用于生产丙酮的细胞和方法

专利名称：用于生产丙酮的细胞和方法
技术领域：
本发明涉及用于生产丙酮的细胞和方法。
背景技术：
梭菌属(Clostridium)中的 ABE 过程
经典的ABE发酵方法(即微生物生产丙酮、丁醇和乙醇)长期以来是世界上的第二大生物技术方法，仅次于酵母发酵生产乙醇。商业的ABE发酵于1916年在英格兰开始，那时 Chaim Weizmann尤其发现了丙酮丁醇梭菌(Clostridium aceiotoij^icws)形成溶剂丙酮、 丁醇和乙醇的能力。该方法直到二十世纪五十年代末期还在西方国家得到采用，甚至直到 1981年还在南非得到采用。该方法被停止，存在2个主要原因一方面，丙酮和丁醇的化学合成变得越来越有利，另一方面，发酵底物的价格急剧上涨。尤其是，由于作为牛的饲料添加剂的应用，糖蜜的价格大幅上涨。日益增加的石化原料的成本，和在微生物的途径工程领域的新技术的可能性，现在打开了开发高性能菌株和生产溶剂诸如丙酮的商业发酵方法的新选项。经典的ABE发酵是基于生物体丙酮丁醇梭菌(JJlostridium acetobutylicum)和拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii )。二者都是革兰氏阳性的，并在严格的厌氧条件下繁殖。这些生物体可以转化单糖、二糖和多糖，其中在发酵中使用的主要底物是糖蜜和淀粉。使用丙酮丁醇梭菌的发酵方法分为2个阶段。在第一个阶段，生物质形成随着乙酸盐、丁酸盐和痕量乙醇的形成(“产酸期”)而出现。在第二个阶段(所谓的“产溶剂期”)， 则将酸用于形成发酵产物丙酮、丁醇和乙醇(ABE)。产物丙酮、丁醇和乙醇在野生型丙酮丁醇梭菌中以3:6:1的近似比例形成。这些产物的比例可以广泛变化，取决于选择的培养条件(例如PH或营养物质供应)或使用的底物。已经广泛地纯化并生化地表征了丙酮、丁醇和乙醇的溶剂生物合成酶(参见 图 1; Duerre, P.,禾口 Bahl, H. 1996. Microbial production of acetone/ butanol/isopropanol.在 Biotechnology,第6卷，第 2版· M. Roehr, (编)，VCH Verlagsgesellschaft mbH, ffeinheim, Germany. 第 229 - 268 页。Duerre, P. 1998. New insights and novel developments in clostridial acetone/butanol/isopropanol fermentation. App 1. Microbiol. Biotechnol. 49: 639 - 648)。也存在丙酮丁醇梭菌的基因组序列(Noelling, J.，Breton, G.，Omelchenko, Μ. V.和 16 位其它作者 Q001)。 Genome sequence and comparative analysis of the solvent-producing bacterium Clostridium acetobutylicum. J Bacteriol 183, 4823 - 4838.)。已经生成了丙酮丁醇梭菌菌株，其中丙酮的生产已经与丁醇和乙醇的生产不相关联(entkoppeln)，所以这些菌株仅生产丙酮(Mermelstein等人(1993). Metabolic engineering of Clostridium acetobutylicum ATCC824 for increased solventproduction by enhancement of acetone formation enzyme activities using a synthetic operon. Biotech. Bioeng. 42:1053-1060. ； Nair, R. V.,禾口 Papoutsakis, Ε. Τ. 1994)。测量的丙酮的滴定度基本上低于它在野生型中的浓度。图2显示了在梭菌属中特有的经典的丙酮合成代谢途径。该途径从乙酰辅酶A(在所有微生物中形成的一种中枢(zentral)代谢物)开始，无论代谢何种碳源或建立何种代谢途径。