专利名称：一种两罐法发酵生产苏云金芽胞杆菌的方法
技术领域：
本发明专利涉及一种苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)的发
酵方法，属于轻工发酵领域。
背景技术：
Bt的生长分为适应期、对数生长期、平衡期和衰亡阶段。芽胞、晶体的脱落产生在 平衡期中后期，最后从发酵液分离芽胞和晶体产品。从细胞经济学角度看在发酵工业生产 上，分批发酵的前期是微生物增殖阶段，应该从培养条件上保证菌种微生物的正常增殖，以 便为随后目的产物生成提供足够的细胞，称前发酵，然后细胞转入目的产物的生产阶段，即 芽胞、晶体形成、脱落阶段，称后发酵。根据Bt的发酵特点，已有不少研究者研究在一个搅拌通风罐中，采用分段控制发 酵工艺，即前发酵阶段采用高的通风量、30°C发酵，后发酵采用低的通风量、33°C发酵，与对 照恒温、恒通风量发酵相比，发酵周期缩短，毒力增加，而且节能。国外有研究采用两个连续发酵罐串联，控制稀释率，第一个罐用于前发酵产菌体 用，第二个罐用于产芽胞和晶体用。但由于连续培养野生型菌株具有更高的比生长速率，此 外单细胞分裂，有很大一部分野生菌株突变成不产芽胞的突变菌株，最后突变菌株代替了 野生菌株，而且有报道连续培养由于长时间的培养，自发产生不产芽胞的突变Bt菌株，因 此连续发酵比分批发酵更合适于研究菌体生长和芽胞的形成，而不适合生产应用。因此，在现实的Bt的生产中，通常生产方法仍然是在一个搅拌通风发酵罐中，采 用分段控制发酵的工艺进行生产。这种方法通风搅拌占用时间长，浪费了大量的电能，同时 对菌体和后发酵芽胞、晶体造成剪切伤害，不利于杀虫毒素的形成。本发明的内容本发明的目的是提供一种既有利于菌体、芽胞和晶体的形成，又可以节能，提高产 量的Bt发酵生产新方法。本发明的目的是以如下方式实现的；一种两罐法发酵生产苏云金芽胞杆菌的方 法，根据Bt芽胞形成来确定发酵工段，从发酵罐接种开始到发酵液形成芽胞阶段为前发 酵；芽胞开始形成到芽胞开始脱落阶段为后发酵1，芽胞开始脱落到芽胞脱落50%阶段为 后发酵2 ；前发酵在前发酵罐B内完成，前发酵罐B是一个搅拌通风的发酵罐，后发酵1、后 发酵2在后发酵罐C内完成，后发酵罐C是一个气升式发酵罐；前发酵罐B中采用高的通风 量，即按培养基与无菌空气体积1 1.5v/v/min的通风量、搅拌转速250r/min、发酵温度控 制在-30°C，发酵至芽胞刚开始形成时，转入后发酵罐C，后发酵1采用较低的通风量， 即按培养基体积与无菌空气体积1 lv/v/min的通风量、发酵温度控制在33°C发酵；发酵 至芽胞刚开始脱落时，停止通风，进入后发酵2，后发酵2维持33°C静置发酵至芽胞50%脱 落时，出料转入后期处理阶段。上述的两罐法发酵生产Bt的方法中，在前发酵罐B的前端设有一个培养基连续灭 菌装置A，即可实现半连续发酵。
采用上述的发明方法的两罐法发酵工艺能产生非常的积极的效果，主要优势如 下1、可以分段控制菌体生长和芽胞晶体蛋白的形成；通过控制通风量和后期发酵温 度达到缩短发酵时间、提高毒力产量的目的。2、后发酵罐C相当于中转罐，没有搅拌装置，比前发酵罐结构简单、价格便宜；当 发酵进入后发酵，开始进入后发酵罐C，则前发酵罐B可以提前1/3-1/2的时间腾空或进入 下一个前发酵流程，同时可以省去1/3-1/2的通风搅拌发酵时间，节约大量通风搅拌能耗， 而且后发酵罐C没有搅拌装置，温和的通风可以较少剪切力对菌体、芽胞和晶体形成的伤 害，有利毒素的形成。3、如果培养基采用连续灭菌设备A，设备A可以是薄板、管式、塔式等连续灭菌设 备，则可以实现“半连续发酵”，即前发酵罐B出料进入后发酵罐C，下一批物料通过连续灭 菌可直接进入前发酵罐B，待后发酵罐C出料后，下一批前发酵罐B的发酵液又可以进入后 发酵罐C，如此生产多批后视环境卫生情况，根据微生物检测情况决定对前、后两个发酵罐 空罐灭菌。这样可以实现半连续多批次同时生产，减少了发酵罐空罐的清洗灭菌等辅助操 作时间，大大提高设备周转率。4、两罐法间歇发酵可以避免连续培养易染菌、菌种退化的问题。
