专利名称：具有改善的阿拉伯糖利用率的发酵单胞菌属细菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物学和发酵的领域。更具体地讲，描述了赋予改善的阿拉伯糖利用率的发酵单胞菌属菌株以及使用该菌株制备乙醇的方法。
背景技术：
通过微生物生产乙醇提供了一种替代化石燃料的可供选择的能源，因此成为当前研究的重要领域。希望生产乙醇以及其他产品的微生物以能够利用木糖和阿拉伯糖作为碳源，因为这些糖是水解木质纤维质材料中的主要戊糖，它们能够提供丰富可利用的低成本碳底物源用于在发酵中的生物催化利用。天然不可利用木糖和阿拉伯糖的运动发酵单胞菌和其他产乙醇细菌可进行遗传工程化以利用这些糖。为了提供木糖利用能力，已经对菌株进行工程化以表达编码以下蛋白的基因1)木糖异构酶，其催化木糖转化成木酮糖；幻木酮糖激酶，其将木酮糖磷酸化以形成5-磷酸木酮糖；幻转酮醇酶；和4)转醛醇酶(US 5514583，US 6566107 ；Zhang等人 (1995) Science 267:240-243)。为了提供阿拉伯糖利用能力，已经导入了编码以下蛋白的附加基因1) L-阿拉伯糖异构酶，其将L-阿拉伯糖转化成L-核酮糖，2) L-核酮糖激酶，其将L-核酮糖转化成L-5-磷酸核酮糖，和幻L-5-磷酸核酮糖-4-差向异构酶，其将L-5-磷酸核酮糖转化成D-木酮糖(US5843760)。虽然已经将一些运动发酵单胞菌的菌株进行工程化以利用阿拉伯糖，但这些工程化菌株通常仅利用发酵培养基中存在的低百分比的阿拉伯糖。当在包含阿拉伯糖的培养基中进行发酵时，需要改善发酵单胞菌属和其他产乙醇细菌的阿拉伯糖利用率以促进乙醇生产。发明概述本发明涉及发酵单胞菌属和发酵杆菌属菌株，它们通过导入表达阿拉伯糖-质子同向转运体的基因进行遗传工程化以具有改善的阿拉伯糖利用能力，并利用这些菌株生产乙醇。当在包含阿拉伯糖的培养基中生长时，这些菌株具有改善的乙醇生产。因此，本发明提供发酵单胞菌属或发酵杆菌属的重组微生物，它们利用阿拉伯糖以生产乙醇，所述微生物包含至少一种编码阿拉伯糖-质子同向转运体的异源基因。此外，本发明提供生成发酵单胞菌属或发酵杆菌属重组微生物的方法，它们具有提高的阿拉伯糖利用率，所述方法包括a)提供在合适条件下利用阿拉伯糖来生产乙醇的重组发酵单胞菌属或发酵杆菌属菌株；以及b)将至少一种编码阿拉伯糖-质子同向转运体的异源基因导入(a)的菌株。在另一个实施方案中本发明提供生产乙醇的方法，所述方法包括
a)提供利用阿拉伯糖来生产乙醇的重组发酵单胞菌属或发酵杆菌属菌株，所述菌株包含至少一种编码阿拉伯糖-质子同向转运体的异源基因；b)在包含阿拉伯糖的培养基中培养(a)的菌株，从而由所述菌株将阿拉伯糖转化成乙醇。在另一个实施方案中本发明提供由利用阿拉伯糖的微生物改善阿拉伯糖利用率的方法，所述方法包括(a)提供利用阿拉伯糖的微生物，其中所述微生物选自利用阿拉伯糖来生产乙醇的重组发酵单胞菌属或发酵杆菌属菌株；(b)将至少一种编码阿拉伯糖-质子同向转运体的异源基因导入所述微生物的基因组，其中所述转运体由所述微生物表达；以及(c)使(b)的所述微生物接触包含阿拉伯糖的培养基，其中所述微生物以比缺乏阿拉伯糖-质子同向转运体的所述微生物提高的速率代谢所述阿拉伯糖。附图简沭和序列描述通过下面的具体实施方式
、附图和随附的序列描述可以更全面地理解本发明，这些详细描述、附图和序列描述形成本专利申请的一部分。
