专利名称：：一种基于纳米金标银增强信号放大技术的沙门氏菌检测方法
技术领域：
：本发明涉及l)生物素化沙门氏菌序列特异寡核苷酸捕获探针首先通过生物素_亲和素结合作用固定到亲和素包被酶标板上，再通过DNA互补杂交捕获沙门氏菌序列特异目标单链核酸分子，纳米金标记沙门氏菌序列特异性寡核苷酸显示探针进一步通过与目标单链核酸分子杂交，在酶标板孔内形成纳米金标记三明治双链复合物；2)或者固定在微孔板上的沙门氏菌多克隆抗体首先捕获目标沙门氏菌，然后纳米金标记的沙门氏菌多克隆抗体再与目标菌温育结合形成夹心结构；3)通过银染增强，结合在酶标孔内的纳米金标记信号被放大3-6个数量级，结合光密度检测技术或溶出化学发光检测技术，实现对沙门氏菌的超灵敏检测。同时该方法很容易推广应用到其它致病菌的检测工作中。具体实验原理如图1、图2所示。具体来说，本发明的主要分析步骤如下1试样制备1.1本发明所用沙门氏菌特异性寡核苷酸探针包括Seq1:5'_SH_(CH2)6_atatccacgcaggaaataacaggactt_3，(显不探针)；Seq2:5'-gagcgtgccttaccgacgata-(CH2)6-Biotin-3，(捕获探针)；Seql和Seq2溶解于TE缓冲液(10,1/LTris-HCl，1,1/LEDTA，pH7.4)。本发明所用抗体为鼠抗沙门氏菌多克隆抗体。1.2纳米金的制备在圆底烧瓶中加入95.8mL超纯水，再加入4.2mL1%的氯金酸溶液，磁力加热搅拌，持续煮沸10min;加入10mL1%的柠檬酸三钠溶液(迅速)，溶液开始有些蓝色，然后变浅蓝色，再加热出现红色；等到出现透明的橙红色，停止加热，将热源除去，继续搅拌15min。图3为所制备纳米金颗粒的紫外_可见吸收光谱，其最大吸收波长为520nm。图4为所制备纳米金颗粒的透射电镜(TEM)图，可以看出纳米金形貌为较均一的球状，粒径在12nm左右。1.3纳米金标记显示探针的制备胶体金溶液500iiL，4。C11000r/min离心13min，弃上清。加300nmol/L(pH7.4的1XTE缓冲液稀释)巯基化沙门氏菌寡核苷酸显示探针(seql)50i!L，混匀，置于4t:环境，反应12h。加等体积含0.2mol/L的TE缓冲液，使NaCl终浓度为0.1M，迅速混匀，置于4t:环境，反应24h。加等体积(50iiL)含0.2mol/LNaCl的1XTE缓冲液，使NaCl终浓度为0.lmol/L，迅速混匀，置于4。C环境，反应24h。取上清，4°C，11000r/min离心8分钟，弃上清，加100i!L超纯水重悬后再次离心，弃上清，以去除多余的游离寡核苷酸链。加100iiL含0.lmol/LNaCl的1XTE缓冲液混匀，置4"环境储存备用。1.4纳米金标记鼠抗沙门氏菌多克隆抗体的制备纳米金标记鼠抗沙门氏菌多克隆抗体按照以下方法制备一定量的多抗与lmL纳米金胶体溶液混合，室温下孵育2h。随后于45000g离心30min去除未结合多抗。所得沉淀物即为纳米金标记多抗，将其重悬于0.01mol/LpH7.6Tris缓冲液中备用。1.5酶标板包被亲和素本发明中夹心型DNA杂交产物是通过生物素化的捕获探针与包被于酶标板上的亲和素之间的特异性结合反应固定在了微孔板上。适合的亲和素包被浓度是本发明成功与否的基础。对亲和素的包被浓度进行了优化，测定了不同包被浓度下目标探针浓度与银增强后吸光度值的关系，结果显示亲和素包被浓度为10.00mg/L时，目标探针浓度与吸光度值之间具有较好的线性关系，所以选择10.00mg/L为最佳的亲和素包板浓度。酶标板包被亲和素的具体步骤亲和素(lmg/mL)用碳酸盐包被液按l:100稀释，每孔包被100iiL，置于4。C环境，12h。含0.2mol/LNaCl的0.02mol/LPB(pH7.0)每孔250iiL洗涤3次，5min/次，拍干。