败血症的质谱诊断的制作方法

专利名称：败血症的质谱诊断的制作方法
技术领域：
本发明涉及对来自血流感染(败血症)的血液培养物中病原体的质谱鉴定。
背景技术：
许多微生物种(以下称为微生物)，特别是细菌和单细胞真菌(如酵母菌或霉菌) 还有藻类和原生动物，都可以通过以下方式进行确定性很高的质谱鉴定，即在营养培养基上以通常方式繁殖菌落，然后将少量微生物从所述菌落转移到质谱样品载板上，并用质谱仪直接测量蛋白质谱。质谱图具体地显示了不同可溶性蛋白质的质量和丰度，这些蛋白质以足够高的浓度存在于所述微生物中。通过与质谱库中参考质谱进行相似性分析，所述微生物的这种蛋白质谱可用于来确定其种类。专门用于此用途的专业质谱仪、相应的评估及相似性分析程序可通过商业渠道获得。现在，该鉴定过程被证明非常成功并迅速被世界各地的微生物实验室所采用。“鉴定”微生物是指将其按分类学等级分类方案加以分类域(真核生物和原核生物)、界、门、纲、目、科、属、种，以及亚种。微生物样品的鉴定包括至少确定属，通常是种，如果可能的话还有亚种甚至株，这一点很重要，例如当不同的亚种或株具有不同的病原性时。 在更为普遍的意义上，鉴定还可以指表征所述微生物的其他更多个体特性，如微生物对抗生素的抵抗性。通常含有用于培养菌落的营养培养基作为皮氏培养皿中的琼脂，根据微生物的繁殖力，所述营养培养基使得可在大约六小时到几天内会长出分离的微生物菌落形式的纯菌株。如果菌落互相重叠或大量混合，可采用以普通方法再次进行的二次培养来获得纯菌落。最简单的方法是，将一些微生物从选定菌落以小涂抹棒(swab)转移到质谱仪样品载板上，然后用常规基质物质(通常为α-氰基-4-羟基肉桂酸[!10^]或2，5-二羟基苯甲酸 [DHB])的强酸溶液喷洒，以便借由基质辅助激光解吸(MALDI)进行电离。酸(通常为甲酸或三氟乙酸)可以攻击细胞壁，并且基质溶液的有机溶剂(通常为乙腈)能够渗入微生物的细胞内并使变弱的细胞壁破裂。接下来通过蒸发溶剂干燥样品，这会引起溶解的基质发生结晶。可溶性蛋白和极少量的其他细胞物质会包埋到所述基质晶体中。然后用质谱仪内紫外线激光的聚焦闪光轰击包埋有分析物分子的所述基质物质晶体，在蒸汽云的高温等离子体内产生分析物分子的离子；然后再根据这些离子的质量将其分离，并在质谱仪内进行测量。为了达到此目的一般会使用专业MALDI飞行时间质谱仪 (MALDI-TOF-MQ。质谱是这些分析物离子的质量值的谱。这些离子绝大部分是蛋白离子， 具有最有用信息的离子的质量大约在3，000道尔顿到15，000道尔顿之间。这种方法中的蛋白离子绝大部分仅是单电荷的(电荷数ζ = 1)，因此允许只提及离子的质量m，而不需总是使用“质荷比”m/z，质荷比在使用其他类型的质谱法时实际是必需的且常规的。蛋白质的谱恰恰是待研究微生物种的特征，因为每种微生物种均生成其自身的遗传上预先确定的蛋白组，每种蛋白具有其自身的特征性分子量。具有可以用质谱仪检测的较高浓度的蛋白质的丰度也可广泛地采用遗传方法控制，并且仅稍微依赖于营养条件或菌落成熟度。蛋白质谱类似地是不同类型的微生物的特征，如同指纹是每个人的特征一样。如今，公立和私立的研究所以及各大学微生物研究所的许多实验室正在充分扩大可靠的且经验证的充分记录的微生物参考质谱库。这些参考库必须满足严苛的要求才能在医学和法律上得到认可。本鉴定法已被证明非常成功。其正确鉴定的确定性远高于目前为止所用的微生物鉴定法。对于数百种不同类型的微生物，已有可能证明所述鉴定的确定性超过95%。对于大部分疑案来说(与到目前为止使用的微生物鉴定法的鉴定结果有些偏差)，基因测序已经确认了质谱鉴定的正确性。如果所述库中没有可用于正在研究的微生物种的参考质谱(这偶尔发生，原因是微生物种达数百万种并且当前谱库的大小有限)，库搜索一般都能够产生有价值的分类将所述微生物分到属或科的较高分类水平，因为相关的微生物经常含有一些相同类型的蛋白质。不过这种情形越来越少见，因为病原微生物现今实际上已全部以参考谱的形式记录在案，因此一般可以精确鉴定到微生物种的水平。以上简要描述的利用小涂抹棒把一些微生物从菌落转移到质谱仪样品载板的样品点，然后喷洒基质溶液的方法，是最简单且迄今为止最快速的样品制备法。如果培养后可以用肉眼看到菌落，那么即使同时需要分析数百个样品，最多也只需要一到两个小时就可以完成鉴定。带有48、96或384个样品点的质谱仪样品载板均可以从商业渠道获得的；获得这些数量的样品的质谱需要花费半小时到两小时。