专利名称：正痘病毒产生和纯化方法
技术领域：
本发明涉及病毒产生和纯化领域。特别地，本发明涉及一种产生和纯化野生型、减毒和/或重组正痘病毒的方法。
背景技术：
正痘病毒是复杂的包膜病毒，具有200nm到300nm的直径，主要通过它们不寻常的形态学、它们的大DNA基因组和它们复制的细胞质部位进行区分。正痘病毒数个成员(包括哥本哈根痘苗病毒(VV)菌株(GOEBEL 等，1990，Virol. 179，247-266 和 517-563 ;JOHNSON等，1993，Virol. 196,381-401)和修饰的安卡拉痘苗病毒(MVA)菌株(ANTOINE等，1998，Virol. 244,365-396))的基因组已被作图和测序。VV具有约192kb的双链DNA基因组，编码约200种蛋白，其中大约100种涉及病毒组装。MVA是高度减毒的痘苗病毒菌株，通过痘苗病毒的安卡拉株在鸡胚胎成纤维细胞中超过500次连续传代而产生(MAYR等， 1975, Infection 3,6-16)。MVA 病毒以保藏号 N6CI2I_721 保藏于 Collection Nationale deCultures de Microorganismes (CNCM)。MVA基因组完整序列的确定以及与哥本哈根VV基因组的比较允许准确鉴别存在于病毒基因组中的变化和确定导致片段化ORF (开放读框)的 7 种缺失(I 到 VII)和众多突变(ANTOINE 等，1998，Virology 244，365-396)。正痘病毒作为载体用于开发重组活疫苗的用途受到安全考虑和规定的影响。在使用正痘病毒接种前必须纯化病毒。现有的正痘病毒产生方法包括在细胞系(例如HelaS3)、在含胚卵或在鸡胚成纤维细胞(CEF)中复制病毒。在病毒复制后，丢弃培养基，裂解细胞，通过鹿糖垫离心(sucrose cushion centrifugation)来纯化从细胞释放的正痘病毒(K0TWAL and ABRAHAM ；poxvirus growth, Purification and tittering in VacciniaVirus and Poxvirology, 2004,101-108, Humana Press Inc. , Totowa ;NJ ;USA)。国际专利申请W007/147528描述了一种产生没有靶向感染特异性的野生型MVA、减毒和/或重组MVA的方法，包括制备包装细胞(例如CEF ;细胞系)的培养物，感染所述细胞培养物，培养所述感染的细胞，从培养上清液和/或包装细胞回收产生的MVA，以及通过深度过滤(depthfiltration)、微量过滤和渗滤进一步纯化病毒。WO 07/147528指出当进行深度过滤、微量过滤和渗滤时，使用核酸酶(更具体地，Benzonase 作为核酸酶的使用)不是必需的。国际专利申请WO 08/138533描述了一种纯化生物学活性痘苗病毒的方法，包括将包含在液相培养物中的痘苗病毒加载到附着了配体的固相基质，清洗基质，和洗脱病毒。尽管描述了用于正痘病毒产生和纯化的数种方法，仍然需求其它方法。本发明提供这类方法。
发明内容
如整个申请所用，“正痘病毒”是指天花病毒；痘苗病毒(VV)如例如痘苗病毒株Elstree, Western Reserve, Wyeth, NYVAC, NYCBOH,巴黎，哥本哈根；和它们的衍生物如例如修饰的安卡拉痘苗病毒(MVA)，特别是MVA575 (ECACC V00120707)和MVA-BN (ECACCV00083008) ο根据本发明，正痘病毒可以无区别地是未成熟病毒(IV)，胞内成熟病毒(MV)，胞内包膜病毒(IEV)，细胞结合包膜病毒(CEV)或胞外包膜病毒(EEV) (SMITH等(2002)，J. Gen. Virol.，83，2915-2931)。如整个申请所用，“一种”用于以下含义它们表示“至少一种”，“至少第一种”，“一或多种”或“多种”引用的组分或步骤，除非上下文明确另外指出。