用3%牛血清白蛋白(BSA)封闭孔板，防止后面的过程发生非特异性吸附。1.6酶标板包被鼠抗沙门氏菌多克隆抗体酶标板微孔每孔加100L鼠抗沙门氏菌多克隆抗体(10g/mL配置于0.05M碳酸缓冲液，pH9.6)4。C孵育过夜，未结合抗体用0.01mol/LPBS-Tween20(PBST)溶液洗掉。随后每孔用含1%BSA的0.Olmol/LPBS在37。C封闭lh。接着用PBST溶液洗涤三次。2分析检测2.1酶标板孔纳米金组装A.DNA杂交法基于夹心型DNA杂交的组装过程如图1所示。选用国标法(GBT4789.4-2008)对样品中沙门氏菌进行选择性增菌培养，采用商品化试剂盒提取细菌基因组，制备单链目标DNA样品。取20iiL1Onmol/L生物素标记探针(seq2)，与用0.lmol/LPBS(pH7.O，含0.2mol/LNaCl)配制的10yL单链目标DNA，混匀，25。C反应10min。加纳米金标记显示探针(含0.1%BSA)8nmol/L，10yL，混匀，在25°C，反应10min。将该40yL体系杂交产物转移到各酶标板孔，37t:保温20min，倾倒干净。含0.2mol/LNaCl的0.02mol/LPB(pH7.0):洗涤1次，拍干，2XPBN(0.3mol/LNaN03和lOmmol/LNa2HP04/NaH2P04，pH7.0)洗涤2次，拍干。B.免疫亲和法基于夹心型免疫反应的组装过程如图2所示。在包被好鼠抗沙门氏菌多克隆抗体的酶标板孔内加入100L目标菌，37t:孵育20min，随后用PBST剧烈震荡洗涤3次去除未结合的菌。接着每孔加入100i!L鼠抗沙门氏菌多克隆抗体-纳米金复合物，室温下孵育20min，随后用PBST剧烈震荡洗涤3次，去除未结合的抗体_纳米金复合物。2.2银增强信号放大及吸光度检测取银增强液迅速混匀立即加入各酶标板孔内，每孔lOOiiL，置于恒温箱里反应，反应一定时间后，每孔加超纯水洗涤终止反应。然后将银增强后的微孔板放入酶标仪中，在630nm处检测其吸光度值。银增强反应在暗处避光进行，以减少银自身成核反应，增强特异性。在银增强过程中，随着时间的推移，增强液的灰度会不断增加，尤其是通过杂交或免疫亲和锚定于酶标板上的纳米金颗粒可显著加速银颗粒的聚集，即纳米金银增强信号的吸光度值变化是剂量时间依赖性的(图5)。在一定的时间控制下，银增强的灰度值变化与不同浓度目标核酸序列(Seq2)杂交系中固定于酶标孔内的纳米金颗粒的量(或通过与目标沙门氏菌免疫亲和固定于酶标孔内的纳米金颗粒的量)呈正相关。通过一系列实验优化，选择出最合适的时间段60-80s终止银增强反应，得出(DNA杂交分析法)银增强吸光度值与目标核酸序列的浓度对数值lg[c(target)mol/L]在-13-9范围内呈良好的线性关系(y=0.0652x+0.8694，R2=0.9948)，检测范围为0.l-1000pmol/L，检测限为33fmol/L;(免疫亲和分析法)银增强吸光度值与目标沙门氏菌的浓度在50-2000cfu/mL范围内呈良好的线性关系(y=0.0328x+0.4056，R2=0.9932)，检出限为50cfu/mL。所述银增强液的制备0.85g氢醌溶于15mL超纯水中；1.175g拧檬酸三钠/1.275g柠檬酸溶于5mL超纯水中；0.5g硝酸银溶于2mL超纯水中，溶液均需新鲜配制，确保无结晶体析出且无色，氢醌和柠檬酸混合液应在银增强前30min左右保持37t:温育。2.3银的化学溶出与化学发光检测6采用l:3HN03(v/v)来溶解纳米金表面沉积的银。以超纯水取代化学溶出的银离子溶液做空白对照，结果用溶银测出的化学发光值与空白对照化学发光值差值即相对化学发光值表示。结果表明，银在l:3HN03(v/v)中易于溶解，10min即可溶解完全，为保证其完全溶解，本方法中溶解时间都采用15min。