需要的酶是β -酮硫解酶，乙酰辅酶A/ 丁酰辅酶A-转移酶的2个亚单元，和乙酰乙酸脱羧酶。已经证实，这些来自丙酮丁醇梭菌的酶(它们催化从乙酰辅酶A开始形成丙酮) (乙酰乙酸脱羧酶、乙酰辅酶A/ 丁酰辅酶A-转移酶和硫解酶)在大肠杆菌中的异源表达， 会导致在该生物体中形成约150 mM的丙酮，但是其中存在也生成大量乙酸盐(50 mM) 的缺点(Bermejo L. L. , N. E. ffelker, Ε. T. Papoutsakis. 1998. Expression of Clostridium acetobutylicum ATCC 824 Genes in Escherichia coli for Acetone Production and Acetate Detoxification. App1. Env. Microbiol. 64:1079-1085)。在这里，另一个缺点是，仅在好氧条件下生成丙酮，因为在葡萄糖向乙酰辅酶A代谢过程中形成的氧化还原当量不能在厌氧条件下被大肠杆菌重新氧化。描述的所有方法共有的缺点是，它们需要复杂的碳源，例如糖类。产乙酸细胞
已知了产乙酸细胞，即能够借助于厌氧呼吸形成乙酸盐的细胞。产乙酸细菌包括例如醋酸杆菌属的物种，诸如伍氏醋酸杆菌(A rooi/ii)和醋酸梭菌(Clos tridium ace ticum )。W00068407描述了使用产乙酸细菌生产乙醇。最近已经存在扬氏梭菌(C Λ/ω^ 似id的基因组序列。尚未公开醋酸梭菌截 C. car力奴ii/irara/^的基因组序列。但是已知，醋酸梭菌额外携带一个质粒(5.6 kBp, Lee 等人，1987)。目前，尚未公开用于遗传地修饰这些生物体的技术。产乙酸细菌群属于厌氧原核生物，它们能够利用CO2作为末端电子受体，并形成乙酸盐。目前，21个不同的属属于产乙酸菌(Drake等人，2006)，其中一些梭菌也属于此(Drake & Kilsel，2005)。它们能够利用二氧化碳+氢或甚至一氧化碳作为碳源和能源(Wood，1991)。另外，醇类、醛类、羧酸类和多种己糖也可以用作碳源(Drake等人， 2004)。导致乙酸盐形成的还原代谢途径被称作乙酰辅酶A或Wood-Ljungdahl途径。本发明的目的在于，提供能从随处可得到的碳源生产丙酮的方法。

发明内容
令人惊奇地发现，下文所述的细胞和方法达成了本发明的目的。因此，本发明的主题在于如权利要求1中所述的细胞。本发明另一主题在于使用根据本发明的细胞生产丙酮的方法。本发明的一个优点是，细胞可以是厌氧的，因此可以在能量方面特别有利地培养。本发明的另一个优点是，根据本发明的细胞为减少破坏气候的二氧化碳作出贡献。根据本发明的细胞的另一个优点是，通过从二氧化碳和氢生产丙酮产量提高。
本发明的主题在于能够形成丙酮的产乙酸细胞。在本发明的上下文中，术语“产乙酸细胞”是指能够借助于厌氧呼吸形成乙酸盐的细胞。除非另有说明，给出的所有百分比是重量百分比。优选地，产乙酸细胞是分离的、尤其是遗传修饰的细胞。根据本发明，能够从选自二氧化碳和一氧化碳的至少一种碳源形成丙酮的细胞是优选的。特别优选地，根据本发明的产乙酸细胞能够从作为唯一碳源的一氧化碳和二氧化碳形成丙酮。本领域技术人员众所周知，借助于重组基因技术，可以提高在生物系统中的产物产量。因此，根据本发明更优选地，产乙酸细胞相对于它的野生型以如下方式被遗传地修饰使得它能够形成比它的野生型更多的丙酮。表述“使得它能够形成比它的野生型更多的丙酮”也涉及这样的情况遗传修饰的细胞的野生型根本不能形成任何丙酮，或至少不会形成可检测量的该化合物，且只有在遗传修饰以后，才可以形成可检测量的该组分。细胞的“野生型”优选地表示这样的细胞，其基因组处于诸如通过进化自然产生的状态。该术语既用于完整细胞也用于单个基因。术语“野生型”因此特别地不包括这样的细胞和/或这样的基因其基因序列由人类借助于重组方法至少部分地改变。优选地如此遗传修饰这些细胞使得它们可以从碳源形成比它们的野生型更多的丙酮。此外，根据本发明优选地，如此遗传修饰产乙酸细胞使得在确定的时间间隔，优选地在2小时内，更优选地在8小时内，最优选地在M小时内，它形成为野生型细胞至少 2倍多、特别优选至少10倍、更优选至少100倍、甚至更优选至少1000倍和最优选至少10 000倍的丙酮。可以如下测定产物形成的增加例如，根据本发明的细胞和野生型细胞分别在相同的条件下(相同的细胞密度，相同的营养培养基，相同的培养条件)，在合适的营养培养基中培养一定的时间间隔，然后测定营养培养基中目标产物(丙酮)的量。在这种情况下，优选地，所述细胞具有与它的野生型相比增加的至少一种下述酶的活性