如整个申请所用，本文任何地方使用的“和/或”包括以下含义“和”，“或”以及“由所述术语连接的成分的所有或任意其它组合”。如整个申请所用，“包括”旨在表示产品，组合物和方法包括所述的组分或步骤，但不排除其它的。当用于限定产物、组合物和方法时，“基本上由...组成”应当表示排除任何实质重要的其它组分或步骤。因此，基本上由所述组分组成的组合物不排除痕量染污物和药学上可接受的载体。“由...组成”应当表示排除超过痕量的其它组分或步骤。 如整个申请所用，本文使用的“约”或“大约”表示在给定值或范围的20%以内，优选10%以内，和更优选5%以内。本发明涉及一种产生和纯化野生型、减毒和/或重组正痘病毒的方法(即方法A)，包括以下步骤a)制备包装细胞培养物；b)用正痘病毒感染包装细胞培养物；c)培养感染的包装细胞直至产生子代正痘病毒；d)在一或多种核酸酶存在下温育；e)从培养上清液和/或包装细胞回收正痘病毒；f)在合适条件下将一价盐添加到步骤e)回收的正痘病毒中以抑制核酸酶活性并避免所述正痘病毒吸附到步骤g)的阴离子交换吸附剂上；g)在合适条件下将步骤f)获得的混合物与阴离子交换吸附剂接触以捕获核酸；h)在合适条件下将步骤g)获得的混合物净化以去除细胞碎片；i)在合适条件下用包括一价盐的溶液清洗阴离子交换吸附剂以回收流过物(flowthrough)中剩余的正痘病毒；j)浓缩步骤h)获得的流过物和步骤i)获得的流过物；k)将步骤j)获得的包括正痘病毒的级分进行渗滤。根据优选的实施方案，本发明的方法不含动物产物(除了包装细胞)。如整个申请所用，“动物产物”是指在活生物体的动物细胞中产生的或由活生物体的动物细胞产生的任意化合物或化合物集合。根据优选的实施方案，本发明的方法适合于无菌工业化规模制备过程以确保完全符合涉及疫苗无菌性的管理要求。如整个申请所用，“减毒正痘病毒”是指已经被修饰使其在预期对象中的致病性实质降低的任意正痘病毒。优选正痘病毒被减毒使其从临床观点来看是不致病的，即暴露于所述正痘病毒的对象相对于对照对象不显示统计上显着的病理学水平增加。根据本发明优选的实施方案，减毒正痘病毒是减毒的VV或减毒的MVA。如整个申请所用，“重组正痘病毒”是指包括插入其基因组的外源序列的正痘病毒。如本文所用，外源序列是指不是天然存在于亲代病毒中的核酸。如整个申请所用，“包装细胞”是指可以被待产生的正痘病毒感染的细胞。包装细胞可以是原代细胞，重组细胞和/或细胞系。例如，可以使用包含重组病毒载体缺少的、产生重组病毒所需的元件的重组细胞。根据本发明优选的实施方案，包装细胞是永生化细胞系。如整个申请所用，“永生化细胞系”是指培养时增殖不受Hayflick限制的细胞系。根据本发明，永生化细胞系优选获自属于鸭科或雉科的禽类细胞。在鸭科中，尤其优选属于栖鸭属(Cai rina)或鸭属(Anas)的细胞。甚至更优选永生化禽类细胞系属于番鸭(Cairina moschata)或绿头鸭(Anas platyrhynchos)种。根据本发明更优选的实施方案，包装细胞是获自属于鸭科的禽类细胞、优选获自番鸭种的永生化禽类细胞系。根据本发明优选的番鸭永生化禽类细胞系是包括被专利申请W02007/077256涵盖的编码端粒酶逆转录酶(TERT)的核酸序列的番鸭永生化禽类细胞系。尤其优选的是下列永生化禽类细胞系-以登录号08060502保藏于欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)(见图2、3和4)的T3-17490或其衍生物；-以登录号08060501保藏于欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)(参见图5、6和7)的T6-17490或其衍生物。根据本发明其它优选的番鸭永生化禽类细胞系是包括ElA核酸序列和被专利申请WO 2009/004016涵盖的编码端粒酶逆转录酶(TERT)的核酸序列的番鸭永生化禽类细胞
