专利名称：具有抗栓活性的低分子量蚓激酶的制作方法
专利说明具有抗栓活性的低分子量蚓激酶 技术领域 生物医药 蚯蚓(地龙)是我国沿用数千年之久的传统中药。它主要用于“活血通络”等诸多方面，可治疗中风、痹症、惊厥、炎症等征候，凡四十余种。自上世纪八十年代国外学者从蚯蚓体内发现了具有抗栓溶栓作用的“蚓激酶”以来，世界各国，尤其是中国大力开展了对该类成份的研究和开发。一九九五年“蚓激酶胶囊”作为抗栓新药在我国获准上市。多年来生产厂家和产量不断增加，市场情况良好。
口服蚓激酶虽然具有疗效确切，使用方便、价格低廉、副作用小等优点。但它起效慢，难以用于血栓类疾病的急性期抢救和治疗。目前可用的注射用抗栓溶栓生物制剂都存在着某些不足，如有效时间短(如尿激酶UK)、毒副作用明显(如蛇毒、链激酶SK)、价格昂贵(如组织纤溶酶原激活剂tPA)等。因此二十多年来人们对蚓激酶注射剂的研究和开发始终没有停止过。随着研究的深入，人们也发现蚓激酶作为药物开发有一些缺点(1)蚓激酶在蚯蚓体内的含量很低，仅占体重的千分之一以下。(2)蚯蚓体内的杂质数量和含量都很大，研究表明，蚓激酶体内存在着性质相近的5-9种同工酶，分离纯化困难较大，很难得到纯净组分的单一同工酶。所以一般来说，纯化蚓激酶的步骤多、时间长、活性丢失多、回收率低、成本高，很难对单一同工酶的纯化进行产业化生产。国内目前正在申报的蚓激酶注射液是一种包含3种同工酶(分子量为24-30KD)的混合制剂。(3)目前已发现有溶栓活性的蚓激酶分子量多在24-40KD，蚓激酶作为来源于低等动物的大分子异体蛋白，对人体有一定的抗原性。
针对以上问题，有些学者采用基因工程方法，在大肠杆菌或酵母细胞中表达获取蚓激酶，但结果是收率不高或者活性较低，难以与天然蚓激酶匹敌。
目前公认的蚓激酶分子量为24-40KD，生产厂家在生产时一般将低于20KD的蚯蚓提取液作为废物丢弃。我们从生产厂家当作废弃物的低于20KD的蚯蚓小分子量组分中，成功分离出2种新的蚓激酶组分，它们均有抗栓作用。通常小分子量的蛋白作为药用时产生的抗原性较小，所以我们新发现的这2组分在将其开发成注射药物方面具有很大的优势。
本研究以赤子爱胜(Eisenia foelide)蚯蚓为原料，通过超滤、离子交换和凝胶过滤等方法，分离得到2个小分子量的蚓激酶组分F1和F2，对其进行了初步的药理学活性研究，发现这些低分子量的酶蛋白也同样具有抗血栓的作用， 本项发明的显著特点是(1)我们得到的具有抗栓活性的蚓激酶是小分子类型的，目前已报道公认的蚓激酶分子量均在24-40KD之间，而我们得到的F1的分子量为20±1KD，F2的分子量仅为9±1KD，是目前发现的已知蚓激酶中分子量最小的同工酶。由于是小分子蛋白，在将其开发成注射溶栓药物方面就具有很大的优越性。(2)我们获得的组分F1和F2经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳发现是单一组分。由于蚯蚓体内的蚓激酶同工酶较多，分离单一成分的同工酶比较困难，而我们经过分离纯化最后得到的是电泳纯级别的蛋白组分。(3)本发明中采用的分离纯化方法简单，步骤少；仅通过超滤、离子交换和凝胶层析等3个主要步骤，就可以得到电泳纯的蛋白组分。由于蚯蚓体内同工酶性质接近，一般分离一种纯的同工酶需要多个步骤，步骤的增加导致纯化时间长、活性丢失多、得率降低以及成本较高等。本方法在这方面具有非常显著的优势。
在本发明中，将赤子爱胜(Eisenia foelide)蚯蚓匀浆后，得到提取液，将提取液通过超滤、离子交换和凝胶过滤等3个主要步骤，即可获得2个电泳纯级别的蛋白组分，我们将这两个组分分别命名为F1和F2。组分F1是通过将蚯蚓的蛋白提取液超滤后再进行离子交换层析得到的，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定其分子量为20±1KD；组分F2是通过将从离子交换层析中的流出液再进行Sephadex 75层析得到的，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定其分子量为9±1KD。
