
酪蛋白磷酸肽(casein phosphop印tide即CPPs)是以牛乳酪蛋白为原料经单一 或复合酶催化水解、分离、纯化而制得的含有成簇磷酸丝氨酸的一种天然生物活性多肽。
酪蛋白磷酸肽可作为无机离子的载体，它在pH呈中性至微碱性的动物小肠下端， 能与Ca2+、 Fe"和Zn2+等金属离子结合，阻止金属离子与磷酸根产生沉淀，使小肠内可溶性 的钙、铁和锌的浓度增加，从而促进这些必需金属离子的吸收和利用。此外，在动物和人的 实验中，CPPs表现出抗龋齿、抗骨丢失、增强受精和胚胎发育等作用。 我国居民平均每日钙摄入量只有405. 4mg，只占每日推荐量的50 %左右，在有些 地区儿童佝偻病的发病率高达40%，骨质疏松症也是困扰老人的常见疾病之一，因此对我 国来说，全民补f丐显得尤其重要。而补f丐时不仅要注重f丐的摄入，更要注重f丐的吸收。而 CPPs由于能够促进钙吸收的这一功能，其市场应用前景相当广阔。 酪蛋白磷酸肽的核心结构为-Ser (P)-Ser (P)-Ser (P)-Glu-Glu-，这一序列也正是 CPPs的功能基因，其含量的多少与CPPs的功能特性直接相关。因此，不同分子量的CPPs展 现出不同的品质及功能特性。目前，未有一种方法能对酪蛋白磷酸肽产品分子量进行控制。
目前，酪蛋白磷酸肽的主要生产方法是酶解法，即在普通水解罐中用蛋白酶对底 物酪蛋白进行水解，水解结束后，高温灭酶，再调节反应液pH使未水解的酪蛋白沉淀，离心 后喷雾干燥或者使用乙醇钙沉淀法制得。工艺过程中主要存在如下问题(l)酶不能循环 利用，酶量消耗大，生产成本高。(2)底物水解不完全，未反应的底物被离心后去除，浪费生 产原料。(3)产品纯度低，一般喷雾干燥后得到的产品纯度仅在12%左右，完全满足不了市 场要求。也有报道用反应分离耦合方法来制备酪蛋白磷酸肽，但是其蛋白酶没有被固定化， 不能重复利用，增加了生产成本。(4)不能控制产品品质，不能对酪蛋白磷酸肽的分子量进 行控制。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种多级固定化酶膜反应装置，利用该反应器 可同时制备出不同分子量的产品。 本发明还要解决的技术问题是提供利用上述多级固定化酶膜反应器制备酪蛋白 磷酸肽的方法，该方法可同时制备出不同分子量和不同品质纯度的酪蛋白磷酸肽，极大的 提高了生产效率。 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下 —种多级固定化酶膜反应装置，它包含N级串联的固定化酶膜反应器和一个纳滤装置；每一级固定化酶膜反应器以聚砜多孔材料为支撑在反应器内部形成圆筒，将反应器 分隔为圆筒内和圆筒外两个空间，以聚酯无纺布增强上述圆筒结构的强度，将截留分子量 为1000 10000Da的膜装填在上述圆筒结构的内侧，膜内侧表面上固定有蛋白酶；纳滤装 置中设有截留分子量为100 500Da的纳滤膜；第1级固定化酶膜反应器圆筒外部通过管 道与第2级固定化酶膜反应器圆筒内部相连通，第2级固定化酶膜反应器圆筒外部通过管 道与第3级固定化酶膜反应器圆筒内部相连通，以此类推，直至第N级固定化酶膜反应器， 第N级固定化酶膜反应器圆筒外部通过管道与纳滤装置相连通，第2级至第N级固定化酶 膜反应器圆筒内部分别通过管道与纳滤装置相连通，上述管道都设有阀门；第1级固定化 酶膜反应器至第N级固定化酶膜反应器，其膜的截留分子量依次递减；所述的N取2 100 的整数。 其中，所述截留分子量为1000 lOOOODa的膜为聚酰胺复合膜、醋酸纤维膜和聚 碳酸酯复合膜中的任意一种。 其中，所述固定化酶膜反应器装有控温夹套。 其中，所述固定化酶膜反应器圆筒内部设有搅拌桨。 其中，所述蛋白酶为碱性蛋白酶(Alcalase)、胰酶(Trypsin)、木瓜蛋白酶 (Papain)、中性蛋白酶(Neutrase)、复合蛋白酶(Protemax)中的任意一种或几种。