溶出的银离子催化MnS04-K2S208-H3P04体系生成KMn04，进而氧化luminol化学发光，通过Ag+浓度与化学发光信号之间良好的线性关系完成对目标物质的检测。本发明选定上述试剂浓度和用量为K2S208浓度为0.02g/mL(200yL)，MnS04浓度6X10_3mol/L(40iiL)，l:1(v/v)H3P04(36iiL)，1Pmol/Lluminol溶液(200iiL)。用l:3(v/v)H冊3来溶解银增强后各酶标板孔内的银(100iiL/孔)，溶解所得的银离子溶液中均加入60L5mol/L的NaOH来调节其酸度。然后该溶液转移至含有200iiL2%(m/V)K2S208，40iiL6X10—3mol/LMnS04禾P36iiL1:1(v/v)H3P04的离心管中，混合均匀后马上放入9(TC水浴中加热7分钟。流水冷却中止该催化反应并用5mol/LNaOH调节溶液的pH值至10。取该溶液50iiL转移至石英发光管中，然后注射入200yLluminol(1iimol/L，pH13.5)同时在发光分析仪上记录发光信号。本发明中银离子的化学发光强度和目标沙门氏菌特异DNA或沙门氏菌的浓度成正比，可以得出化学发光信号和待测沙门氏菌的关系。采用DNA杂交分析方法时，得方法线性范围为l-1000fmol/L，校正曲线方程为AI=1672.42C(fmol/L)+26477(R2=0.9932)。相对标准偏差(RSD)为5.3%(20fmol/L，n=11)，检测限为0.3fmol/L(3o)。至少5cfu/mL目标菌可以用本发明方法检出。采用免疫亲和分析方法时，化学发光强度与目标菌数量线性范围为5-1038cfu/mL。回归方程为AI=7.12C(cfu/mL)+857.78(R2=0.9935)，相对标准偏差(RSD)为4.7%(50-100cfu/mL，n=11)，检测限为5cfu/mL。3分析性能本发明创新性的利用了沙门氏菌序列特异性寡核苷酸捕获探针、金标沙门氏菌显示探针与目标核酸序列之间的DNA杂交，形成三明治复合体；或者鼠抗沙门氏菌多克隆抗体直接捕获目标食源性致病菌，再与纳米金标记鼠抗沙门氏菌多克隆抗体结合形成夹心型复合体；利用纳米金银增强原理，结合光密度检测技术或化学发光检测技术，建立了沙门氏菌新型超灵敏检测方法，不仅发挥了纳米金标记的优势，更利用了银增强技术将信号有效放大，建立了比传统方法更灵敏高效的检测手段。该方法也极易通过改变寡核苷酸探针或多克隆抗体类别应用于其它致病菌的检测，有可能为其他致病菌的超灵敏分析开辟一条新的途径。图1基于纳米金标银增强技术的沙门氏菌检测示意图(DNA杂交分析法)图2基于纳米金标银增强技术的沙门氏菌检测示意图(免疫亲和分析法)图3纳米金的紫外_可见吸收图谱图4所制备纳米金的TEM形貌图5不同浓度目标探针的银增强时间与吸光度值的关系曲线图6本发明方法对沙门氏菌序列特异寡核苷酸序列响应情况比较(a，完全互补目7标寡核苷酸序列；b，单碱基错配寡核苷酸序列；c，五碱基错配寡核苷酸序列；d，随机对照链图7)目标沙门氏菌浓度与化学发光强度校正曲线具体实施例方式下面的实例将具体说明本发明的操作方法，但不能作为对本发明的限定。实例11材料1.1仪器MultiskanMK3酶标仪(美国Thermo公司)，DF-101S型集热式磁力加热搅拌器(河南巩义市予华仪器厂)，TU-1900紫外可见光分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)，TecnaiG220透射电镜(TEM)(美国FEI公司)，LH586-2型恒温水槽(上海精科实业有限公司)，5804R高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)，96酶标板(加拿大BBI公司)。