系O如整个申请所用，保藏的永生化禽类细胞系的“衍生物”是指包括编码“感兴趣物质”的核酸序列的永生化禽类细胞系。如本文所用，“感兴趣物质”可以包括但不限于药学上有活性的蛋白例如生长因子，生长调节物，抗体，抗原，它们可用于免疫或接种等的衍生物，白介素，胰岛素，红细胞生成素，G-CSF，GM-CSF，hPG-CSF，M-CSF，干扰素(干扰素-alpha，干扰素-beta,干扰素-gamma),凝血因子(例如因子VIII,因子IX ；tPA)或其组合。可用于本发明方法的其它永生化细胞系是-专利US5，879，924涵盖的DFl细胞系，其是得自10天龄East LansingLine (ELL-O)卵的自发永生化鸡细胞系；-专利申请WO2005/007840涵盖的Ebx鸡细胞系，其通过从生长因子和饲养层的渐进分离而衍生自胚胎干细胞；-DEC 99 细胞系(Ivanov 等，Experimental Pathology and Parasitology,4/2000Bulgarian Academy of Sciences),其是鸭胚胎永久细胞系。根据本发明另一个优选的实施方案，包装细胞是原代细胞。如整个申请所用，“原代细胞”是指从动物或人组织，器官或生物体新鲜分离的细胞，其中所述细胞不能连续和无限复制和分裂。通常，原代细胞在细胞培养时分裂少于100次，经常少于50次，经常少于25次。因此原代细胞不经历永生化事件。原代细胞包括但不限于动物成纤维细胞或脐带血淋巴细胞。根据本发明更优选的实施方案，包装细胞是原代或继代(secondary)禽类细胞，优选鸡胚胎成纤维细胞(CEF)。根据本发明，用于制备包装细胞培养物的培养基(即步骤a)期间)，用于正痘病毒感染所述细胞培养物的培养基(即步骤b)期间)和用于培养所述感染的包装细胞的培养基(即步骤C)期间)可以是相同或不同的。根据优选的实施方案，根据本发明使用的细胞培养基不含动物产物。已经描述了许多不含动物产物的培养基，其中一些是可商购获得的。在本发明的方法中可以例如使用以下作为细胞培养基293SFM II ；293-F Cells, SFM Adapted ;293_H Cells, SFMAdapted ;293fectin 转染试剂；CD 293AGT ；CD 293 培养基；FreeStyle 293 表达系统；FreeStyle 293 培养基；FreeStyle 293-F Cells, SFM Adapted ;用于 PER. C6 细胞的腺病毒表达培养基(AEM)生长培养基；⑶293AGT ;⑶293培养基；C0S-7L Cells,SFM Adapted ;EPISERF 培养基；OptiPro SFM ;VP_SFM ;VP_SFM AGT 。(均可得自Invitrogen)。根据本发明使用的不含动物产物的细胞培养基也可以是自制培养基。制备包装细胞培养物的步骤a)是本领域技术人员熟知的。 当包装细胞是永生化细胞系时，所述永生化细胞系在合适的培养基中培养。所述方法可包括粘附到表面生长，在存在或不存在(微)载体下悬浮生长，或其组合。可以例如在平皿，滚瓶或生物反应器中进行培养，使用分批、补料分批、连续系统、空心纤维等等进行。为了实现通过细胞培养大规模产生病毒，在本领域优选使细胞能够在存在或不存在(微)载体下悬浮生长，并且优选使细胞能够在不含动物产物的培养基中培养。根据本发明使用的细胞培养基优选不含动物产物。已经描述了许多不含动物产物的培养基，如先前所述，其中一些可商购获得。当包装细胞是CEF时，所述CEF优选从无特定病原(SPF)的卵提取。SPF卵可商购获得，例如来自 Charles River Laboratories (Wilmington, MA, USA)。所述卵优选超过 9 天龄，更优选为10到14天龄，和甚至更优选是12天龄。