上述蛋白酶固定在膜上的方法为采用凝胶化法将蛋白酶固定化在膜内侧表面 上。即用膜组件在操作压力为0. 01 0. 08M Pa，循环流量10 30L/h的条件下超滤蛋白 酶溶液，由于酶分子不能透过膜而在膜表面沉积，当膜_液两相界面处酶蛋白的浓度达到 凝胶化浓度时，酶便以一薄膜凝胶层的形式固定在膜的表面，从而实现酶在膜上面的固定 化。所述的蛋白酶溶液是通过将蛋白酶溶解于PH6. 0 9. 0的磷酸缓冲液中制成。
其中，所述N取2 5的整数。 利用上述多级固定化酶膜反应装置制备酪蛋白磷酸肽的方法，将酪蛋白溶液注入 到第1级固定化酶膜反应器圆筒内部，进行酶解反应，反应结束后，通过超滤将圆筒内部液 体中分子量小于第1级膜分子量的物料转换到圆筒外部，再通过管道将第1级固定化酶膜 反应器圆筒外部的物料注入第2级固定化酶膜反应器圆筒内部，进行酶解反应，反应结束 后，通过超滤将圆筒内部液体中分子量小于第2级膜分子量的物料转换到圆筒外部，以此 类推，直至第N级固定化酶膜反应器，将第N级固定化酶膜反应器圆筒外部液体通过管道注 入纳滤装置中，经纳滤脱盐浓縮得到分子量小于第N级膜分子量且大于纳滤膜分子量的酪 蛋白磷酸肽；同时可在第2级至第N级中的每一级固定化酶膜反应器进行超滤后将该级固 定化酶膜反应器圆筒内部的物料注入纳滤装置中，经纳滤脱盐浓縮得到分子量小于该级之 前一级膜分子量且大于该级膜分子量的酪蛋白磷酸肽，第1级固定化酶膜反应器圆筒内部 可补充酪蛋白溶液重复反应。 其中，所述的酪蛋白溶液，浓度为40 150g/L，pH为6. 5 9. 5。 其中，每一级固定化酶膜反应器的反应温度为30 6(TC，搅拌速度为50
250rpm，酶解反应时间为1 3h。 其中，每一级固定化酶膜反应器超滤压力为0. 01 0. 08M Pa。
上述反应可连续进行，也可以间歇性进行。
有益效果与现有技术相比，本发明的优点是
(1)采用凝胶化法将酶固定在膜上形成固定化酶膜反应器，实现酶的重复利用，降 低了生产成本。 (2)固定化的酶膜反应器集生产分离与一体，同步实现反应催化和产物分离，简化 了酪蛋白磷酸肽的生产步骤，提高了生产效率。 (3)通过不同级数的酶膜反应器串联，并用不同截留分子量的超滤膜和纳滤膜组 合分离酪蛋白磷酸肽，可同时得到不同分子量大小的磷酸肽产品，可以随时根据客户要求 生产不同品质的产品。 (4)节约了原料，一级反应器中未被水解的底物酪蛋白经第二次反应时被利用，避 免了原料的浪费，直接降低了反应成本。 (5)本发明所涉及的反应条件温和，能耗低，固定化酶膜反应器可以重复使用和连 续化生产，极大的提高酶的利用率和产品的纯度，适合大规模连续化生产的要求。
图1为本发明的多级固定化酶膜反应装置示意图。 其中1为控温夹套；2为搅拌桨；3为膜组件(即圆筒)；4为固定化酶膜反应器；5 为产品储罐；6为阀门；7纳滤装置。
具体实施例方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限 制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1 : 图1为本发明的一个具体的实施例，从图中可以看出，该多级固定化酶膜反应装 置，包含3级串联的固定化酶膜反应器4和一个纳滤装置；每一级固定化酶膜反应器以聚砜 多孔材料为支撑在反应器内部形成圆筒3，将反应器分隔为圆筒内和圆筒外两个空间，以聚 酯无纺布增强上述圆筒结构的强度，将截留分子量为1000 10000Da的膜装填在上述圆筒 结构的内侧，膜内侧表面上固定有蛋白酶；纳滤装置中设有截留分子量为100 500Da的纳 滤膜；第1级固定化酶膜反应器圆筒外部通过管道与第2级固定化酶膜反应器圆筒内部相 连通，并通过阀门6a控制管道开合；第2级固定化酶膜反应器圆筒外部通过管道与第3级 固定化酶膜反应器圆筒内部相连通，并通过阀门6b控制管道开合；第3级固定化酶膜反应 器圆筒外部通过管道与纳滤装置7相连通，并通过阀门6c控制管道开合；第2级固定化酶 膜反应器圆筒内部通过管道与纳滤装置7相连通，并通过阀门6d控制管道开合；第3级固 定化酶膜反应器圆筒内部通过管道与纳滤装置7相连通，并通过阀门6e控制管道开合；第 1级固定化酶膜反应器至第3级固定化酶膜反应器，其膜的截留分子量依次递减。