紧急鉴定时可以在几分钟内鉴定出个体微生物样品(虽然是在培养后，培养总是耗时的)。还研究了其他样品制备方法，例如已经以超声波或机械处理破坏所述微生物后提取蛋白质，或者已经用强酸将所述微生物的细胞壁弱化后(细胞壁有时候很坚硬)提取微生物蛋白质。这些分解法可以在因喷洒所述基质溶液未破坏所述微生物的细胞壁而无法采用正常擦拭法时使用。如果擦拭法产生的质谱好到足以进行对比时，所有分解法均提供与擦拭法生成的谱非常相似的谱，它们在质谱中甚至往往显示较低的干扰背景。如今，由于MALDI飞行时间质谱仪(MALDI-T0F)有特别高的检测灵敏度，微生物蛋白质的质谱一般是在其线性模式下获得的，虽然其反射模式下的质谱质量分辨率和质量精确度更好。但是，在反射模式中，只出现大约二十分之一的离子信号，检测灵敏度也差10 到100倍。高灵敏度的基础是，飞行时间质谱仪的线性模式下不但可以检测稳定的离子，而且可以检测更多的碎片离子，甚至是来自离子飞行期间发生的所谓“亚稳的”衰变的中性粒子。二次电子倍增器(SEM)可作为离子检测器使用，测量分子离子、碎片离子和中性粒子， 因为它们都在受到撞击时产生次级电子。加速后从一种母离子的离子源生成的所有碎片离子和中性粒子具有与母离子相同的速度，因此同时抵达离子检测器。抵达时间是原先未分解的离子的质量度量值。增加检测灵敏度对许多应用而言极为重要，因此可以允许以线性模式操作飞行时间质谱仪时存在的许多缺点，如质量分辨率明显降低。解吸和离子化激光仪的能量在这些应用中会增加，这会使离子产量增加，但也会增加其不稳定性，尽管这点在本发明中并不重要。利用飞行时间质谱仪取得质谱通常需要测定大量个体质谱，并快速连续地数字化，所述个体质谱一般都会通过在相同的飞行时间内添加测量点而被叠加在一起，以便形成总谱。每个个体谱的离子均是利用针对每个谱的紫外线脉冲激光仪的一束激光闪光产生的。总谱必须以此方式产生，因为个体谱信号的测量动态范围低，并且噪声大。这里最少需要大约50个个体谱，有些情况下甚至需要1，000个或更多；总谱一般含有数百个个体谱，现代质谱仪能够在几秒钟内获取这些个体质谱，并将其叠加。对于微生物鉴定，通常测定从2，000道尔顿到20，000道尔顿的高质量范围的质谱。但是，最多大约3，000道尔顿的较低质量范围内的质量信号可靠性不高，因为它们大部分来自于附着在微生物外部的包衣肽，或来自于依赖营养物种类和有效性的脂肪酸，以及其他各种偶然存在的物质。如果仅评价质量范围在3，000和15，000道尔顿之间的质量信号，则能得到最佳的鉴定结果。由于上述原因发生的低质量分辨意味着已经不能在该质量范围内分辨质量信号差1个道尔顿的同位素群。因此，质量信号反映了所述同位素群的包络线(envelope)外形。这种鉴定微生物的方法需要相同微生物的纯培养物，即所谓的“分离物”，以便取得没有与其他微生物类型的信号重叠的质谱。不过，已证明也可以用特殊方法评估两种微生物种混合物的质谱，并且能够鉴定这两种微生物种。鉴定确定性仅受到轻微影响。如果生成质谱的微生物种超过两种，鉴定概率和鉴定精确性将明显降低。微生物鉴定在鉴定血流中的感染性微生物(俗称败血症)时尤为重要。通常微生物会从未知的感染点持续地或成批地被释放到血液中。这时，重要的是及早鉴定病原体种类，以便尽早使用正确的抗生素开始靶向治疗。质谱鉴定法与PCR分析互相竞争，在PCR分析中通过聚合酶链式反应(PCR)复制所述微生物DNA的一些基因序列(其特征在于选择性发挥作用的引物对)。这些方法非常快，能够在数小时内产生结果。不过，PCR分析法需要预先知道所述微生物的种、属、科或纲， 以选择正确的引物对。例如，一般而言，根据革兰氏阳性或革兰氏阴性的特征，只能进行“粗略”的分类。微生物的种水平上的确定只在个别案例中有可能实现，并且要根据假设采取非常具有针对性的方法。该方法通常限于鉴定个体的、经常发生的以及特别危险的病原体，如金黄葡萄球菌Staphylococcus aureous)。个体微生物种的阳性鉴定仍然靠有价值的“幸运的误打误撞”。在阴性鉴定的个案中，虽然了解哪些危险的微生物可以被排除在外的信息确实有其价值，但是并不能提供治疗依据。因此，微生物种的准确确定必须要靠传统的微生物学方法，但是这很容易就耗费3到5天的时间。文献DE 10 2007 058 516 Al (WP0 2009/065580 Al)描述了一种方法，可借由离心或过滤直接把病原体从体液中分离出来，这样可将微生物从沉淀物(离心或过滤片状沉淀物)转移到样品载板上。