在提取胚胎之前，优选将卵消毒。用于卵消毒的许多方法和产品是现有技术中可获得的。在甲醛溶液(例如2%甲醛，I分钟)中温育然后用70%乙醇清洗是特别优选的。然后解离和纯化胚胎细胞。根据本发明优选的实施方案，将胚胎细胞进行酶消化步骤，破坏细胞间基质。为此，能够消化细胞间基质的酶的使用是尤其有用的。根据本发明优选的酶包括但不限于胰蛋白酶，胶原酶，链霉蛋白酶，分散酶，透明质酸酶和神经氨酸酶。根据本发明用于制备CEF的酶优选是重组来源的。酶可以单独使用或组合使用。在本发明优选的实施方案中，分散酶和胰蛋白酶(例如TrypLE，选自Gibco )是组合使用的。本领域技术人员能够确定允许细胞有效分离的酶浓度，温度和温育时长。CEF培养物的制备可以进一步包括过滤步骤和/或离心步骤以便去除污染物。根据本发明，获得的原代CEF可以直接使用或在进一步细胞传代后作为继代CEF使用。然后在合适的细胞培养基中培养CEF(即原代或继代)。根据本发明使用的细胞培养基优选不含动物产物。已经描述了许多不含动物产物的培养基，如先前所述，其中一些可商购获得。根据本发明，优选在VP-SFM细胞培养基(Invitrogen)中培养CEF。在感染之前，CEF优选培养I到5天，更优选I到2天，和甚至更优选2天。CEF优选在30°C到36. 5°C之间的温度下培养。用正痘病毒感染包装细胞培养物(在步骤a)制备)的步骤b)是本领域技术人员熟知的。如整个申请所用，“感染”是指将病毒核酸转移到细胞，其中病毒核酸被复制，病毒蛋白被合成，或新的病毒颗粒被组装。本领域技术人员能够选择用于产生特定病毒的最合适的包装细胞。根据优选的实施方案，本发明的方法包括使用CEF或专利申请WO 2007/077256或TO 2009/004016涵盖的永生化禽类细胞系来产生正痘病毒，以及优选MVA或W。在合适的细胞培养基中进行用正痘病毒感染包装细胞培养物(在步骤a)制备)的步骤b)，所述细胞培养基可以与制备所述包装细胞培养物(即步骤a)期间)使用的细胞培养基相同或不同。根据本发明使用的细胞培养基优选不含动物产物。已经描述了许多不含动物产物的培养基，如先前所述，其中一些可商购获得。当包装细胞是CEF时,在Basal Medium Eagle细胞培养基(Invitrogen)中进行感染CEF培养物的步骤b)。细胞培养基优选以O. 5到I. 5个胚胎/每升细胞培养基接种，更优选以I. I到I. 3和甚至更优选以约I. 2个胚胎/每升细胞培养基接种。在待产生的正痘病毒是MVA的具体实施方案中，MVA优选以O. 001到O. I、更优选O. 03到O. 07之间和甚至更优选约O. 05的MOI接种细胞培养管。在待产生的正痘病毒是VV的另一具体实施方案中，VV优选以O. 0001到O. I和更优选约O. 0001的MOI接种细胞培养管。培养感染的包装细胞(来自步骤b))直至产生子代正痘病毒的步骤c)是本领域技术人员熟知的。当包装细胞是CEF时，在合适的细胞培养基中进行培养感染的CEF的步骤c)，所述细胞培养基可以与用于制备所述CEF培养物(即步骤a)期间)的细胞培养基和用正痘病毒感染所述CEF培养物(即步骤b)期间)的细胞培养基相同或不同。根据本发明使用 的细胞培养基优选不含动物产物。已经描述了许多不含动物产物的培养基，如先前所述，其中一些可商购获得。根据本发明，感染的CEF的培养是在Basal Medium Eagle细胞培养基(Invitrogen)中进行的。感染的CEF优选培养I到6天,更优选2到4天,和甚至更优选3天。感染的CEF优选在低于37°C、优选30°C到36. 5°C的温度培养。在一或多种核酸酶(即核酸内切酶或核酸外切酶)存在下进行步骤d)的温育以便降解溶液中存在的核酸(例如DNA;RNA)。根据本发明优选使用的核酸酶是核酸内切酶。基于它们的底物可以将核酸内切酶如下分类脱氧核糖核酸酶(DNase)，其降解DNA ;核糖核酸酶(RNase)，其降解RNA ；和核酸内切酶，其降解DNA和RNA。