酶E1，其催化乙酰辅酶A向乙酰乙酰辅酶A的反应； 酶E2,其催化乙酰乙酰辅酶A向乙酰乙酸盐的反应； 酶E3,其催化乙酰乙酸盐向丙酮的反应。在上文中和在下文中使用的表述“与它的野生型相比增加的酶Ex的活性”优选地总是表示增加到下述倍数的各种酶Ex的活性至少2，特别优选地至少10，更优选地至少 100，甚至更优选地至少1000，最优选地至少10 000。此外，具有“与它的野生型相比增加的 _EX的活性”的根据本发明的细胞特别地也包括这样的细胞其野生型不具有或具有至少不可检测的酶Ex的活性，且只有在增加酶活性以后(例如通过过表达)才表现出该酶Ex的可检测的活性。在这种情况下此术语“过表达”或在下文中使用的表述“表达的增加”也包括这样的情况起始细胞(例如野生型细胞)不具有或具有至少不可检测的表达，且只有通过重组方法，才诱导酶Ex的可检测的表达。在这种情况下，特别优选的细胞是这样的细胞，其中下述一种或多种酶的活性被增加=EpEyEpE1 + EyE1 + E3、E2 + E3^E1 + E2 + E3,其中 E1 + E2 + E3 是特别优选的。
此外，根据本发明优选地，酶E1是乙酰辅酶A-C-乙酰基转移酶(EC 2.3. 1.9)； 酶E2是丁酸乙酰乙酸辅酶A-转移酶(EC 2. 8. 3. 9)或酰基辅酶A水解酶(EC
3. 1. 2. 20)；
酶E3是乙酰乙酸脱羧酶(EC 4. 1. 1. 4)。特别优选地，用作酶E1的酶是得自丙酮丁醇梭菌的thlAo特别优选地，用作酶E2的丁酸乙酰乙酸辅酶A-转移酶为得自丙酮丁醇梭菌的 CtfA和CtfB以及得自大肠杆菌的atoD和atoA。特别优选地，用作酶E2的酰基辅酶A水解酶为得自枯草芽孢杆菌O , subtilis) 的ie//或得自流感嗜血杆菌influenzae)的冲^1。特别优选地，用作酶&的酶是得自丙酮丁醇梭菌的<3论。根据本发明的产乙酸细胞优选地是微生物，优选细菌，特别优选厌氧细菌，尤其是杆状革兰氏阳性细菌。非常特别优选地，使用的产乙酸细胞选自凯伍产醋菌如cter kivui)、伍氏醋酸杆菌(.Acetobacterium woodii)、i朝、湿厌氧醋菌(Acetoanaerobium floiera人醋酸梭菌、食甲基丁酸杆菌(^/ij^i^acieri腫me thyIo trophicum ),丙酮丁醇梭菌、热醋梭菌菌(.Moorella thermoacetica )、粘液真杆菌(.Eubacterium h'fflo^ )、产生消化链球菌(Pep tos trep tococcus produc tus)、扬氏梭菌(Clos tridium 1 jungdahlii)禾口 Clostridium carboxidivorans ο 一禾中特另ll适合的细菌是腫 carboxidivorans, 尤其是菌株诸如“P7”和“PI 1 ”。所述细胞描述在例如US 2007/0275447和US 2008/0057554 中。另一种特别适合的细菌是扬氏梭菌，尤其是选自下述的菌株扬氏梭菌PETC、扬氏梭菌ERI2、扬氏梭菌COl和扬氏梭菌0-52的菌株，且描述在WO 98/00558和WO 00/68407中。本发明的另一主题在于生产丙酮的方法，所述方法包括下述工艺步骤A)使根据本发明的细胞接触营养培养基，所述营养培养基包含至少一种选自二氧化碳和一氧化碳的碳源，B)在能够使所述细胞形成丙酮的条件下，培养细胞，和C)任选地，分离形成的丙酮。优选地在厌氧条件下，根据本发明的产乙酸细胞能够由至少一种选自二氧化碳和一氧化碳的碳源形成丙酮。关于这些底物的来源，显而易见，存在许多可能的来源以提供CO或(X)2作为碳源。 很明显，在实践中可以用能够给产乙酸细胞供应足够量碳的任意气体或气体混合物作为本发明的碳源，使得它能够进行它的厌氧呼吸，并形成丙酮。在根据本发明的方法中，优选地，碳源由废气提供，所述废气例如合成气、烟道气、 炼油厂废气、通过酵母发酵或梭菌发酵产生的气体、含有纤维素的物质的气化或煤气化产生的废气。这些废气不一定需要作为其它过程的副作用而形成，可以为了用于根据本发明的方法中而特别地生产。很明显，在实践中可以用能够给产乙酸细胞供应足够量碳的任意废气作为本发明的碳源，使得它能够进行它的厌氧呼吸。在根据本发明的方法的一个优选的实施方案中，所述碳源是合成气。
