专利名称：含有4’-去甲基川陈皮素或4’-去甲基橘皮素作为活性成分的神经突起伸长剂、记忆力改 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种4’ -去甲基川陈皮素或4’ -去甲基橘皮素的制造方法，该制造方法包括利用特定种类的曲霉菌C^/^r^/Bmmold)对特定种类的柑橘的皮进行发酵而获得发酵物。本发明还涉及一种含有所述化合物作为活性成分的药物制剂(神经突起伸长齐U、记忆力改善剂、或抗阿尔茨海默氏症剂)。
背景技术：
作为多甲氧基黄酮类的川陈皮素(nobiletin)和橘皮素(tangeretin)是柑橘所特有的黄酮类，近年来已发现这类化合物具有多种生理活性，如预防癌症、延缓衰老和抗动脉粥样化活性。此外，已有报道川陈皮素具有阿尔茨海默氏症改善活性(参见非专利文献 1)和神经突起伸长活性(参见专利文献1)。另一方面，关于川陈皮素和橘皮素生理活性的所有研究是对于川陈皮素和橘皮素本身(未改变的化合物)进行的，但是近来的报道指出这两种化合物自小肠粘膜被吸收并被代谢成为一些去甲基化的化合物，这两种化合物中的6-甲氧基均被部分地去甲基化(参见非专利文献2)。使用以下的合成的去甲基化化合物对川陈皮素癌症抑制活性的研究的实例表明 就通过抑制一氧化氮(NO)、诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)和环氧化酶-2(C0X-2)的合成来防止癌症发生的效果(其中NO、iNOS和C0X-2促进炎症及癌症发生)而言，三种去甲基化的去甲基川陈皮素(特别是，3’-去甲基川陈皮素、4’-去甲基川陈皮素、和3’，4’-二去甲基川陈皮素)均具有显著高于川陈皮素本身的效果。特别是，4’-去甲基川陈皮素具有高活性(参见非专利文献3)。作为存在于柑橘中且具有羟基的多甲氧基黄酮类，对在5或3’位具有羟基的从柑橘中获得的两种多甲氧基黄酮类(特别是，5-羟基-3，6，7，8，3’，4’ -六甲氧基黄酮和 3’ -羟基-5，6，7-三甲氧基黄酮)的生理活性研究也表明，这些化合物强烈抑制iNOS和 C0X-2的mRNA表达并且诱导乳癌细胞的凋亡。以上两个研究均提示，通过用羟基取代部分甲氧基显著增强多甲氧基黄酮类的生理功能，去甲基多甲氧基黄酮类有望用作功能成分。然而，任何目前已知天然物质中所含有的、其中部分甲氧基已被羟基取代的这种多甲氧基黄酮类的含量却非常低，因此使用这些物质作为原材料来提取并应用该成分是不现实的。引用文献列表
专利文献
专利文献1:日本特开2002-60340号公报非专利文献非专利文献 1 J Pharmacol Exp Ther. 2008, 326:739 非专利文献 2 =Koga N. et al. :Biol. Pharm. Bull.，2007，30:2317 非专利文献 3:Li S. et al. :Bioorg. Med. Chem. Lett.，2007，17:5177。
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的是解决上述问题，并且通过原材料容易获得、步骤简单、口服摄入安全性高的方法来制造具有优异生理活性的去甲基多甲氧基黄酮。解决问题的手段