该文献中还描述了一种更好的方法，那就是清除还留在离心管内的上清液后，分解所述沉淀物的微生物，例如通过添加几微升的强酸基质溶液，接着把带有释放出的蛋白质的溶液转移到质谱样品载板上。利用离心法，即使未产生肉眼可见的片状沉淀物也可以进行分解。离心片状沉淀物的能见度极限约为大约IO6个微生物；相比之下，检测极限约为约IO4个微生物，但是未来仍有可能提高。IO4个微生物一般含有100 皮克以上的可溶性蛋白质，但质谱检测的极限远低于此。因为对于澄清体液(clear body fluid)中的感染不需要培养阶段，因此利用这种将体液直接离心的方法可以在几分钟内在质谱实验室中完成鉴定。直接离心或过滤微生物的这种方法之所以成功，原因在于，在绝大多数的案例中
5(远超过70% )，体液中的急性微生物感染仅由单一微生物种引起。约15%的较低百分比的案例中有两个微生物种，这些案例中的两个微生物种一般都可以用质谱识别。急性感染病原体的这种种纯度与其他人体内或人体表面出现的微生物形成鲜明对比——如人体肠道菌丛中的大约IO14个细菌含有至少400个细菌种，这些细菌互相平衡生长。但直接离心的方法只有当微生物以每毫升超过IO4个微生物的极高浓度存在时才有效，而这种浓度在内部体液中非常少见。体液一般为无菌状态，也就是说，体液中通常不含有任何微生物。如同上述引用文献中的描述，在离心器或微滤器中沉淀微生物的方法可以直接且高度成功地应用于所有澄清的体液(如淋巴液、关节液或脑脊髓液(液体))，甚至排泄的体液(如尿液或泪液)。对于含有内源性细胞的体液(如全血)必须引入中间步骤首先通过培养血液来培养微生物，因为微生物浓度通常只有每毫升0. 5到10个；然后完全并彻底破坏血细胞(如红血球或白血球)以便彻底去除全部的人蛋白质。在引用的文献中，这种破坏例如通过添加蒸馏水完成。与细菌的较坚硬细胞壁不同，人类细胞的细胞膜非常脆弱， 可以很轻易地用水的渗透压破坏。反复添加蒸馏水并离心，可以得到足够干净的片状沉淀物，其中不再含有人类细胞的残留物。但是，在申请人的实验室中利用这种添加蒸馏水的方法进行的试验，即使是在多次反复冲洗和离心操作时，也并没有成功地提供足够干净的离心沉淀物。即使沉淀物不再带轻微的红色，与人类蛋白质信号的重叠仍然总是干扰来自这些沉淀物的微生物蛋白质的信号，达到使鉴定变得不可靠的程度。本发明旨在提供一种快速的方法，用于清晰地分离血液中的败血症病原体，而不残留任何微量的人类蛋白质，使得质谱鉴定的精确度达到种或亚种的水平，同时还可以对所述病原体进行其他研究。

发明内容
本发明是基于一种用于通过从体液中沉淀微生物或使微生物成片状沉淀物进行直接沉淀的方法，所述方法借由文献DE 10 2007 058 516 Al (WP0 2009/065580 Al)中获悉的离心或过滤，但使用强表面活性剂溶液(即两亲的表面活性物质)而非纯蒸馏水来破坏细胞。SDS(十二烷基硫酸钠)——一种生物技术中用作蛋白质的变性剂的强阴离子表面活性剂——经证实是理想的，虽然有如下事实(1)已知微量表面活性剂在电离过程(如 MALDI)中是蛋白质和其他分析物物质的电离抑制剂，(2)已知如SDS的强力表面活性剂会杀死微生物，也就是它们通过破坏细菌的复制能力而起到杀细菌剂作用。在一个特别简单的实施方案中，把表面活性剂未经任何预先处理直接添加到约 Iml来自血液培养物的血液中，然后在振荡器(shaker)中充分混合10到30秒。优选地，把表面活性剂以溶液形式添加，例如以10 μ 1到200 μ 1的5%到20% SDS水溶液的形式。混合之后立即将所述混合物以10，OOOg离心2分钟，弃去上清液。在大多数情况下，如果片状沉淀物清晰可见，所述沉淀物会显示非常清晰的白色。为了去除任何微量的表面活性剂，将片状沉淀物用Iml的蒸馏水清洗并再次离心。再度移除上清液。此时，可以用几微升的甲酸及乙腈简单地处理所述沉淀物并将1到2 μ 1的所述溶液转移到质谱样品载板上，此时添加基质溶液并且进行干燥。由于这些准备步骤都可以很快进行，最多只需15分钟就可以在将样品准备在载板上以用于质谱测量。只需要几分钟就可以把样品载板放到质谱仪的排气(evacuated)离子源中并测量，所以半小时内就能够完成质谱鉴定。出乎意料地，可以获得微生物蛋白质谱的清晰质谱，而没有任何人类蛋白质的干扰信号；虽然中间使用了表面活性剂，但是所述测量仍被证明是高度灵敏的。从血液样品中沉淀微生物以进行质谱鉴定的这种方法只有在血液中微生物水平为超过IO4个微生物/毫升的高水平时才能实施，患者的原始血液中通常没有这么多的量。