1.2试剂和样品牛血清白蛋白(BSA)(北京鼎国生物工程有限公司)，氯金酸(HAuCl4)(上海久岳化工有限责任公司)，氢醌、硝酸银、磷酸(中国医药上海化学试剂公司)，亲和素(美国Amresco公司产品)，超纯水由Milli-Qsystem制取。寡核苷酸序列购于上海生工生物工程技术服务有限公司。Seq1:5'-SH-(CH2)6_atetccacgcaggaaateacaggactt-3，(显不探针)；Seq2:5'-gagcgtgccttaccgacgata-(CH2)6-Biotin-3'(捕捉探针)；Seq3:3'-tataggtgcctcctttattgtcctgaaattgctgttaatcttctttacgctctcgcacggaatggctgctat-5'(目标序列)；Seq4:5'-tatcgtcggtaaggcacgctcaattgtcgttaaagtcctgttatttcctgggtggatat-3'(单减基错配链)；Seq5:5'-tatcgtcagtaaggcacactcaattgtcgttaaagtcgtgttattacctgcgaggatat-3'(五减基错配链)；S印6:5'-acatctgcatttccgttaaagtcccgttcgtaaatgctgttgcggcttgcttttccgcg-3'(对照序列_随机链)。Seq1和Seq2溶解于TE缓冲液(10mmol/LTris-HCl，lmmol/LEDTA，pH7.4)，Seq3_6直接溶于超纯水中。2方法2.1操作步骤取20iiL10nmol/L生物素标记探针(seq2)，与用0.lmol/LPBS(pH7.0，含0.2mol/LNaCl)配制的10yL单链目标DNA，混匀，25。C反应10min。加纳米金标记显示探针(含O.1%BSA)8nmol/L，10iiL，混匀，在25。C，反应10min。将该40yL体系杂交产物转移到各酶标板孔，37"C保温20min，倾倒干净。含0.2mol/LNaCl的0.02mol/LPB(pH7.0):洗涤1次，拍干，2XPBN(0.3mol/LNaN03和10mmol/LNa2HP04/NaH2P04，pH7.0)洗涤2次，拍干。取银增强液迅速混匀立即加入各酶标板孔内，每孔100iiL，置于恒温箱里反应，反应60-80s后，每孔加超纯水洗涤终止反应。采用1:3HN03(v/v)来溶解纳米金表面沉积的银，时间15min。以超纯水取代化学溶出的八8+溶液做空白对照，结果用溶银测出的化学发光值与空白对照差值即相对化学发光值表示。溶出的银离子催化MnS04-K2S208-H3P04体系生成KMn04，进而氧化luminol化学发光，通过Ag+浓度与化学发光信号之间良好的线性关系完成对目标物质的检测。2.2制作标准曲线、确定灵敏度在实验选定最佳条件下，测定了不同浓度沙门氏菌序列特异目标DNA(Seq3)的化学发光响应情况。得方法线性范围为l-1000fmol/L，校正曲线方程为AI=1672.42C(fmol/L)+26477(R2=0.9932)。相对标准偏差(RSD)为5.3%(20fmol/L，n=ll)，检测限为O.3fmol/L(3o)。同时，测定了本发明方法对沙门氏菌(以Salmonellatyphimurium为例)检测的灵敏度，结果显示(表l)，至少5cfu/mLSalmonellatyphimurium可以用本发明方法检出。表1平板计数方法和本发明方法测定标准沙门氏菌结果稀释梯度a平板计数结果b(cfu/mL)本发明方法测定结果No.l00+No.200+No.300+No.430500+No.53540+No.6452+No.738+No.8+No.92—a，每个稀释梯度稀释倍数为10;b，为两次平板计数结果平均值。