鉴于上述情况，本发明的发明人利用以高含量含有多甲氧基黄酮类的柑橘皮尝试了多种生物转化，结果发现通过利用特定种类的曲霉菌进行发酵可产生部分去甲基化的多甲氧基黄酮类。然后，本发明人阐明了这些化合物具有4’-去甲基川陈皮素和4’_去甲基橘皮素的分子结构，它们均具有优异的癌症预防活性并且在4’位被羟基取代。同时，本发明的发明人首次发现4’ -去甲基川陈皮素和4’ -去甲基橘皮素均具有神经突起伸长活性。此外，本发明人发现这两个合物与未改变的化合物(即，川陈皮素和橘皮素)相比具有显著增强的活性。此外，本发明人还发现这两个化合物具有优异的记忆改善活性。本发明基于上述发现而完成。亦即，本发明的第一方面涉及4’ -去甲基川陈皮素的制造方法，该方法包括 禾1J 用选自白曲霉(Aspergillus kawachii)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、酱油曲霉{Aspergillus sojae)、斋藤曲霉(Aspergillus ■saitoi)、宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)的一种以上曲霉菌对柑橘皮或其水提取物进行发酵而获得发酵物，其中所述皮来源于选自属于柑橘属后生柑橘(Metacitrus)亚属柑组的柑橘类或者属于柑橘属初生柑橘(Archicitrus)亚属橙组的柑橘类中的至少一种柑橘。此外，本发明的第二发明涉及一种4’ -去甲基橘皮素的制造方法，该方法包括利用选自白曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、酱油曲霉、斋藤曲霉和宇佐美曲霉的一种以上曲霉菌对柑橘皮或其水提取物进行发酵而获得发酵物，其中所述皮来源于选自属于柑橘属后生柑橘亚属柑组的柑橘类或者属于柑橘属初生柑橘亚属橙组的柑橘类中的至少一种柑橘。此外，本发明的第三方面涉及一种神经突起伸长剂，其含有4’_去甲基川陈皮素作为活性成分。此外，本发明的第四方面涉及一种神经突起伸长剂，其含有4’_去甲基橘皮素作为活性成分。此外，本发明的第五方面涉及一种神经突起伸长剂，其含有4’_去甲基川陈皮素和4’ -去甲基橘皮素作为活性成分。此外，本发明的第六方面涉及一种记忆改善剂或抗阿尔茨海默氏症剂，其含有 4’ -去甲基川陈皮素作为活性成分。此外，本发明的第七方面涉及一种记忆改善剂或抗阿尔茨海默氏症剂，其含有 4’ -去甲基橘皮素作为活性成分。
此外，本发明的第八方面涉及一种记忆改善剂或抗阿尔茨海默氏症剂，其含有 4’ -去甲基川陈皮素和4’ -去甲基橘皮素作为活性成分。发明的效果
本发明通过利用特定的曲霉菌对用作原材料的特定柑橘进行发酵(利用原材料非常容易获得且步骤非常简单的方法)，而使作为优异功能成分的4’ -去甲基川陈皮素和4’ -去甲基橘皮素的简单大规模生产成为可能。本发明还使得可提供来源于天然食用植物的、安全的4’_去甲基川陈皮素和 4’-去甲基橘皮素。本发明还使得可提供一种含有上述4’ _去甲基川陈皮素或4’ _去甲基橘皮素作为活性成分的功能食品或饮料或药物制剂(癌症预防剂、神经突起伸长剂、记忆改善剂、或抗阿尔茨海默氏症剂)。
[图1]为显示在实施例1中利用曲霉菌进行发酵前后的HPLC分析结果的图。[图2]为显示在实施例4中所确定的4’_去甲基川陈皮素的分子结构的图。[图3]为在实施例5中所确定的4’-去甲基橘皮素的分子结构的图。[图4]为在实施例6中对多种试样的神经突起伸长活性进行比较的图像。[图5]为在实施例9中将试样给予小鼠给药时对自发变换行为(代表空间工作记忆的指标)进行比较的图表。
具体实施例方式在下文中对本发明进行详细说明。本发明涉及一种4’ -去甲基川陈皮素或4’ -去甲基橘皮素的制造方法，该方法包括利用特定种类的曲霉菌对特定种类的柑橘的皮进行发酵而获得发酵物。本发明还涉及一种含有所述化合物作为活性成分的药物制剂(神经突起伸长剂、记忆改善剂、或抗阿尔茨海默氏症剂)。[原材料]