在正常败血症中，以“菌落形成单位”(CFU)测量的存活并活跃的微生物水平在0. 5至 10CFU/ml之间，只有受到感染的儿童才显示最高达100CFU/ml和100CFU/ml以上的水平。 因此，不得不通过在最佳温度下把血液孵育在合适的血液培养瓶中用适当的添加物培养所述血液中的微生物。该培养方式是众所周知的，并显著地比利用皮氏培养皿进行的培养物培养快很多，特别是对严重感染，通常在几小时到最长达几天内就可提供足够的微生物用于鉴定。只有生长非常缓慢的微生物(例如一些分枝杆菌)才需要几天到几星期的培养时间。该方法具有独特的优点，不需要任何事先了解而将所述微生物分类到微生物种甚至亚种的水平。不需要形态(或显微镜)检查、生物化学基本反应或其他类型的预先测试。 知道了微生物类，治疗所述患者的医师就可以马上开始对患者进行靶向治疗，因为对于大部分的微生物而言，已知对它们有效的抗生素信息。该微生物种对抗生素的抗药性(根据地区或医院不同而有所变化)通常也是已知晓的。对在加护病房中的败血症患者尽早开始靶向治疗不但对患者很有益(甚至挽救生命)，而且也非常节省花费。虽然在微生物学中已知可以用强表面活性剂(特别是SDQ溶解血细胞，但一般不使用这种方法。像SDS这样的强表面活性剂被认为是杀菌剂，而微生物的复制能力在微生物鉴定法中很重要。不过这并不适用于质谱鉴定法，因为在质谱鉴定法中，必须保留的仅仅是细胞壁的结构完整件和内部蛋白质的化学完整件，而不是复制能力。伯.是,根据上文描述的本发明的非常快速方法，其中微生物最多只暴露于SDS几分钟，令人惊讶的是，虽然表面活性剂有杀菌作用，但是很多微生物依然存活并保持它们的复制能力；因此，所述从血液中隔离和分离微生物的方法还可以用于提供更多分离形式的微生物用于其他研究，如抗性测试ο本发明特别基于快速及完全的溶解不同类型的血细胞，而不破坏微生物。血细胞脆弱的细胞膜主要由磷脂构成，磷脂以非共价键的方式形成膜。强表面活性剂(尤其是 SDS)可溶解蛋白质和脂质的全部非共价键，并摧毁所述分子的四级和三级结构。因此，细胞膜会完全溶解。血细胞的内部结构也被SDS破坏和溶解，包括细胞核的膜以及白血球的染色体。离心或过滤后，这些溶解的成分全都与上清液一起被移除。因白血球DNA引起的一些新问题将在稍后讨论。另一方面，细菌的细胞壁非常稳定；它们主要是由交联的聚合胞壁质组成。该共价键结合的网面能够经受表面活性剂的溶解作用。对于接下来的质谱鉴定而言，只要微生物的内部蛋白质不丧失或改变其一级结构，使用本方法过程中微生物是否死亡(例如借由展开内部蛋白质的三级或四级结构)或者是否仍然能够复制并不重要。但是对于许多微生物来说，根据本发明的短暂隔离和分离方法仍然能够留下足够的微生物，这些微生物在后续培养中作为分离物进行复制。


图1显示了简单的基本程序，已知该程序对于所有白血球水平正常的患者的血液都是成功的。图2显示了高白血球水平时克服DNA凝集问题的方法，不过是以灵敏度降低为代价。图3显示了具有一般灵敏度的程序，该程序可以应用到所有高白血球水平的血液样本。
具体实施例方式以下叙述的优选实施方案是基于具有超过IO4个微生物/毫升的足够高浓度微生物的血液样品。仅在极少数的情况下，如果医师处理特别急性的感染，这可以是原始状态的释放血液；通常，该方法涉及在可从商业渠道获得的适当血液培养瓶中培养了数小时到数天的血液。专家应了解，所述培养通常是将几对血液样品放在几对培养瓶中进行，一组用于培养好氧性微生物，另一组则用于培养厌氧性微生物。所述培养瓶中已经放了抗凝血剂和营养物；添加血液后，将所述培养瓶放在37°C的培养箱中孵育。此外，血液培养瓶中也已经含有大多数抗生素的抑制剂或吸附材料。即使试图用原始血液进行立即鉴定(在未来质谱检测灵敏性得到充分发展后将更有可能实现)，未使用的血液部分仍然方便进行培养。这些血液可以作为储备，以防利用原始血液的直接鉴定法没有获得足够可靠的鉴定结果。目前有几种可从商业渠道获得的具体血液培养瓶，具有嵌入式指示器用于指示微生物生长状态是否足够。大多数情况下，这些指示器是根据对所述微生物产生的不断增加的二氧化碳浓度的测量。这些血液培养瓶易于处理，并通过信号自动指示微生物的充分繁殖。但是，本申请人实验室中的研究已表明，该信号在质谱鉴定时很晚才会出现。在信号显示微生物充分繁殖之前二到四小时，已经可以利用培养的血液成功地获得鉴定结果。因此， 对于危险且严重的败血症的情况，应每小时或每两小时或者其他适当的时间间隔尝试所培养的血液中的微生物进行质谱鉴定，而不是等待信号出现。