每一个固 定化酶膜反应器还装有控温夹套l，并且在圆筒内部设有搅拌桨2。 图l只显示了本发明的一种实施方式，当然固定化酶膜反应器的数量不仅仅是3 个，可以是2以上的任意个，无论固定化酶膜反应器的数量如何变化，其连接关系和连接原 理是类似于图1显示的装置的，本领域技术人员很容易理解，按照图1的结构原理，将N个 固定化酶膜反应器及纳滤装置连接起来，从而实现本发明的目的。
根据图1的装置，将截留分子量为8000、6000、3000Da的聚酰胺复合膜分别置于第
1、2、3级固定化酶膜反应器圆筒内侧，将截留分子量为350Da的纳滤膜置于纳滤装置中。当
然，本发明并不局限于上述截留分子量和上述材质的膜，任何截留分子量和材质的膜都可
以适用于本发明，只要保证膜的截留分子量按液流方向依次递减即可。 称取5g木瓜蛋白酶，溶于1L pH 7. 0的磷酸缓冲液中，将酶液倒入固定化酶膜反
应器圆筒内，在操作压力0. 05M Pa，循环流量lOL/h的条件下进行超滤，由于酶分子不能透
过膜而在膜表面沉积，当膜_液两相界面处酶分子的浓度达到凝胶化浓度时，酶便以一薄
膜凝胶层的形式固定在膜的表面，从而实现酶在膜上面的固定化。当然酶的种类也不局限
于上述的木瓜蛋白酶，只有是具有水解酪蛋白为酪蛋白磷酸肽能力的酶都可以使用，且都
在本发明的保护范围内。 以下实施例均使用本实施例中的装置。
实施例2 : 称取500g酪蛋白，加入10L 0. 05M NaOH溶液置于储液罐中，加热并不断搅拌使得 酪蛋白完全溶解，待酪蛋白完全溶解后用5M NaOH溶液将反应液的pH调至7. 0。
将酪蛋白溶液注入第1级固定化酶膜反应器圆筒内，开启循环冷却加热装置，将 反应温度控制在50°C，同时开启搅拌桨，调节搅拌转速为lOOrpm，开始酶解反应，反应过程 中用5M NaOH溶液将反应液的pH恒定在7. 0。水解2h后，开启超滤装置，超滤操作压力为 0. 05Mpa，循环流量10L/h。将水解产生的分子量低于8000Da的酪蛋白磷酸肽透过，转换到 圆筒的外部，开启阀门6a，使分子量低于SOOODa的酪蛋白磷酸肽流入到第2级固定化酶膜 反应器圆筒内，未透过第1级膜的底物酪蛋白以及大分子多肽则留在酶膜反应器中继续水 解，同时根据超滤透过的液体量补加同量的pH 7. 0的酪蛋白溶液继续反应。
待第2级固定化酶膜反应器圆筒内的液体达到5L左右后，打开第2级搅拌桨， 开始水解反应，反应条件与第1级相同。约水解1小时后开启超滤装置，超滤操作压力为 0. 05Mpa，循环流量10L/h。将水解产生的分子量低于6000Da的酪蛋白磷酸肽透过，转换到 圆筒的外部，开启阀门6b，使分子量低于6000Da的酪蛋白磷酸肽流入到第3级固定化酶膜 反应器圆筒内。第2级固定化酶膜反应器圆筒内为分子量在6000 8000Da之间的酪蛋白 磷酸肽。 待第3级固定化酶膜反应器圆筒内的液体达到3L左右后，打开第3级搅拌桨，
开始水解反应，反应条件与第1级相同。约水解1小时后开启超滤装置，超滤操作压力为
0. 05Mpa，循环流量10L/h。将水解产生的分子量低于3000Da的酪蛋白磷酸肽透过，转换到
圆筒的外部，开启阀门6c，使分子量低于3000Da的酪蛋白磷酸肽流入到纳滤装置中。第2
