专利名称：用于从蔗糖产生甘油和甘油衍生产物的重组细菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物学和分子生物学领域。更具体地讲，本发明提供了具有利用蔗糖作为碳源来产生甘油和甘油衍生产物的能力的重组细菌和利用这种重组细菌的方法。
背景技术：
许多在商业上有用的微生物可利用葡萄糖作为其主要碳水化合物来源。然而，所开发的用于产生商业上所需的产物的微生物利用葡萄糖的缺点是葡萄糖的高费用。使用蔗糖和含有蔗糖和其他糖类的混合原料作为微生物生产系统的碳水化物来源将会是在商业上可取的，因为这些材料可容易以较低成本获得。当生产微生物可利用混合原料中存在的任何蔗糖时，其可更高效地运行。因而，当生产微生物不具有高效利用蔗糖作为主要碳源的能力时，其不能如此有效地工作。例如，细菌细胞通常显示出偏好的糖利用，以葡萄糖为最优选的。在含有的糖混合物的人造培养基中，葡萄糖通常先于其他糖类被完全代谢。此外，许多细菌缺少利用蔗糖的能力。例如，不到50%的大肠杆菌(Escherichia coli)菌株具有利用鹿糖的能力。因而，当生产微生物不能利用蔗糖作为碳水化合物来源时，希望对该微生物进行工程改造而使得其可利用蔗糖。已通过整合利用蔗糖的基因来工程改造而可利用蔗糖的重组细菌已有报道。例如，Livshits等人(美国专利6，960，455)描述了利用大肠杆菌菌株来产生氨基酸，所述菌株含有编码利用蔗糖的代谢途径的基因。此外，Olson等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.74:1031-1040，2007)描述了携带负责蔗糖降解的基因的大肠杆菌菌株，其可利用蔗糖作为碳源来产生L-酪氨酸或L-苯丙氨酸。然而，存在着对能利用蔗糖作为碳源来产生甘油和甘油衍生产物的细菌菌株的需要。发明概述
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在一个实施方案中，本发明提供了重组细菌，所述重组细菌在基因组中或在至少一个重组构建体上包含:(a) 一种或多种编码具有蔗糖转运蛋白活性的多肽或多肽复合物的核苷酸序列；(b)编码具有果糖激酶活性的多肽的核苷酸序列；和(C)编码具有蔗糖水解酶活性的多肽的核苷酸序列；其中(a)、(b)和(C)各自可操作地连接至相同的或不同的启动子，另外其中所述重组细菌能够代谢蔗糖来产生选自甘油、1，3-丙二醇和3-羟基丙酸的产物。 在第二个实施方案中，本发明提供用于从蔗糖制备甘油、I，3-丙二醇和/或3-羟基丙酸的方法，所述方法包括:a)在存在蔗糖的情况下培养本文所公开的重组细菌；以及b)任选地，回收所产生的甘油、1，3-丙二醇和/或3-羟基丙酸。简单的序列i兑明下列序列符合37C.F.R.1.8211.825 ( “对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求-序列规则”)，并且与世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(1998)和EPO和PCT的序列列表要求(规则5.2和49.5 (a bis)，以及行政指导的208节和附录C)相一致。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R.§ 1.822中所列出的规则。表A某闵和蛋白质SEQ ID号汇总
权利要求
1.重组细菌，所述重组细菌在其基因组中或在至少一个重组构建体上包含:(a)一种或多种编码具有蔗糖转运蛋白活性的多肽或多肽复合物的核苷酸序列；(b)编码具有果糖激酶活性的多肽的核苷酸序列；和(C)编码具有蔗糖水解酶活性的多肽的核苷酸序列；其中(a)、(b)和(C)各自可操作地连接至相同的或不同的启动子，另外其中所述重组细菌能够代谢蔗糖以产生选自甘油、1，3_丙二醇和3-羟基丙酸的产物。
2.权利要求1的重组细菌，其中基于ClustalV比对方法，在与SEQ ID NO:24、SEQ IDN0:26或SEQ ID NO:28中示出的氨基酸序列比较时，所述具有蔗糖转运蛋白活性的多肽具有至少95%的序列同一性。