将组分F1进行氨基酸序列测定，得到2个肽段，分别长60和36个氨基酸残基。利用Mascot检索软件进行检索，发现这2个肽段的氨基酸序列分别与已报道的一个蚓激酶(蛋白序列号ABW04906，分子量26.2KD)的氨基酸序列在2处完全匹配，但我们的蛋白F1的分子量较小。序列1(见后面序列表1)是已知的蚯蚓纤溶酶序列(蛋白序列号ABW04906)，其中的黑体字是对比时两者序列一致的氨基酸序列，也是F1蛋白测定出的氨基酸序列部分，共2个部分，长度分别为60和36个氨基酸。
将组分F2进行氨基酸序列测定，得到2个肽段，分别长28和10个氨基酸残基。利用Mascot检索软件进行检索，发现这2个肽段的氨基酸序列分别与已报道来源于水蛭的神经血蓝蛋白(neurohemerythrin)的氨基酸序列在2处完全匹配。水蛭的神经血蓝蛋白的分子量为13.1KD，而我们得到的F2蛋白的分子量较小，为9±1KD。序列2(见后面序列表2)中的序列是水蛭的神经血蓝蛋白序列，其中的黑体字是对比时两者序列一致的氨基酸序列，也是F2蛋白测定出的氨基酸序列部分，共2个部分，长度分别为28和10个氨基酸。
使用琼脂糖-纤维蛋白平板法对F1和F2进行体外溶栓作用检测，结果发现它们均具有溶解纤维蛋白的作用。
使用培养的人脐静脉内皮细胞检测F1和F2对于组织纤溶酶原激活剂(tPA)生成和释放的影响作用。在96孔板中培养人脐静脉内皮细胞，使用不同浓度的试样处理细胞，使用上海太阳生物技术公司生产的检测试剂盒测定细胞上清液中tPA的含量。结果表明，我们获得这2个组分均可以促进人脐静脉内皮细胞中tPA的分泌，且tPA的含量和活性与使用的F1、F2浓度成正相关。
检查组分F1、F2和分子量为4-10KD的蚯蚓提取液对5种病原菌的抑制效果，这5种菌分别是(1)金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、(2)产气气细菌(Areobacter aerogenes)、(3)肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、(4)铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、(5)藤黄八叠球菌(Sarcina lutea)。结果表明，组分F1可以抑制第(1)、(2)和(4)种病原菌；组分F2可以抑制第(1)、(2)、(4)和(5)种病原菌，说明它们均具有一定的抗菌抑菌活性。我们将赤子爱胜(Eisenia foelide)提取液中分子量为4-10KD的混合组分同时做抑菌试验，作为阳性对照。结果发现，这个混合组分对上述5种病原菌都有抑制作用。
实施例1 将赤子爱胜蚯蚓洗净1000g，加入等量水匀浆，20℃以下搅拌抽提5h后，4000r/min离心15min，取上清，4℃静置过夜。次日6000r/min离心20min，取上清超滤，将其中分子量在4-10KD部分收集备用(最后做抑菌试验等用)。取分子量在10-20KD超滤液通过DEAE-Sepharose fast flow离子交换柱分离。使用pH7-8.0，0.1mol/L PBS缓冲液冲洗不吸附部分，再使用0-0.4mol/L NaCl/PBS缓冲液(pH7.8)进行梯度洗脱，按照280nm紫外吸收峰曲线收集蛋白峰，最后得到F1纯品87mg。使用SDS-PAGE电泳法测定纯度、分子量，使用纤维蛋白平板法测定酶活等。将没有吸附的部分超滤浓缩，过Sephadex G75柱，使用pH7.8，0.1mol/LPBS缓冲液洗脱，按照280nm紫外吸收曲线分峰收集蛋白峰，最后得到F2纯品39mg。
实施例2 检测组分F1和F2对培养的人脐静脉内皮细胞分泌tPA的影响。在96孔板中培养人脐静脉内皮细胞，接种密度为5×104/ml，使用不同浓度的试样处理细胞(每孔180μl培养液加入20μl药物溶液)，使用尿激酶作为阳性对照，生理盐水为阴性对照，保温12h，每孔取100μl，使用上海太阳生物技术公司生产的试剂盒测定细胞上清液中tPA的含量。结果见下表。