级固定化酶膜反应器圆筒内为分子量在3000 6000Da之间的酪蛋白磷酸肽。 将开启纳滤装置，用于产品的浓縮及脱盐，操作压力0. 15Mpa，当脱水率达50X，
结束纳滤。纳滤浓縮液为分子量在350 3000Da的酪蛋白磷酸肽产品。 也可开启阀门6d，直接将第2级固定化酶膜反应器圆筒内液体注入纳滤装置中，
经纳滤脱盐浓縮得到分子量在6000 8000Da的酪蛋白磷酸肽产品。 也可开启阀门6e，直接将第3级固定化酶膜反应器圆筒内液体注入纳滤装置中， 经纳滤脱盐浓縮得到分子量在3000 6000Da的酪蛋白磷酸肽产品。
经检测，上述3种酪蛋白磷酸肽的指标如下
分子量8000 6000Da的酪蛋白磷酸肽纯度22. 81%，蛋白含量93. 07%， N含
量14. 59%、P含量0. 99% ; 分子量3000 6000Da的酪蛋白磷酸肽纯度44. 19%，蛋白含量92. 40X，N含
量14. 48%、P含量1. 47% ; 分子量350 3000Da的酪蛋白磷酸肽纯度67. 25%，蛋白含量91. 71%， N含 量14. 37%、P含量1. 86%。
实施例3 : 称取400g酪蛋白，加入8L 0.05M NaOH溶液置于储液罐中，加热并不断搅拌使得 酪蛋白完全溶解，待酪蛋白完全溶解后用5M NaOH溶液将反应液的pH调至7. 0。
将酪蛋白溶液注入第1级固定化酶膜反应器圆筒内，开启循环冷却加热装置，将 反应温度控制在55°C，同时开启搅拌桨，调节搅拌转速为150rpm，开始酶解反应，反应过程 中用5M NaOH溶液将反应液的pH恒定在8. 0。水解3h后，开启超滤装置，超滤操作压力为 0. 05Mpa，循环流量10L/h。将水解产生的分子量低于8000Da的酪蛋白磷酸肽透过，转换到 圆筒的外部，开启阀门6a，使分子量低于8000Da的酪蛋白磷酸肽流入到第2级固定化酶膜 反应器圆筒内，未透过第1级膜的底物酪蛋白以及大分子多肽则留在酶膜反应器中继续水 解，同时根据超滤透过的液体量补加同量的pH 7. 0的酪蛋白溶液继续反应。
待第2级固定化酶膜反应器圆筒内的液体达到5L左右后，打开第2级搅拌桨， 开始水解反应，反应条件与第1级相同。约水解1小时后开启超滤装置，超滤操作压力为 0. 05Mpa，循环流量10L/h。将水解产生的分子量低于6000Da的酪蛋白磷酸肽透过，转换到 圆筒的外部，开启阀门6b，使分子量低于6000Da的酪蛋白磷酸肽流入到第3级固定化酶膜 反应器圆筒内。第2级固定化酶膜反应器圆筒内为分子量在6000 8000Da之间的酪蛋白 磷酸肽。 直接打开阀门6e，使来自第2级固定化酶膜反应器圆筒外的液体不经水解反应直
接注入纳滤装置，开启纳滤装置，用于产品的浓縮及脱盐，操作压力O. 15Mpa，当脱水率达
50%，结束纳滤。纳滤浓縮液为分子量在350 6000Da的酪蛋白磷酸肽产品。 也可开启阀门6d，直接将第2级固定化酶膜反应器圆筒内液体注入纳滤装置中，
经纳滤脱盐浓縮得到分子量在6000 8000Da的酪蛋白磷酸肽产品。 经检测，上述2种酪蛋白磷酸肽的指标如下 分子量6000 8000Da的酪蛋白磷酸肽纯度24. 21%，蛋白含量93. 37%， N含
量14. 63%、P含量0. 95% ; 分子量350 6000Da的酪蛋白磷酸肽纯度49. 80%，蛋白含量91. 23%， N含 量14. 30%、P含量1. 43%。
权利要求