合成气可以例如由煤气化的副产物提供。产乙酸细胞因此将作为废物的物质转化成有价值的原料。或者，通过广泛可得到的、价格便宜的农业原料的气化，可以为根据本发明的方法
提供合成气。存在许多可以转化成合成气的原料的实例，因为几乎所有的植物形式都可以用于该目的。优选的原料选自多年生的草诸如中国芦苇、谷类残渣、加工废物诸如锯屑。通常，在气化器中从干燥的生物质得到合成气，主要通过热解、部分氧化和蒸气重整，其中主要产物是CO、H2和CO2。一般而言，一部分产物气体经再加工，以便优化产物产率，并避免焦油形成。使用石灰和/或白云石，可以将不希望的焦油裂解成合成气和Co。这些方法详细描述在例如 Reed, 1981 (Reed, Τ. B. , 1981, Biomass gasification: principles and technology, Noves Data Corporation, Park Ridge, NJ.)中。不同来源的混合物也可以用作碳源。在根据本发明的方法中使用的营养培养基必须以适当的方式满足各自菌株的要求。在美国细菌学学会(American Society for Bacteriology)的手册“Manual of Methods for General Bacteriology" (Washington D. C. , USA, 1981)中，给出了不同微生物的营养培养基的描述。除了碳源以外，营养培养基特别地含有氮源和磷源、盐和pH控制剂。作为氮源可以使用含有有机的含氮化合物(诸如蛋白胨、酵母浸出物、肉膏、麦芽膏、玉米浆、大豆粉和尿素)或无机化合物(诸如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)。 可以单独地或作为混合物使用氮源。营养培养基可以含有磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐作为磷源。 培养基必须另外含有生长必需的金属盐，例如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了前述物质以外， 可以使用必需的生长素(诸如氨基酸和维生素)。所述加入的物质可以以一次性批料的形式加入培养物中，或可以在培养过程中以合适的方式供给。为了控制培养物的pH，可以适当地使用碱性化合物(诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水)或酸性化合物(诸如磷酸或硫酸)。为了控制泡沫的产生，可以使用消泡剂诸如脂肪酸聚乙二醇酯。为了维持质粒的稳定性，可以将适当的具有选择作用的物质(例如抗生素) 加入培养基中。在根据本发明的方法的工艺步骤B)中，在使细胞能够形成丙酮的条件下，培养产乙酸细胞。优选地，所述培养在厌氧条件下进行。为了生产丙酮的目的，根据本发明的遗传修饰的细胞可以连续地或不连续地以分批工艺(分批培养)，或补料-分批工艺(馈料式工艺)或反复补料-分批工艺(反复馈料式工艺)，接触营养培养基，并由此进行培养。半连续工艺也是可考虑的，如在GB-A-1009370中所述。已知的培养方法的概述描述在 Chmiel 的教科书(“Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik" (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))或 Storhas 的教禾斗书("Bioreaktoren und periphere Einrichtungen，，，Vieweg Verlag, Braunschweig/