从血液直接取得微生物(未经血液培养)并在皮氏培养皿中进一步培养的早期方法是在1976年前后由G. L Dorn开发的，利用了血细胞溶解和软离心。溶解-离心法的开发导致了知名的“Isolator ”试管诞生，首先由杜邦公司(美国威明顿)进行商业制造，接着由美国新泽西州Cranbury Wampole Laboratories生产，现在英国Basingstoke Hunt的 Oxoid Limited也生产这种产品。Isolator 是Carter-Wallace，Inc.的商标(公司位于美国纽约州的纽约市，邮编10105)。过去三十年来，在全球各地用于分离微生物，特别是从人类巨噬细胞(一种白血球)分离分枝细菌，使用的Isolator 试管数量达几百万支。根据“Wampole Isolator 手册”，Isolator 试管含有(a)皂角苷，用于宿主细胞溶解，(b)聚丙二醇，作为泡沫缓速剂(f0am retardant), (c)聚茴香硫酸钠(SPS)，作为抗凝血剂，(d) EDTA，作为抗凝血剂，(e)全氟烷(Fluorinert)，一种用于浓缩细菌的且不与水混溶的液体塑料(作为离心垫)。有不同类型的皂角苷，它们都是由不同植物产生的天然去污剂(表面活性剂)。Isolator 试管内的皂角苷是经过脱毒的皂角苷，能够溶解人类细胞的细胞壁而不杀死微生物。Isolator 试管用于软离心，仅可以3，OOOg离心30分钟的较长时间，目的也在于不破坏微生物。该方法的目的是从血液中提取活性微生物，用于在具有适当养分的皮氏培养皿中重新培养所述微生物。与此方法相反，本发明以从培养的血液中快速回收纯Μ微生物以用于质谱鉴定为目标，必须去除所有微量的人类蛋白质，否则会干扰鉴定。在所述质谱鉴定法中，不要求对于微生物鉴定方法来说很重要的微生物复制能力，因为在质谱鉴定法中需要保持的仅是细胞壁的结构完整性和内部蛋白质分子的化学完整性，而不是复制能力。对于质谱鉴定，如果通过展开内部蛋白质的三级和四级结构使其变性，则复制能力不起任何作用。但是，在根据上述本发明的非常快速方法(其中微生物最多只暴露于SDS几分钟)中，已证明虽然SDS 有抗生作用，但是很多微生物仍然保持其复制能力；因此，从血液中隔离和分离微生物的方法也可以提供更多分离微生物用于其他研究，如抗性测试。图1中显示了一个从培养的血液中分离和隔离微生物的方法的非常简单但很成功的实施方案。该方法首先将近Iml的血液添加到几支专用离心管的每一支内，加入表面活性剂溶液，然后混合均勻。优选地，把表面活性剂以溶液形式添加，例如20到200μ 1(优选100 μ 1)的5%到20% (优选10% )的SDS溶液。将血液放到几支离心管内不但可以使离心平衡，还可以立即取得确认样品以用于可靠的鉴定。在振荡器中混合10到30秒后，将离心管内的血液样品以10，OOOg离心两分钟。利用例如带有可移除吸头的常规移液管将深红色上清液移除。这时取出微生物沉淀物并用蒸馏水清洗；在再次离心后，剩下分离的微生物的沉淀物，如果可见则为纯白色。只有严重的病例才需要重复清洗步骤以便排除所有的微量人类蛋白质；每次清洗处理仅延长整个过程约2到3分钟。操作SDS溶液需要小心，因为该溶液很容易产生泡沫，而顽固的泡沫会维持数小时或者甚至数天，使得难以使用所述液体。在优选的模式中，可以在SDS溶液中添加泡沫抑制剂(消泡剂)。目前市场中有几种类型的消泡剂。使用消泡剂的原则已经从Isolator试管已知。在最后一次清除上清液后，必须提取微生物的可溶性蛋白质。这可以通过利用生理-化学方法破坏细胞壁并溶解蛋白质来进行。通常所述提取可简单地通过加入大约几微升的70%甲酸来进行，甲酸会猛烈攻击所述微生物细胞壁的肽聚糖(胞壁质)并破坏细胞结构。为了尽量溶解更多蛋白质添加了等量的乙腈。仅在少见的案例中，需要使用声波或机械性破坏等其它方法。为了使固体组成(如细胞壁碎片)沉淀，将可溶性蛋白质溶液离心，然后把约1 μ 1的各上清液利用移液管移到MALDI样品载板的样品点上。在干燥以后， 把约1 μ 1的基质物质溶液(优选溶解在水中的HCCA或DHB和带有少量三氟乙酸的乙腈) 添加到每个样品制剂中。可以对几支已装有血液样品的离心管同时进行这些步骤。在干燥后，样品载板上的样品制剂可以开始用于获取质谱。如果需要分析的血液样品很多，可以同时处理这些样品，把样品制剂放到同一个MALDI样品载板的其它样品点上。目前可从商业渠道获得不同类型的MALDI样品载板，带有48、96、384个样品点。例如，有些样品载板含有在疏水性环境中的直径为约2毫米的亲水性固定位置。然后，转移的溶液会在所述固定位置形成直径为2毫米的半球形小滴。其它市面上出售的样品载板的样品点含有预先装好的基质物质层(HCCA)。一次性样品载板上有直径为2毫米的肉眼可见的激光蚀刻环，用来阻止所述小滴扩散。这些样品载板都适用于于根据本发明方法的质谱测量部分。