可用于本发明的原材料，是含有多甲氧基黄酮类(具体地，川陈皮素和橘皮素)的柑橘的“皮”。应当指出的是也可使用水果(全果包括果皮、果汁、果肉、和种子)，但从多甲氧基黄酮含量和废物有效利用的观点来看，理想的是仅使用果皮。应当指出的是，也可使用包含柑橘植物其它部分(如叶、芽、茎、和花)的原材料， 但从多甲氧基黄酮含量的观点来看，理想的是该材料不包含这些部分。任何属于柑橘属后生柑橘亚属柑组的柑橘或者属于柑橘属初生柑橘亚属橙组的柑橘，无论品种和系统如何均可使用。这里，后生柑橘亚属中的柑组或者初生柑橘亚属中的橙组是由田中长三郎的分类所定义的分类学组(Tanaka T. ,Bull. Univ. Osaka Pref.，Ser. B. 21，139-145 (1969))，柑组包括温州蜜柑(jCitrus ω /)、芦柑(jCitrus reticulate笔栊柑)、橘柚(CYir^s mandarin,又名地中海橘柚)、红橘(又名丹西橘)、地蜜柑ijOitrus mccom)、立花橘 iPitrus tachibana) >^Lffi (Pitrus kinokuni) ^jro5FIS (fitrus depressa)、Shikaikan、矢橘(Citrus 彻osa)、禾口日本酸橘(Citrus keraji) 0同时，橙组包括甜橙、伏令夏橙(C/ir狀sinensis、伊予柑(CYir狀 、日向夏蜜ttf {Citrus iaffluraaa)、禾口春光ttf、Citrus shunkokan) 0特别是从多甲氧基黄酮含量和废物有效利用的观点来看，优选柑组的芦柑(又名栊柑)、扁平橘、红橘和立花橘。本发明中用作原材料的柑橘，优选使用刚收获采集的新鲜水果或用水清洗的水果，但也可使用经干燥、冷冻或长期保存的水果。此外，在本发明中用作原材料的柑橘可以原样的形式使用，但优选利用切割、破碎和研磨中的任一种方式对柑橘进行处理。此步骤包括对用作原材料的柑橘的多种处理，例如切割成几大块、切割成小块、破碎、研磨和粉碎。优选地，该步骤通过将原材料切割成尺寸约为1厘米至数厘米的大块来进行。此外，也可使用通过预先从这种原材料中提取(特别是水提取)多甲氧基黄酮类所获得的提取产品(提取物或干燥物)、或者以纯多甲氧基黄酮类的形式所分离的产品。应当指出的是，就水提取物的条件而言，所述提取可通过如下方式进行以果皮的 1至50倍(重量比)、优选2至15倍的量加入溶剂，在0°C至溶剂沸点、优选室温至溶剂沸点以下范围内的温度条件下，将混合物浸泡或摇动5分钟至1个月、优选20分钟至1周。此外，特别理想的是在高温下进行水提取(热水提取)。具体地，理想的是在90°C 以上(优选在沸腾状态下)进行约数分钟至数小时(例如，5分钟至5小时)的提取。提取后所得提取液(提取物)可以直接用于后续的曲霉菌发酵，但理想的是对该提取液进行过滤或离心以除去固体物(果皮的残留物等)后再用于发酵。应当指出的是，可以通过将溶剂再次加入所除去的固体物中进行多次提取，来提高提取效率。可对如此获得的提取液(提取物)进行干燥处理(冷冻干燥、使用蒸发器进行干燥等)，以制备干燥物。[曲霉菌发酵]
本发明包括使用以上述方式制备的发酵原材料(果皮、或者果皮的水提取物)作为基质利用曲霉菌进行发酵而获得发酵物的步骤。应当指出的是，优选的是在进行曲霉菌发酵前对上述发酵原材料进行热处理从而对原材料中的无用细菌进行灭菌。作为用于原材料发酵的曲霉菌，可使用白曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、酱油曲霉、斋藤曲霉或宇佐美曲霉。此外，这些曲霉菌也可组合使用。曲霉菌中，白曲霉、泡盛曲霉和米曲霉因为可以高含量地获得4’_去甲基川陈皮素和4’ -去甲基橘皮素，故优选使用。在将上述曲霉菌接种入发酵原材料的方法中，可将曲霉菌孢子直接喷洒在发酵原材料上，使得孢子粘附在原材料上。可选地，可通过散布预先利用液体培养由曲霉菌的预发酵所获得的培养基，而将上述曲霉菌接种入整个发酵原材料中。在将上述曲霉菌接种入发酵原材料中的情况下，优选的是在有氧条件下进行微生物发酵，因此例如优选的是使用具有宽底的圆柱形浅容器进行发酵。