一种多级固定化酶膜反应装置，其特征在于它包含N级串联的固定化酶膜反应器和一个纳滤装置；每一级固定化酶膜反应器以聚砜多孔材料为支撑在反应器内部形成圆筒，将反应器分隔为圆筒内和圆筒外两个空间，以聚酯无纺布增强上述圆筒结构的强度，将截留分子量为1000～10000Da的膜装填在上述圆筒结构的内侧，膜内侧表面上固定有蛋白酶；纳滤装置中设有截留分子量为100～500Da的纳滤膜；第1级固定化酶膜反应器圆筒外部通过管道与第2级固定化酶膜反应器圆筒内部相连通，第2级固定化酶膜反应器圆筒外部通过管道与第3级固定化酶膜反应器圆筒内部相连通，以此类推，直至第N级固定化酶膜反应器，第N级固定化酶膜反应器圆筒外部通过管道与纳滤装置相连通，第2级至第N级固定化酶膜反应器圆筒内部分别通过管道与纳滤装置相连通，上述管道都设有阀门；第1级固定化酶膜反应器至第N级固定化酶膜反应器，其膜的截留分子量依次递减；所述的N取2～100的整数。
2. 根据权利要求1所述的多级固定化酶膜反应装置，其特征在于所述截留分子量为 1000 10000Da的膜为聚酰胺复合膜、醋酸纤维膜和聚碳酸酯复合膜中的任意一种。
3. 根据权利要求1所述的多级固定化酶膜反应装置，其特征在于所述固定化酶膜反应 器装有控温夹套。
4. 根据权利要求1所述的多级固定化酶膜反应装置，其特征在于所述固定化酶膜反应 器圆筒内部设有搅拌桨。
5. 根据权利要求1所述的多级固定化酶膜反应装置，其特征在于所述蛋白酶为碱性蛋 白酶、胰酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶中的任意一种或几种。
6. 根据权利要求1所述的多级固定化酶膜反应装置，其特征在于所述N取2 5的整数。
7. 利用权利要求1所述多级固定化酶膜反应装置制备酪蛋白磷酸肽的方法，其特征在 于将酪蛋白溶液注入到第1级固定化酶膜反应器圆筒内部，进行酶解反应，反应结束后，通 过超滤将圆筒内部液体中分子量小于第1级膜分子量的物料转换到圆筒外部，再通过管道 将第1级固定化酶膜反应器圆筒外部的物料注入第2级固定化酶膜反应器圆筒内部，进行 酶解反应，反应结束后，通过超滤将圆筒内部液体中分子量小于第2级膜分子量的物料转 换到圆筒外部，以此类推，直至第N级固定化酶膜反应器，将第N级固定化酶膜反应器圆筒 外部液体通过管道注入纳滤装置中，经纳滤脱盐浓縮得到分子量小于第N级膜分子量且大 于纳滤膜分子量的酪蛋白磷酸肽；同时可在第2级至第N级中的每一级固定化酶膜反应器 进行超滤后将该级固定化酶膜反应器圆筒内部的物料注入纳滤装置中，经纳滤脱盐浓縮得 到分子量小于该级之前一级膜分子量且大于该级膜分子量的酪蛋白磷酸肽，第1级固定化 酶膜反应器圆筒内部可补充酪蛋白溶液重复反应。
8. 根据权利要求7所述的制备酪蛋白磷酸肽的方法，其特征在于所述的酪蛋白溶液， 浓度为40 150g/L， pH为6. 5 9. 5。
9. 根据权利要求7所述的制备酪蛋白磷酸肽的方法，其特征在于每一级固定化酶膜反 应器的反应温度为30 6(TC，搅拌速度为50 250rpm，酶解反应时间为1 3h。
10. 根据权利要求7所述的制备酪蛋白磷酸肽的方法，其特征在于每一级固定化酶膜 反应器超滤压力为0. 01 0. 08MPa。
全文摘要
本发明公开了一种多级固定化酶膜反应装置，它包含N级串联的固定化酶膜反应器和一个纳滤装置；每一级固定化酶膜反应器内部设有圆筒，将截留分子量为1000～10000Da的膜装填在上述圆筒内侧，膜内侧表面上固定有蛋白酶；纳滤装置中设有截留分子量为100～500Da的纳滤膜；第1级反应器圆筒外部与第2级反应器圆筒内部相连通，以此类推，第N级反应器圆筒外部与纳滤装置相连通，第2级至第N级反应器圆筒内部分别与纳滤装置相连通；第1级至第N级反应器，其膜的截留分子量依次递减。本发明还公开了利用上述装置制备酪蛋白磷酸肽的方法。通过本发明可以同时制备出不同分子量和品质的酪蛋白磷酸肽，简化了生产过程，降低了生产成本。
文档编号C12M1/40GK101768551SQ20101902602
公开日2010年7月7日 申请日期2010年2月4日 优先权日2010年2月4日
发明者应汉杰, 张磊, 徐李鹏, 柏建新, 熊健, 陈勇, 黄小权 申请人:南京工业大学;南京同凯兆业生物技术有限责任公司