图1示出经工程化以利用木糖和阿拉伯糖的发酵单胞菌属中的乙醇发酵途径，其中gif指葡萄糖易化扩散转运蛋白。图2是pARA205的质粒图谱。图3是pARA354的质粒图谱。图 4 示出在 96 小时内 MRM3A5 中的 ZW705 (a)、ZW705-ara354 (b)、禾口 ZW705-ara354A7 (c)的生长和代谢特征图。图 5 示出在 96 小时内 MRM3A2. 5X2. 5G5 中的 ZW705 (a)、ZW705-ara354 (b)、和 ZW705-ara354A7 (c)的生长和代谢特征图。图6是pARA112的质粒图谱。图7是pARA113的质粒图谱。图 8 示出在 96 小时内 MRM3A5 中的 ZW705_ara354A7 (a)、 ZW705-ara354A7-arall2-2 (b)和 ZW705-ara354A7-arall2_3 (c)的生长和代谢特征图。图 9 示出在 96 小时内 MRM3A2. 5X2. 5G5 中的 ZW705_ara354A7 (a)、 ZW705-ara354A7-arall2-2 (b)和 ZW705-ara354A7-arall2_3 (c)的生长和代谢特征图。图 10 示出在 96 小时内 MRM3A5 中的 ZW705_ara354 (a)、 ZW705-ara354-arall2-l (b)和 ZW705-ara3M-arall2_2 (c)的生长和代谢特征图。图 11 示出在 96 小时内 MRM3A2. 5X2. 5G5 中的 ZW705_ara354 (a)、 ZW705-ara354-arall2-l (b)和 ZW705-ara3M-arall2_2 (c)的生长和代谢特征图。图 12 示出在 96 小时内 MRM3A5 中的 ZW801 _ara354 (a)、 ZW801-ara354-arall2-5 (b)和 ZW801-ara3M-arall2_6 (c)的生长和代谢特征图。图 13 示出在 96 小时内 MRM3A2. 5X2. 5G5 中的 ZW801_ara;354 (a)、 ZW801-ara354-arall2-5 (b)和 ZW801-ara3M-arall2_6 (c)的生长和代谢特征图。下列序列符合37C. F. R. 1. 821-1. 825 (“对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求一序列规则”)，并且与世界知识产权组织(WIPO)标准ST. 25(1998)和EPO和PCT的序列列表要求(规则5. 2和49. 5 (a-bis)，以及行政指导的208节和附录C)相一
致。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C. F. R.§ 1.822中所列出的规定。表1 :araE编码的阿拉伯糖-质子同向转运体的蛋白和编码区SEQ ID NO
权利要求
1.利用阿拉伯糖来生产乙醇的发酵单胞菌属或发酵杆菌属重组微生物，所述微生物包含至少一种编码阿拉伯糖-质子同向转运体的异源基因。
2.权利要求1的重组微生物，其中，所述阿拉伯糖-质子同向转运体由araE基因的编码区来编码。
3.权利要求1的重组微生物，其中，阿拉伯糖利用率与亲本微生物相比改善了至少约 10%，其中所述亲本微生物缺少所述至少一种编码阿拉伯糖-质子同向转运体的异源基因。