可将发酵原材料均勻地散布于这种容器的底部，以增加与空气的接触面积。同时，在发酵原材料是液体的情况下，优选的是进行如通气或搅拌的处理。发酵是在适于上述曲霉菌生长的条件下，即在优选10至40°C、更优选20至40°C、 更优选25至32°C的温度下进行。此外，发酵优选的是在适于上述曲霉菌生长的条件下，即在暗处进行。而且，在发酵原材料不是液体的情况下，优选的是原材料中含有足够量的水 (例如，水含量为25%以上)。制造大量4’ -去甲基川陈皮素和4’ -去甲基橘皮素的微生物发酵的发酵期优选为 2至21天、更优选为3至14天、进一步优选为4至12天。在发酵期短于2天的情况下，不能充分地获得4’ -去甲基川陈皮素和4’ -去甲基橘皮素，这是因为利用上述曲霉菌的微生物发酵难以进行。相反，在发酵期超过21天的情况下，通过微生物转变所产生的4’ -去甲基川陈皮素和4’ -去甲基橘皮素逐渐地被分解，从而导致来源于柑橘的香气消失。同时，在本发明的曲霉菌发酵中，利用由曲霉菌分泌的酶使多甲氧基黄酮去甲基化而成为去甲基多甲氧基黄酮。因此，代替曲霉菌发酵，还可以对曲霉菌或发酵后所得发酵物进行溶液提取，而制备含有能够使多甲氧基黄酮去甲基化的酶的酶溶液，接着使用所述酶进行与原材料的酶反应而制备反应产物，由此获得去甲基多甲氧基黄酮。具体地，可以通过收集曲霉菌发酵后来自发酵物的水溶液并使用该水溶液作为粗酶溶液来进行酶反应。当进行本发明的曲霉菌发酵时，作为柑橘原材料中的多甲氧基黄酮类的所有川陈皮素和橘皮素均被转化为4’ -去甲基川陈皮素和4’ -去甲基橘皮素。具体地，柑橘原材料的曲霉菌发酵可以产生以高含量含有4’_去甲基川陈皮素和 4’ _去甲基橘皮素的曲霉菌发酵物，即，基于干重含有约0. 5至1. 5质量％(具体地约1质量％)的4’ -去甲基川陈皮素，并且基于干重含有约0. 25至0. 75质量％(具体地约0. 5质量％)的4’-去甲基橘皮素。因此，以上述方式获得的曲霉菌发酵物可以直接或者在对该材料进行加工(例如，破碎、研磨、粉碎、干燥等)后用作药物或功能食品的原材料。[溶液提取]
应当指出的是，从纯度的观点出发，理想的是以溶液提取的方式从霉菌发酵后所得发酵物中获得提取物。可对曲霉菌发酵物直接进行溶液提取步骤，但更理想的是对利用破碎、压碎、研磨、粉碎等中的任一方法处理曲霉菌发酵物所得产物进行溶液提取步骤。溶液提取步骤中使用的溶剂可以是水、缓冲液、有机溶剂或含水溶剂。有机溶剂的实例包括低级脂肪醇(如乙醇、甲醇、异丙醇、或丁醇)、丙酮、乙酸乙酯和氯仿。这些溶剂中，从提取效率、操作性和安全性的观点来看，特别优选的是水、乙醇或含水乙醇。此外，特别优选的是使用最终浓度为55%以上、优选60%以上、更优选80%以上的乙醇进行提取，因为这样能够抑制杂质(即多糖类)的溶出并提高去甲基多甲氧基黄酮的提取效率。
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就提取条件而言，可通过如下方式进行提取以原材料(优选破碎物)的1至50 倍(重量比)、优选2至15倍的量加入溶剂，并且在0°C至溶剂沸点、优选室温至溶剂沸点以下的温度条件下，对混合物进行5分钟至1个月、优选20分钟至1周的浸泡或摇动。可对所得提取液进行冷冻干燥或者用蒸发器等进行干燥，以制备浓缩干燥产物。此外，可使用多种不同溶剂来实施多次溶液提取步骤。特别是，在使用水或低浓度含水醇进行第一次提取时，可以通过随后使用浓度等于或大于上述特定浓度的乙醇进行提取，而提高去甲基多甲氧基黄酮的提取效率。然后，可将以上述方式获得的提取物(上述提取液或者浓缩干燥产物)用作药物及功能食品的原材料。[纯化]