可以用很多种方式修改用于测量样品的简单制备方法。其中一个选项是利用已经带有一薄层基质物质(例如HCCA)的样品载板。然后，可以把含有甲酸和乙腈的上清液用移液管直接移到该薄层上。该薄膜具有立即吸附基质晶体表面上所有蛋白质的特性，使得在大约1分钟后，可以利用例如移液管或简单使用吸液纸去除剩余的液体。这种做法还可以去除诸如盐类或残留的表面活性剂等的杂质。接下来可选的添加的一滴乙腈可以把蛋白质牢牢地包埋入所述薄层的小晶体内，从而增加灵敏度。也可以用微滤沉淀和清洗微生物，而不是用离心来沉淀微生物。因为添加表面活性剂会使血细胞的细胞膜和它们的内部结构基本上完全溶解，利用微滤也可以获得所述微生物的纯分离物。从血液中分离微生物及制备测量样品的这些过程总共只需约10到15分钟。接着，把装有所述样品制剂的样品载板通过真空锁定以常规方式放到从商业渠道获得的质谱仪的离子源中。质谱仪运转约5分钟。在其中紫外线脉冲激光以200赫兹运转的质谱仪中，只需要几秒即可从测量的样品获得足够数量的个体谱，从而得到非常有用的总质谱。因此，一分钟后就可以获得质谱(现在有2kHZ激光器的MALDI-T0F质谱仪可以从商业渠道获得)。还有一些从商业渠道获得的计算机程序可以利用微生物的质谱进行随后的微生物鉴定，例如“Biotyper”(德国Bruker Daltonik, Bremen)。从良好的质谱鉴定微生物所需要的时间视计算机的性能、参考质库的大小、相似性分析的算法而定。在质谱仪中使用从商业渠道获得的计算机，只需要几秒钟到最多几分钟就可以鉴定样品(包括确认样品)质谱；因此，在对血液中的微生物进行成功培养后，半小时内就能以数字或打印方式取得微生物鉴定结果。所有这些取得纯微生物沉淀物并接着用质谱仪鉴定的简单方法用于第一次送到医院的正常患者血液时都很成功。本发明的该最简单实施方案的鉴定成功率超过95%。然而，有许多具有最新手段的专科医院，这些医院中患有慢性病和许多未知疾病的患者最终经历了彻底检测和特殊治疗。在这些具有患罕见和难解疾病的患者的医院中， 在用SDS溶液处理血液样品后，高达40%的血液样品形成大的粘性块并可视地充溢在深红色液体中。这些粘性物带有未知百分比的微生物。本领域技术人员可以用移液管吸取粘性物周围的一些液体用于进一步处理，但是该方法非常困难，并且会因未知因素降低检测极限。研究表明，这些粘性块主要由大量增加的白血球的DNA组成，可能混杂了血液中凝结的蛋白质。患者的血液中通常显示白血球的数量激增。对于这个问题，有几种解决方案。首先又很简单的解决方案是，添加SDS溶液前可以用蒸馏水把血液稀释至2到10倍，优选约5倍。稀释至5倍会将成功率增加到90%以上，但是如果使用相同的Iml离心管，也会将该方法的灵敏性降低5倍。对于严重病例，可能无法等待为了产生更多微生物所需的更长培养时间。作为针对凝结问题的第二个解决方案，可以使用一种在添加SDS溶液前先离心血液样品的方法。该方法的成功率得到了提高，可能是因为在添加SDS溶液前先去除了血液中全部凝结蛋白质。在本发明的该更优选的实施方案中(该实施方案可以作为标准程序引进到专科医院)，先离心初始放到离心管内的血液而不添加表面活性剂溶液。接着去除含有上百种蛋白质、添加的营养物和抗凝剂的上清血浆，然后用表面活性剂溶液(如SDS溶
10液)仅处理深红色的沉淀物，添加到试管的总量最高为1ml。Iml血液中的深红色沉淀物不但含有微生物，通常还含有5百万个红血球、7千个白血球，还有20万个血小板，将其在振荡器中与添加的表面活性剂溶液一起混合，从而破坏血细胞的细胞膜并释放出可溶性蛋白质。再度离心该深红色溶液，这时上清液依然为深红色，而沉淀物若肉眼可见则是纯白色。 这时可以重复除去上清液、添加表面活性剂溶液和离心的过程，以便去除最后的血细胞残留物。然后可以反复用纯蒸馏水重复该过程，以去除表面活性剂，因为表面活性剂会干扰基质辅助激光解吸(MALDI)的电离。在最后一次去除上清液后，不论是否可见都以上述方法分解沉淀物，然后把可溶性蛋白质转移到样品载板上。