2.3选择性分析比较了完全互补目标DNA序列(lOfmol/L)与单碱基错配、五碱基错配、随机对照序列(100fmol/L)的响应情况。结果显示，其它序列响应值显著小于完全互补DNA序列响应值(图6)，如完全互补DNA序列响应值为100，则随机对照序列响应值为0.9。表明本发明方法具有良好的选择性。同时考察了本发明方法对目标菌和其它不同种类菌(均约lOOcfu/mL)的实际响应情况。结果表明(表2)，相对于沙门氏菌其它菌基本没有响应，进一步证实了本发明方法对沙门氏菌测定的特异性。表2本发明方法对不同种类菌株的测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>2.4样品测定按照国标法(GBT4789.4-2008)对30个取自不同场所的食品样品进行处理，采用商品化试剂盒提取细菌基因组，制备单链目标DNA样品。采用本发明方法检测目标菌数量，同时采用国标法(GB/T4789.30-2008)进行对照验证实验。结果显示(表3)，本发明方法对于实际样品中目标菌的测定结果与国标法(GB/T4789.30-2008)—致，准确性良好。表3国标法和本发明方法测定食品样品中目标菌的结果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>3结果分析由上述分析测定结果可知，本发明所提供的方法可通过DNA杂交的方式，结合纳米金标记_银增强信号放大_化学发光检测(或光密度检测)，实现对目标沙门氏菌的超灵敏检测。方法特异性、准确度良好。实例21试剂与材料鼠抗沙门氏菌多克隆抗体购自上海生工。纳米金和鼠抗沙门氏菌多克隆抗体-纳米金复合物在本实验室制备合成。所用沙门氏菌菌株和其它涉及到的菌株为本实验室保藏。所测定食品样品购自当地6个不同农贸市场。所用其它试剂材料、仪器设备与实例1相同。2方法2.1操作步骤在包被好鼠抗沙门氏菌多克隆抗体的酶标板孔内加入100i!L目标菌，37t:孵育20min，随后用PBST剧烈震荡洗涤3次去除未结合的菌。接着每孔加入100yL鼠抗沙门氏菌多克隆抗体_纳米金复合物，室温下孵育20min，随后用PBST剧烈震荡洗涤3次，去除未结合的抗体-纳米金复合物。取银增强液迅速混匀立即加入各酶标板孔内，每孔100iiL，置于恒温箱里反应，反应一定时间后，每孔加超纯水洗涤终止反应。采用1:3HN03(v/v)来溶解纳米金表面沉积的银，溶解15min。以超纯水取代化学溶出的八8+溶液做空白对照，结果用溶银测出的化学发光值与空白对照差值即相对化学发光值表示。溶出的银离子催化MnS04-K2S208-H3P04体系生成KMn04，进而氧化luminol化学发光，通过Ag+浓度与化学发光信号之间良好的线性关系完成对目标物质的检测。2.2制作标准曲线、确定灵敏度在实验优化条件下，采用本发明方法测定目标沙门氏菌，其实际数量通过平板计数法加以对照和验证。结果显示(图7):化学发光强度与目标菌数量线性范围为5-1038cfu/mL，回归方程为AI=7.12C(cfu/mL)+857.78(R2=0.9935)，相对标准偏差(RSD)为4.7%(50-100cfu/mL，n=11)，检出限为5cfu/mL。2.3选择性分析通过测定目标沙门氏菌和其它不同类型菌株(大约100cfu/mL)，对本发明方法的选择性进行验证。结果显示(表4)，目标沙门氏菌具有正常化学发光响应，其它类型菌株产生的化学发光强度则显著小于目标菌的化学发光强度，表明本发明方法具有良好的选择性。表4本发明方法测定不同类型菌株的结果菌株类型相对化学发光强度5W/腳"e〃a妙/z/mwh鹏1420^&c/zm'c/H'aco//25丄/他r/amowocytogene51272.4样品测定按照国标法(GB/T4789.30-2008)对取样得到的50个样品进行沙门氏菌选择性增菌培养，随后采用本发明方法进行沙门氏菌数量测定，同时采用国标法(GB/T4789.30-2008)进行对照验证。