3.权利要求1的重组细菌，其中所述具有蔗糖转运蛋白活性的多肽复合物包含:a)第一亚基，其中基于ClustalV比对方法，在与SEQ ID NO:30中示出的氨基酸序列比较时，所述第一亚基具有至少95%的序列同一性；b)第二亚基，其中基于ClustalV比对方法，在与SEQ ID NO:32中示出的氨基酸序列比较时，所述第二亚基 具有至少95%的序列同一性；和c)第三亚基，其中基于ClustalV比对方法，在与SEQ ID NO:34中示出的氨基酸序列比较时，所述第三亚基具有至少95%的序列同一性。
4.权利要求1的重组细菌，其中所述具有蔗糖转运蛋白活性的多肽复合物包含:a)第一亚基，其中基于ClustalV比对方法，在与SEQ ID NO:36中示出的氨基酸序列比较时，所述第一亚基具有至少95%的序列同一性；b)第二亚基，其中基于ClustalV比对方法，在与SEQ ID NO:38中示出的氨基酸序列比较时，所述第二亚基具有至少95%的序列同一性；c)第三亚基，其中基于ClustalV比对方法，在与SEQ ID NO:40中示出的氨基酸序列比较时，所述第三亚基具有至少95%的序列同一性；和d)第四亚基，其中基于ClustalV比对方法，在与SEQ ID NO:42中示出的氨基酸序列比较时，所述第四亚基具有至少95 %的序列同一性。
5.权利要求1的重组细菌，其中基于ClustalV比对方法，在与SEQ ID NO:44、SEQ IDNO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:85 或 SEQID NO:87中示出的氨基酸序列比较时，所述具有果糖激酶活性的多肽具有至少95%的序列同一'I"生。
6.权利要求1的重组细菌，其中基于ClustalV比对方法，在与SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62、SEQID NO:64, SEQ ID NO:66 或 SEQ ID NO:68 示出的氨基酸序列比较时，所述具有蔗糖水解酶活性的多肽具有至少95%的序列同一性。
7.权利要求1的重组细菌，其中所述具有蔗糖转运蛋白活性的多肽基本上对应于SEQID NO:26中示出的序列。
8.权利要求1的重组细菌，其中所述具有果糖激酶活性的多肽基本上对应于SEQIDNO:48中示出的序列。
9.权利要求1的重组细菌，其中所述具有蔗糖水解酶活性的多肽基本上对应于SEQIDNO:58中示出的序列。
10.权利要求1-9中任一项的重组细菌，其中所述细菌选自如下属:埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、朽1檬酸杆菌属(Citrobacter)和气杆菌属(Aerobacter)。
11.权利要求10的重组细菌，其中所述细菌为大肠杆菌。
12.用于从蔗糖制备甘油、1，3-丙二醇和/或3-羟基丙酸的方法，所述方法包括:a)在存在蔗糖的情况下培养权利要求1-9中任一项的重组细菌；以及b)任选地，回收所产生的甘油、1，3-丙二醇和/或3-羟基丙酸。
13.用于从蔗糖制备甘油、1，3-丙二醇和/或3-羟基丙酸的方法，所述方法包括:a)在存在蔗糖的情况下培养权利要求10的重组细菌；以及b)任选地，回收所产生 的甘油、1，3-丙二醇和/或3-羟基丙酸。
全文摘要
本发明描述了能从蔗糖产生甘油和甘油衍生产物的重组细菌，所述重组细菌在其基因组中或在至少一个重组构建体上包含编码具有蔗糖转运蛋白活性的多肽的核苷酸序列；编码具有果糖激酶活性的多肽的核苷酸序列；编码具有蔗糖水解酶活性的多肽的核苷酸序列。这些核苷酸序列各自可操作地连接至相同的或不同的启动子。这些重组细菌能代谢蔗糖以产生甘油和/或甘油衍生产物，例如1，3-丙二醇和3-羟基丙酸。
文档编号C12N15/52GK103080326SQ201080002241
公开日2013年5月1日 申请日期2010年12月3日 优先权日2009年12月4日
发明者A·C·埃利奥特, A·A·加滕比, T·K·范戴克 申请人:纳幕尔杜邦公司