作为针对血液凝结问题的第三个解决方案，可以与特殊抗凝剂一起配制SDS溶液，以便抑制所述粘性物的形成。该方案可以与第二种方案结合。作为第四个解决方案，可以添加一种或多种核酸酶溶解所述粘性物。如果在最后的清洗步骤后看到沉淀物，则可以实施本发明的另一个实施方案，包括用涂抹棒将少量如此分离的微生物移到样品载板上，在样品载板上可以用普通的方法处理所述微生物。传统擦拭技术的质谱在很大程度上与离心管内使用酸的分解技术的质谱类似。如果有明显差异，该两种样品制备方式的质谱可以进入质谱库作为参考质谱使用。本发明提供了一种可靠鉴定血液中微生物病原体的方法，该方法比以往的微生物学方法(在实践中一般通过在皮氏培养皿的凝胶上培养微生物进行)显著更简单、更快速。 本发明在培养过程后直接从血液获得纯化的微生物，它们在血液中以充足的种纯度存在， 而对于出现在人体其它部位中或上的微生物却不是如此。与PCR分析法不同，本发明的鉴定法可以在事先无任何了解的情况下实施，却可以直接达到鉴定微生物的种或亚种水平。 目前没有其它鉴定方法如此快速可靠。本发明特别基于以如下方式快速及完全破坏不同类型的血细胞即获得非常纯的微生物，而来自血细胞的内源性血液蛋白质不会干扰该鉴定。与血细胞不同，微生物细胞的结构在该鉴定过程中不会遭到破坏。血细胞脆弱的细胞膜主要由磷脂构成，磷脂以非共价键的方式形成膜。表面活性剂(特别是SDQ对蛋白质和脂质的作用特别是基于破坏所有非共价键，从而破坏细胞膜和细胞结构分子的四级和三级结构。因此，细胞膜和所有内部细胞结构会完全溶解，所述表面活性剂发挥溶解剂的作用。细胞膜的磷脂自身是两亲性的， 也就是具有表面活性剂的特性，能够通过形成胶束被其它表面活性剂以纳米胶体的形式溶解。血细胞的内部结构(包括白血球细胞核的膜及染色体)也会被SDS破坏并彻底溶解。 所有这些溶解成分在离心后会随上清液一起被去除，或者通过微滤被去除。另一方面，细菌的细胞壁非常稳定；它们主要是以共价键交交联并因此聚合的胞壁质(肽聚糖)组成。对于革兰氏阳性菌，还有与磷壁酸(也是聚合的)的交联。这些共价键结合的网能够承受至少数分钟的表面活性剂的短时间溶解作用。只要不释放内部蛋白质或改变其一级结构，在本方法中微生物是否死亡对于后续的质谱鉴定是无关的。但是对于许多微生物来说，根据本发明的短暂方法仍然能够使足够多的微生物存活下来并复制， 用于进一步培养。这种方法非常简单。因此对分离的微生物进行的鉴定在传统方法后进行，但传统方法通常是基于通过在培养基培养单独的菌落来分离一种类型的微生物。这种分离自动存在，因为对于急性感染来说只有一种或最多只有两种微生物被发现是病原体。这表示从被感染的血液中分离这些微生物能够提供足够量的微生物，所述微生物代表足够纯的微生物培养物(分离物)。即使存在两种微生物，这方法也仍然非常有效。为了简化鉴定血液中微生物的方法，可以制备含表面活性剂及消泡剂的即用混合物的分析试剂盒并将其进入商业渠道销售。所述混合物中可能含有额外的抗凝血剂和核酸酶；这些混合物的灭菌部分可以装入即用的排气离心杯中，易于装填血液样品。该分析试剂盒中还可包括纯化的溶液，用于从沉淀的微生物中提取蛋白质；以及基质溶液，用于在质谱样品载板上的样品制备。该分析试剂盒中甚至还可以包括单向质谱样品载板。如果隔离和分离微生物的方法中使用的离心管比鉴定需要的多(如十二支离心管)，那么一些分离的微生物沉淀物也可以用于进一步的诊断目的一例如在有抗生素的情况下使用传统的功能性培养试验法确定微生物的抗药性。从内源细胞分离微生物积聚物的方法不但可以应用于血液，也可以应用于脓肿或其它炎症病灶，因为其中也含有内源性细胞。该方法的一个例子是化脓性病灶，即一些生物的积聚物，一些被部分消化的微生物混合有攻击所述微生物的某些类型的白血球。在这种情况下，内源性细胞也可以被表面活性剂溶液溶解。另一个例子是有炎症的鼻粘膜，其以鼻粘膜擦拭物形式获得并且其中主要目的是鉴定微生物。也可以从其它粘膜获得这些类型的样品。在上述方法中，利用基质辅助激光解吸(MALDI)电离质谱仪获得微生物的质谱。 这是常用的方式，但不必唯一的方式。例如，也可以用电喷射来离子化微生物的可溶性蛋白质的溶液。这种类型的电离可产生质量范围大约为600到1，600道尔顿的重叠程度很高的多电荷离子，需要高分辨率的质谱仪。正交发射离子的飞行时间质谱仪(OTOF-MS)可以作质谱仪使用，也可以使用离子回旋共振质谱仪(ICR-MQ或其他高分辨率的质谱仪。为了取得微生物的质谱，可将电喷雾离子化形成的电子的不同电荷水平以数学方式结合。