结果显示(表5)，本发明方法与国标法(GB/T4789.30-2008)检测结果一致，表明本发明方法准确性良好。表5本发明方法与国标法测定实际样品中沙门氏菌的结果比较食品样品样本数阳性数(阳性率°/。)GB/T4789.30-2008本发明方法禽肉161(6.25%)1(6.25%)猪肉151(6.67%)1C6.670/0)即食食品192(10.53%)2(10.53%)总计504(8，/(04(8.00%)3结果分析由上述分析测定结果可知，本发明所提供的方法可通过鼠抗沙门氏菌多克隆抗体与目标沙门氏菌免疫亲和的方式，结合纳米金标记_银增强信号放大_化学发光检测(或光密度检测)，实现对目标沙门氏菌的超灵敏检测。方法特异性、准确度良好。1权利要求一种基于纳米金标银增强信号放大技术的沙门氏菌检测方法，其特征在于(1)沙门氏菌序列特异性寡核苷酸捕获探针、纳米金标记沙门氏菌序列特异性寡核苷酸显示探针与目标菌目标核酸序列之间的DNA杂交，形成三明治复合体；(2)鼠抗沙门氏菌多克隆抗体、纳米金标记鼠抗沙门氏菌多克隆抗体与目标菌直接免疫亲和，形成三明治复合体；(3)加入银增强溶液，组装锚定在酶标孔上的纳米金颗粒加速银颗粒的沉积，通过检测吸光度可对沙门氏菌定量检测；(4)进一步将沉积的银化学溶出，采用luminol化学发光检测，可提高灵敏度10倍以上。2.如权利要求1所述一种基于纳米金标银增强信号放大技术的沙门氏菌检测方法，其特征在于纳米金标记沙门氏菌序列特异寡核苷酸显示探针的制备1)胶体金溶液500iiL，4。C11000r/min离心13min，弃上清。2)加300nmol/L(pH7.4的1XTE缓冲液稀释)巯基化沙门氏菌报告寡核苷酸探针(seql)50yL，混匀，置于4"环境，反应12h。3)加等体积含0.2mol/L的TE缓冲液，使NaCl终浓度为0.1M，迅速混匀，置于4t:环境，反应24h。3)加等体积(50iiL)含0.2mol/LNaCl的1XTE缓冲液，使NaCl终浓度为0.lmol/L，迅速混匀，置于4。C环境，反应24h。4)取上清，4°C，11000r/min离心8分钟，弃上清，加100yL超纯水重悬后再次离心，弃上清，以去除多余的游离寡核苷酸链。5)加100iiL含0.lmol/LNaCl的1XTE缓冲液混匀，置4"环境储存备用。3.如权利要求1所述一种基于纳米金标银增强信号放大技术的沙门氏菌检测方法，其特征在于纳米金标记鼠抗沙门氏菌多克隆抗体复合物的制备1)胶体金溶液500iiL，4。C11000r/min离心13min，弃上清。2)加300nmol/L(pH7.4的1XTE缓冲液稀释)目标菌单克隆抗体(或多克隆抗体)50iiL，混匀，置于4t:环境，反应12h。3)加等体积含0.2mol/L的TE缓冲液，使NaCl终浓度为0.1M，迅速混匀，置于4t:环境，反应24h。3)加等体积(50iiL)含0.2mol/LNaCl的1XTE缓冲液，使NaCl终浓度为0.lmol/L，迅速混匀，置于4°C环境，反应24h。4)取上清，4°C，11000r/min离心8分钟，弃上清，加100yL超纯水重悬后再次离心，弃上清，以去除多余的游离单抗。5)加100iiL含0.lmol/LNaCl的1XTE缓冲液混匀，置4"环境储存备用。4.如权利要求1所述一种基于纳米金标银增强信号放大技术的沙门氏菌检测方法，其特征在于酶标板包被亲和素的制备1)亲和素(lmg/mL)用碳酸盐包被液按1:100稀释，每孔包被100yL，置于4"环境，12h。2)含0.2mol/LNaCl的0.02mol/LPB(pH7.0)每孔250iiL洗涤3次，5min/次，拍干。