*n＝9，**P＜0.01 结果表明，F1和F2均可以促进人脐静脉内皮细胞分泌tPA，且tPA的分泌量与F1和F2的剂量成正相关。
实施例3 检查组分F1、F2和分子量为4-10KD的混合组分对5种病原菌的抑制效果，结果见下表。
*+表示抑制，-表示不抑制 结果表明，我们从蚯蚓中得到的F1和F2组分均有抑制病原菌的作用。
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IWDN HICIYDQANS VGSCNGDSGG PLNCPDGTTV 200 VAGITSWGIS SGGDCLQDYP SVYTRTSAYL DWIAANTP 238 序列表1组分F1蛋白的部分氨基酸序列与已知的一种蚓激酶的序列同源性比对其中的序列1是已知的蚯蚓纤溶酶序列(蛋白序列号ABW04906)，其中的黑体字是对比时两者序列一致的氨基酸序列，也是F1蛋白测定出的氨基酸序列部分，共2个部分，长度分别为60和36个氨基酸。
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TDFLYKGKL 119 表2组分F2蛋白的部分氨基酸序列与已知的水蛭神经血蓝蛋白序列同源性比对序列表中的序列是水蛭的神经血蓝蛋白序列，其中的黑体字是对比时两者序列一致的氨基酸序列，也是F2蛋白测定出的氨基酸序列部分，共2个部分，长度分别为28和10个氨基酸。
权利要求
1.通过超滤、DEAE-Sepharose fast flow离子交换层析和Sephadax 75凝胶过滤层析从赤子爱胜(Eisenia foelide)蚯蚓提取液中分离得到2种低分子量蚓激酶F1和F2。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定，F1的分子量是20±1KD，F2的分子量是9±1KD。
2.权利要求1中的F1蛋白的氨基酸序列已经部分测定；氨基酸序列比对发现，已测定的F1氨基酸序列与已报导的一种蚓激酶(蛋白序列号ABW04906，分子量26.2KD)在氨基酸序列上有2处完全匹配，但F1的分子量比ABW04906的要小。F1具有纤维蛋白溶解活性和促进人脐静脉内皮细胞tPA的释放和分泌的活性，F1还具有抑菌活性。
3.权利要求1中的F2蛋白的氨基酸序列已经部分测定；氨基酸序列比对发现，已测定的F2氨基酸序列与水蛭中的神经血蓝蛋白(neurohemerythrin)(长度119氨基酸，分子量13.1KD)氨基酸序列有2处完全匹配，但F2的分子量比水蛭中的神经血蓝蛋白要小。F2具有纤维蛋白溶解活性和促进人脐静脉内皮细胞tPA的释放和分泌的活性，F2还具有较强的抑菌活性。
全文摘要
从赤子爱胜(Eisenia foelide)蚯蚓中分离得到2种低分子量蚓激酶蛋白F1和F2，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定，F1的分子量是20±1KD，F2的分子量是9±1KD。F1和F2均有溶解纤维蛋白活性和促进人脐静脉内皮细胞tPA释放和分泌的活性，且tPA的分泌量与F1和F2的剂量成正相关；F1和F2还均具有一定的抑菌作用。F1和F2的蛋白质序列已经部分测定。测定结果表明，已测定的F1氨基酸序列与已报道的一种蚓激酶(蛋白编号ABW04906，分子量26.2KD)序列在2处完全匹配，但F1的分子量较小；是一种新的蚓激酶的同工酶或片段；F2的氨基酸序列与已报道的水蛭神经血蓝蛋白(长度119氨基酸，分子量13.1KD)的氨基酸序列在2处完全匹配，但F2的分子量较小，且具有抗栓活性和较强的抑菌活性。
文档编号C12N9/48GK101768579SQ20101902611
公开日2010年7月7日 申请日期2010年2月8日 优先权日2010年2月8日
发明者何执中, 尚广东, 胡文军, 张汶婕, 张玉斌 申请人:何执中