不过，也可以进行物理电荷还原。这涉及了把荷正电的蛋白质离子和合适的荷负电离子一块引入位于电喷射离子源和分析器之间的离子反应器，造成蛋白质离子的去质子化。然后，把这些蛋白质离子引入质谱仪中，不过质谱仪必须能够处理大范围的质量。其他已知的电离法也可以在这里使用。例如，一个有利的方法是大气压化学电离 (APCI)。通过将液体雾化和蒸发液滴，或者通过非电离的弱激光解吸(“激光消融”)把分子化学电离。化学电离几乎只提供单电荷的离子，因此用起来很理想，但是同样需要能够处理大范围质量的质谱仪。了解本发明之后，本领域技术人员可以用许多种的方式修改以上所述的方法。这些修改中有一些已经在上文进行了描述；还有一些方法基于直接分离来自血液、脓肿或其他炎症组织的微生物，可以产生对其鉴定所需要的微生物质谱信息。
权利要求
1.用于对血液中微生物进行质谱鉴定的方法，包括以下步骤-通过添加表面活性剂溶解来自所述血液培养物的血液样品中的血细胞，-通过离心或过滤沉淀所述微生物，-获取所述微生物的质谱，-通过所述质谱鉴定所述微生物。
2.根据权利要求1的方法，其中通过培养产生足够数量的血液中的微生物。
3.根据权利要求1或2的方法，其中清洗通过离心沉淀的所述微生物并再次进行离心。
4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中将十二烷基硫酸钠(SDQ用作所述表面活性剂。
5.根据权利要求1至4中任一项的方法，其中所添加的表面活性剂为溶液形式。
6.根据权利要求5的方法，其中所述表面活性剂溶液中含有消泡剂。
7.根据权利要求1至6中任一项的方法，其中将抗凝血剂添加到所述血液样品中。
8.根据权利要求1至7中任一项的方法，其中将一种或多种核酸酶添加到所述血液样品中。
9.根据权利要求1至8中任一项的方法，其中用蒸馏水稀释用于所述血液样品的所述血液，稀释比例在12和110之间。
10.根据权利9的方法，其中用蒸馏水稀释用于所述血液样品的所述血液，稀释比例为约 15。
11.根据权利要求1至10中任一项的方法，其中将所述血液样品离心，去除上清液，然后添加所述表面活性剂溶液。
12.根据权利要求1至11中任一项的方法，其中利用生理-化学方法将所述沉淀的微生物分解。
13.根据权利要求12的方法，其中用含有酸如甲酸或三氟乙酸和有机溶剂如乙腈的溶液分解所述沉淀的微生物。
14.根据权利要求1至13中任一项的方法，其中使用基质物质在质谱样品载板上进行测量样品的制备，其中所述沉淀微生物的可溶性蛋白质包埋在所述基质物质的晶体中。
15.根据权利要求1至13中任一项的方法，其中所述测量样品的制备包括把一些所述沉淀的微生物转移到质谱样品载板上，向所述质谱样品载板上添加基质溶液。
16.根据权利要求14或15的方法，其中用基质辅助激光解吸电离(MALDI)飞行时间质谱仪来进行所述质谱测量。
17.根据权利要求1至16中任一项的方法，其中使用沉淀的微生物来确定它们对抗生素的抗性。
18.用于从血液、脓肿、炎症组织样品或粘膜擦拭样品获得未经人蛋白质污染的纯形式的微生物的方法，所述微生物用于进行质谱鉴定，其中用表面活性剂破坏所述血液、脓肿、 炎症组织样品或粘膜擦拭样品的内源性人细胞，并且通过离心或过滤将所述微生物以沉淀形式从所述液体中分离。
19.用于根据权利要求1至18中任一项的对血液中微生物的质谱鉴定的分析试剂盒， 包含含消泡剂的即用表面活性剂溶液。
全文摘要
本发明主要涉及利用对来自血流感染(败血症)的血培养物中病原体的质谱鉴定。本发明提供了一种方法，用所述方法可以在血液培养瓶中经过相对短暂培养后从血液中分离纯形式的微生物病原体，而无任何血细胞(如红血球和白血球)的人类干扰蛋白质或任何残留级分，并能够通过对它们的蛋白质谱的质谱测量直接进行鉴定。该方法基于使用相对较强的表面活性剂来通过溶解所述血细胞的脆弱细胞膜和大部分内部结构而破坏所述血细胞；尽管表面活性剂在MALDI和其他进行质谱测量所需要的电离过程中被视为强的电离抑制剂。该方法允许借助离心或过滤获得纯化形式的未知病原体，并允许在种或亚种分类水平上鉴定未知病原体。获自高水平白血球的DNA的问题可以借由具体措施解决。充分培养之后，在质谱实验室中进行所述鉴定只需要半小时。
文档编号C12Q1/04GK102471798SQ201080032009
公开日2012年5月23日 申请日期2010年7月14日 优先权日2009年7月16日
发明者T·梅尔 申请人:布鲁克·道尔顿公司