下面结合附图对本发明进一步说明图1两罐法生产Bt的工艺设备流程2发酵工艺流程图A、培养基连续灭菌装置B、前发酵罐C、后发酵罐；D、进料管接口 E、无菌空气进管F、空气出管G、出料口
具体实施例采用图1的工艺设备、图2的两罐法发酵工艺培养，以8010为发酵菌株发酵生产 Bt。培养基配方玉米淀粉1 %，豆粕1. 3%，花生饼粉10Z0，玉米浆1 %，酵母粉0. 1 %， CaCO3O. 3%, KH2PO4 0. 2%, MgSO4 0. 07%, pH 7. 0-7. 5，121°C高压灭菌 40min。经灭菌的培养基进入前发酵罐B，前发酵罐B中采用高的通风量，即按培养基与空 气量1 1.5V/V/min通风量、发酵温度控制在30°C，至芽胞刚开始形成时，转入后发酵罐 C，后发酵罐C前期采用低的通风量，即按培养基与无菌空气量1 lv/v/min通风量，温度 控制在33°C发酵，发酵至芽胞刚开始脱落时，停止通风，维持33°C至芽胞50%以上脱落时， 出料转入后期处理阶段，即分离、干燥和制剂生产。发酵液芽胞计数方法取发酵液85°C加热处理5min，迅速冷却，采用稀释平板活 菌技术法计数；毒力测定方法发酵液经1000倍稀释后对2-3龄小菜蛾生物测定。结果采用本发明方法的发酵时间为65h，终产品芽胞数75亿/mL，芽胞形成率 90%以上；4 小菜蛾校正死亡率100%;如采用传统的单罐法发酵，采用恒温(30°C)、恒通 风量(1 1.5VV/min)、恒转速O50r/min)控制发酵，则需要发酵时间为72h，终产品的芽胞数58亿/mL、芽胞形成率80%左右，4 2_3龄小菜蛾校正死亡率86%。按每度电0.73 元，每罐1. 5t计算，可节省搅拌能耗300元以上，而且产品对小菜蛾杀虫能力提高12. 5%。
权利要求
1.一种两罐法发酵生产苏云金芽胞杆菌的方法，其特征是根据Bt芽胞形成来确定发 酵工段，从发酵罐接种开始到发酵液形成芽胞阶段为前发酵；芽胞开始形成到芽胞开始脱 落阶段为后发酵1，芽胞开始脱落到芽胞脱落50%阶段为后发酵2 ；前发酵阶段在前发酵罐 B内完成，前发酵罐B是一个搅拌通风的发酵罐，后发酵1、后发酵2在后发酵罐C内完成， 后发酵罐C是一个气升式发酵罐；前发酵罐B中采用高的通风量，即按培养基与无菌空气体 积1 1.5V/V/min的通风量、搅拌转速250r/min、发酵温度控制在观1-301，至芽胞刚开 始形成时，转入后发酵罐C，后发酵1采用较低的通风量，即按培养基体积与无菌空气体积 1 lv/v/min通风量、发酵温度控制在33°C发酵；发酵至芽胞刚开始脱落时，停止通风，进 入后发酵2，后发酵2维持33°C静置发酵至芽胞50%脱落时，出料转入后期处理阶段。
2.根据权利要求1所述的一种两罐法发酵生产苏云金芽胞杆菌的方法，其特征是前发 酵罐B的前端设有一个培养基连续灭菌装置A，即可实现半连续发酵。
全文摘要
一种两罐法发酵生产苏云金芽胞杆菌的方法，从进料接菌至芽胞刚开始形成在前发酵罐内完成，芽胞开始脱落到芽胞脱落50％为后发酵，在后发酵罐内完成；前发酵罐是一个搅拌通风的发酵罐，后发酵罐是一个气升式发酵罐；前发酵罐中按培养基与无菌空气体积1∶1.5v/v/min的通风量、搅拌转速250r/min、发酵温度28℃-30℃；至芽胞开始形成即转入后发酵罐C，采用培养基与无菌空气体积1∶1v/v/min通风量、发酵温度33℃，发酵至芽胞刚脱落即停止通风，维持33℃静置发酵至芽胞50％脱落时，发酵完成；产品毒力高，能耗低及生产效率高。
文档编号C12R1/07GK102146349SQ20101062374
公开日2011年8月10日 申请日期2010年12月25日 优先权日2010年12月25日
发明者关雄, 吴丽云 申请人:福建农林大学