此外，可对提取物或产物实施纯化步骤以提高纯度。纯化步骤可以通过液_液分离提取或者通过使用例如硅胶、化学改性硅胶、活性炭或合成吸附树脂载体的柱纯化来提高纯度。作为实例，本文揭示用以提高去甲基多甲氧基黄酮纯度的纯化条件。首先，将通过从提取液中除去乙醇所获得的液体(具体地，利用乙醇提取所获得的提取液)加入到用水平衡的包含多孔合成吸附树脂(具体地，DIAION HP-20[由三菱化学公司制造])的柱中。然后，除去用水洗脱的成分，再除去用39至41%乙醇(具体地40% 乙醇)洗脱的液体。然后，收集用44至46%乙醇(具体地45%乙醇)洗脱的成分，由此获得纯度提高的含去甲基多甲氧基黄酮的组合物。应当指出的是，如果在前述优选条件下进行提取和纯化，可以获得纯度为80%以上的富含去甲基多甲氧基黄酮的组合物。此外，可进一步对以上述方式获得的含去甲基多甲氧基黄酮的组合物进行ODS柱层析(具体地，用45%甲醇进行洗脱)、薄层层析(TLC)[具体地，使用己烷/乙醇(7:3)]、 或ODS-HPLC(具体地，37%(ν/ν)乙腈溶于水中的混合溶剂)处理，并收集目标峰，由此分离出各个去甲基多甲氧基黄酮的纯产物。具体地，以上述方式获得的去甲基多甲氧基黄酮类是“4’_去甲基川陈皮素”(参见下面的化学式1)和“4’ -去甲基橘皮素”(参见下面的化学式2)。所述化合物是通过在4’位进行去甲基化而获得的川陈皮素和橘皮素的一去甲基化产物。与各自未改变的化合物相比，所述化合物由于去甲基化而显示更高的极性并且在醇类和水中的溶解性更好。[化学式1]
权利要求
1.一种4’-去甲基川陈皮素的制造方法，包括禾Ij用选自白曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、酱油曲霉、斋藤曲霉、和宇佐美曲霉的一种以上曲霉菌对皮或其水提取物进行发酵而获得发酵物，其中所述皮来源于选自属于柑橘属后生柑橘亚属柑组的柑橘类或者属于柑橘属初生柑橘亚属橙组的柑橘类中的至少一种柑橘类。
2.—种4’-去甲基橘皮素的制造方法，包括禾Ij用选自白曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、酱油曲霉、斋藤曲霉、和宇佐美曲霉的一种以上曲霉菌对皮或其水提取物进行发酵而获得发酵物，其中所述皮来源于选自属于柑橘属后生柑橘亚属柑组的柑橘类或者属于柑橘属初生柑橘亚属橙组的柑橘类中的至少一种柑橘类。
3.—种神经突起伸长剂，其含有4’ -去甲基川陈皮素作为活性成分。
4.一种神经突起伸长剂，其含有4’ -去甲基橘皮素作为活性成分。
5.一种神经突起伸长剂，其含有4’ -去甲基川陈皮素和4’ -去甲基橘皮素作为活性成分。
6.一种记忆力改善剂或抗阿尔茨海默氏症剂，其含有4’ _去甲基川陈皮素作为活性成分。
7.—种记忆力改善剂或抗阿尔茨海默氏症剂，其含有4’-去甲基橘皮素作为活性成分。
8.—种记忆力改善剂或抗阿尔茨海默氏症剂，其含有4’ -去甲基川陈皮素和4’ -去甲基橘皮素作为活性成分。
全文摘要
本发明的目的是通过原材料容易获得、步骤简单、口服摄入高度安全的方法来制造含有具有优异生理活性的去甲基多甲氧基黄酮作为活性成分的药物制剂。此外，本发明还提供一种4'-去甲基川陈皮素或4'-去甲基橘皮素的制造方法，该方法包括利用选自白曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、酱油曲霉、斋藤曲霉、和宇佐美曲霉的一种以上曲霉菌对皮或其水提取物进行发酵而获得发酵物，其中所述皮来源于选自属于柑橘属后生柑橘亚属柑组的柑橘类或者属于柑橘属初生柑橘亚属橙组的柑橘类中的至少一种柑橘类。
文档编号C12R1/66GK102458395SQ20108003252
公开日2012年5月16日 申请日期2010年3月10日 优先权日2009年6月3日
发明者田村弘司, 草野崇一 申请人:富士产业株式会社