4.权利要求1的重组微生物，其中，所述菌株额外地利用木糖以生产乙醇。
5.用于生成具有提高的阿拉伯糖利用率的发酵单胞菌属或发酵杆菌属重组微生物的方法，所述方法包括a)提供在合适条件下利用阿拉伯糖来生产乙醇的重组发酵单胞菌属或发酵杆菌属菌株；以及b)将至少一种编码阿拉伯糖-质子同向转运体的异源基因导入(a)的所述菌株。
6.根据权利要求5的方法，所述方法还包括或者在步骤(b)之前或者在步骤(b)之后、 或者既在步骤(b)之前又在步骤(b)之后通过在包含阿拉伯糖作为所述唯一碳源的培养基中连续生长来使所述菌株适应，从而生产适应菌株，并且其中所述菌株与未适应的菌株相比具有进一步改善的阿拉伯糖利用率。
7.根据权利要求6的方法，其中，所述适应菌株在混合糖培养基中额外地利用木糖和葡萄糖来生产乙醇，所述混合糖培养基包含阿拉伯糖、木糖和葡萄糖。
8.生产乙醇的方法，所述方法包括a)提供利用阿拉伯糖来生产乙醇的重组发酵单胞菌属或发酵杆菌属菌株，所述菌株包含至少一种编码阿拉伯糖-质子同向转运体的异源基因；以及b)在包含阿拉伯糖的培养基中培养(a)的所述菌株，从而将阿拉伯糖转化成乙醇。
9.根据权利要求9的方法，其中，所述阿拉伯糖-质子同向转运体由araE基因的编码区编码。
10.根据权利要求8的方法，其中，阿拉伯糖利用率与亲本微生物相比改善了至少约 10%，其中，所述亲本微生物缺少编码阿拉伯糖-质子同向转运体的异源基因。
11.根据权利要求8的方法，其中，(a)的所述菌株还能够利用木糖和葡萄糖来生产乙醇。
12.根据权利要求8的方法，其中，(a)的所述菌株已经通过在包含阿拉伯糖作为所述唯一碳源的培养基中连续生长进行了适应，从而生产阿拉伯糖适应菌株，其中所述阿拉伯糖适应菌株与未适应的(a)的所述菌株相比具有提高的乙醇产量。
13.根据权利要求8的方法，其中，阿拉伯糖到乙醇的转化率相对于重组亲本菌株的阿拉伯糖到乙醇的转化率提高，所述重组亲本菌株不含至少一种编码阿拉伯糖-质子同向转运体的异源基因。
14.根据权利要求13的方法，其中阿拉伯糖到乙醇的转化率比重组亲本菌株的阿拉伯糖到乙醇的转化率提高至少约10%，所述重组亲本菌株不含至少一种编码阿拉伯糖-质子同向转运体的异源基因。
15.根据权利要求8的方法，其中，所述培养基包含含有阿拉伯糖的糖混合物，或者作为唯一糖的阿拉伯糖。
16.通过利用阿拉伯糖的微生物改善阿拉伯糖利用率的方法，所述方法包括(a)提供利用阿拉伯糖的微生物，其中，所述微生物选自利用阿拉伯糖来生产乙醇的重组发酵单胞菌属或发酵杆菌属菌株；(b)将至少一种编码阿拉伯糖-质子同向转运体的异源基因导入所述微生物的基因组，其中所述转运体由所述微生物表达；以及(c)使(b)的所述微生物接触包含阿拉伯糖的培养基，其中，所述微生物以与缺乏所述阿拉伯糖-质子同向转运体的所述微生物相比提高的速率代谢所述阿拉伯糖。
全文摘要
本发明涉及工程化若干个阿拉伯糖利用发酵单胞菌属菌株以表达阿拉伯糖-质子同向转运体，其被发现向所述菌株提供改善的阿拉伯糖利用能力。这些菌株在包含阿拉伯糖的培养基中具有改善的乙醇产量，所述阿拉伯糖作为唯一碳源，或者作为糖混合物中的其中一种糖。
文档编号C12N1/21GK102459570SQ201080027108
公开日2012年5月16日 申请日期2010年6月10日 优先权日2009年6月18日
发明者J·杨 申请人:纳幕尔杜邦公司