3)用3%BSA封闭孔板，防止后面的过程发生非特异性吸附。5.如权利要求1所述一种基于纳米金标银增强信号放大技术的沙门氏菌检测方法，其特征在于生物素标记沙门氏菌捕获探针、金标沙门氏菌显示探针与沙门氏菌目标核酸序列之间的DNA杂交1)生物素标记探针(seq2)10nmol/L，20iiL用含0.2mol/LNaCl的0.lmol/LPBS(pH7.0)配制的一系列浓度的目的核酸(seq3)以及对照序列(seq4)各10iiL(l翻1/L-10nmol/L)，混匀，在25。C，反应10min。2)加胶体金标记探针(含0.1%BSA)8nmol/L，10yL，混匀，在25°C，反应10min。3)将该40iiL体系杂交产物转移到各酶标板孔，37t:保温20min，倾倒干净。4)含0.2mol/LNaCl的0.02mol/LPB(pH7.0):洗涤1次，拍干，2XPBN(0.3mol/LNaN03禾P10mmol/LNa2HP04/NaH2P04，pH7.0)洗涤2次，拍干。6.如权利要求1所述一种基于纳米金标银增强信号放大技术的沙门氏菌检测方法，其特征在于纳米金标记物的银增强信号放大取银增强液迅速混匀立即加入各组装好纳米金标记物的酶标板孔内，每孔100i!L，置于恒温箱里反应，反应60-80s后，每孔加超纯水洗涤终止反应。然后将银增强后的微孔板放入酶标仪中，在630nm处检测其吸光度值。所述银增强液的制备0.85g氢醌溶于15mL超纯水中；1.175g柠檬酸三钠/1.275g柠檬酸溶于5mL超纯水中；0.5g硝酸银溶于2mL超纯水中，溶液均需新鲜配制，确保无结晶体析出且无色，氢醌和柠檬酸混合液应在银增强前30min左右保持37t:温育。7.如权利要求1所述一种基于纳米金标银增强信号放大技术的沙门氏菌检测方法，其特征在于银增强后的光密度检测银增强后于酶标仪上630nm检测吸光度值，吸光度值与目标沙门氏菌序列特异DNA或目标沙门氏菌数量成正相关。8.如权利要求1所述一种基于纳米金标银增强信号放大技术的沙门氏菌检测方法，其特征在于银增强后的溶出化学发光检测用l:3(v/v)HN03来溶解银增强后各酶标板孔内的银(100iiL/孔)，溶解所得的银离子溶液中均加入60iiL5mol/L的NaOH来调节其酸度。然后该溶液转移至含有200yL2%(m/V)K2S208，40iiL6X10—3mol/LMnS0^P36iiL1:1(v/v)H3P04的离心管中，混合均匀后马上放入9(TC水浴中加热7分钟。流水冷却中止该催化反应并用5mol/LNaOH调节溶液的pH值至10。取该溶液50iiL转移至石英发光管中，然后注射入200iiLluminol(1ymol/L，pH13.5)同时在发光分析仪上记录发光信号。通过Ag+浓度与化学发光信号之间良好的线性关系完成对沙门氏菌的超灵敏检测。全文摘要本发明涉及利用沙门氏菌特异寡核苷酸捕获探针、纳米金标记特异寡核苷酸显示探针与致病菌目标核酸序列之间的DNA杂交，或沙门氏菌多克隆抗体、纳米金标记多克隆抗体与沙门氏菌直接免疫亲和，形成三明治复合体；加入银增强液，杂交或免疫亲和锚定在酶标孔上的纳米金颗粒加速银颗粒的沉积，通过吸光度检测，实现对沙门氏菌的灵敏检测，该方法的检出限可达到33fmol/L(DNA杂交分析)或50cfu/mL(免疫亲和分析)；进一步将沉积的银化学溶出，采用luminol化学发光检测，可使方法的检出限达到0.3fmol/L(DNA杂交分析)或5cfu/mL(免疫亲和分析)。本发明建立的食源性致病菌检测技术准确、灵敏、快速，对于食品安全具有重要意义。文档编号C12Q1/06GK101776688SQ20101902605公开日2010年7月14日申请日期2010年2月8日优先权日2010年2月8日发明者李井泉,段诺,王周平申请人:江南大学