7Wiesbaden, 1994)中。其它非常适用于在工艺步骤B)中培养产乙酸细胞的方法描述在例如DOE报 1PT "Bench-scale Demonstration of Biological Production of Ethanol from Coal Synthesis Gas，，，Topical Report 5，1995 年 11 月(DOE 合同号 DE-AC22-92PC92118)和文件 WO 98/00558、WO 00/68407 和 WO 02/08438 中。在根据本发明的方法的步骤C)中，可以任选地从细胞和/或营养培养基分离由细胞形成的丙酮，其中可以考虑本领域技术人员已知的所有从复杂组合物分离小分子物质的方法用于分离。在这点上，例如可以列举借助于适当溶剂的沉淀，借助于适当溶剂的萃取，络合 (例如借助于环糊精或环糊精衍生物)，结晶，通过色谱法纯化和/或分离，或将丙酮转化成可以容易地分离的衍生物。通过蒸馏的分离方法特别适用于工艺步骤C)。本发明的另一组成部分是根据本发明的方法可以得到的丙酮。在下面呈现的实施例中，通过例证描述了本发明，但是本发明不限于在实施例中呈现的实施方案，本发明的应用范围由整个说明书和权利要求书确定。下面的附图形成本公开内容的一部分

图1:经典的梭菌ABE方法的生物合成途径图2:丙酮丁醇梭菌中丙酮的生物合成途径图 3:质粒图谱 pUC_adc_ctfAB_thlA:
图 4:质粒图谱 pIMP_adc_ctfAB_thlA:。实施例
实施例1.表达载体的克隆
为了在产乙酸细胞中生产丙酮，克隆进大肠杆菌XL2 blue中。为此，在质粒pIMPl上排列下述基因
来自丙酮丁醇梭菌的ctfA和ctfB， 或来自大肠杆菌的atoA和atoD， 或来自枯草芽孢杆菌的te//， 和/或来自流感嗜血杆菌的冲^；
连同来自丙酮丁醇梭菌的基因沩以(Mermelstein等人，1992)。在表1中汇总了相应的表达质粒的一览表。表1:质粒依次克隆所述基因。为此，为扩增所述基因首先通过导入相应酶切位点设计寡核苷酸(表幻，然后扩增所有片段。表2:寡核苷酸
权利要求
1.产乙酸细胞，其能够形成丙酮。
2.权利要求1的产乙酸细胞，其特征在于，它能够从至少一种选自二氧化碳和一氧化碳的碳源形成丙酮。
3.权利要求1或2的产乙酸细胞，其特征在于，与它的野生型相比，以如下方式对其进行遗传地修饰使得它能够形成比它的野生型更多的丙酮。
4.权利要求1-3中至少一项的产乙酸细胞，其特征在于，与它的野生型相比，其具有增加的至少一种下述酶的活性酶E1，其催化乙酰辅酶A向乙酰乙酰辅酶A的反应；酶E2,其催化乙酰乙酰辅酶A向乙酰乙酸盐的反应；酶E3,其催化乙酰乙酸盐向丙酮的反应。
5.权利要求4的产乙酸细胞，其特征在于，所述酶E1是乙酰辅酶A-C-乙酰基转移酶(EC 2. 3. 1. 9)；所述酶氏是丁酸乙酰乙酸辅酶A-转移酶(EC 2.8.3.9)或酰基-CoA-水解酶(EC 3. 1. 2. 20)；所述酶E3是乙酰乙酸脱羧酶(EC 4. 1. 1. 4)。
6.权利要求1-5中至少一项的产乙酸细胞，其特征在于，它是选自下述的微生物凯伍产醋菌、伍氏醋酸杆菌、潮湿厌氧醋菌、醋酸梭菌、食甲基丁酸杆菌、丙酮丁醇梭菌、热醋梭菌、粘液真杆菌、产生消化链球菌、扬氏梭菌和Clostridium carboxidivorans。
7.—种生产丙酮的方法，所述方法包括下述工艺步骤A)使权利要求1-6之一的细胞接触营养培养基，所述营养培养基包含至少一种选自二氧化碳和一氧化碳的碳源；B)在能够使所述细胞形成丙酮的条件下，培养所述细胞；C)任选地，分离所形成的丙酮。
8.能通过权利要求7的方法得到的丙酮。
全文摘要
本发明涉及用于生产丙酮的细胞和方法。
文档编号C12N9/10GK102414314SQ201080017774
公开日2012年4月11日 申请日期2010年2月23日 优先权日2009年4月23日
发明者梅伊 A., 勒登 G., 布兰 G., 格伦德 G., J 巴尔 H., 多德雷尔 K., 奥尔舍尔 M., 迪雷 P., 菲舍尔 R-J., 图姆 S., 贝克 U. 申请人:赢创德固赛有限责任公司