核酸内切酶DNase包括但不限于DNase I7DNase II和脱氧核糖核酸内切酶IV。核酸内切酶RNase包括但不限于RNase I, RNase III，RNAse E，RNAse F和RNAse P。降解DNA和RNA的核酸内切酶包括但不限于Benzonase 。在本发明优选的实施方案中，在存在Benzonase 的条件下进行温育步骤c)产生的正痘病毒的步骤d)。Benzonase 通过水解特定核苷酸之间的内部磷酸二酯键来降解核酸(例如DNA ；RNA)。完全消化后,溶液中存在的所有游离核酸(例如DNA ；RNA)被还原为5'-单磷酸为末端的寡核苷酸，长度为3到8个碱基。Benzonaze 没有蛋白水解活性。本发明使用的Benzonaze .优选是药学上可接受的。药学上可接受的Benzonaze 可商购获得(例如Eurogentec,索引 ME-0280-10 ；Merck,索引例如 I. 01653. 0001)。根据本发明用于核酸酶作用的优选条件是(如实施例I所述)-在7.O到9. O、优选7. 5到8. 5和更优选8. O的pH ;-选自Mg2+和Mn2+优选Mg2+的辅因子的浓度范围是ImM到2mM，优选2mM。根据本发明优选的实施方案，核酸酶在22°C到28°C的温度下温育，优选在23°C到270C的温度、更优选在24°C到26°C的温度和甚至更优选在25°C的温度温育(如实施例I所述)。在该实施方案中，步骤d)的持续时间优选I到5小时，更优选为2小时(如实施例I所述)。根据本发明另一个优选的实施方案，核酸酶在2°C到8°C的温度下温育，优选在3°C到7°C的温度、更优选在4°C到6°C的温度和甚至更优选在5°C的温度温育。在该实施方案中，步骤d)的持续时间优选10到20小时之间，更优选为18小时。根据本发明，步骤d)使用的核酸酶浓度范围是5U/ml到100U/ml，优选范围是5U/ml到50U/ml,和更优选是10U/ml。如图I所不，与使用50U/ml Benzonase 相比，在相同条件下使用10U/ml Benzonase 出人意料地导致处理2小时后(25°C的温度；2mM Mg2+ ；pH8) DNA浓度同等降低。根据本发明优选的实施方案，步骤d)进一步包括添加一或多种去污剂。去污剂包括但不限于Tween，Triton X-100 (九乙二醇辛基苯酚醚)，皂苷，SDS, Brij 96，聚多卡醇，N-辛基β-D-批喃葡萄糖苷和碳酸钠。步骤d)使用的优选去污剂是Tween。Tween包括但不限于Tween 20 (聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯)，Tween 80 (聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯)和Tween 85 (聚氧乙烯失水山梨糖醇三油酸酯)。步骤d)使用的优选Tween是Tween 80。根据本发明，步骤d)使用的去污剂浓度范围是10 μ g/L到100 μ g/L，优选范围是 10 μ g/L 到 55μ g/L。
然后从培养上清液和/或包装细胞回收产生的并且之前用核酸酶处理过的正痘病毒。当从包装细胞回收正痘病毒(即只从包装细胞，或从包装细胞和上清液)时，步骤e)之前可以是破坏包装细胞膜的步骤。该步骤导致从包装细胞释放正痘病毒。包装细胞膜的破坏可以通过本领域技术人员熟知的各种技术诱导。这些技术包括但不限于冷冻/解冻，低渗裂解，超声处理(通过使用超声发生器)和微流化(通过使用微流化器)。超声发生器可商购得自例如Heraeus PSP, Biologies, Misonix或GlenMills。本发明使用的优选超声发生器是S0NITUBE 20kHz型SM 20-120-3，SONITUBE 36kHz型SM35/3WU 和 S0NITUBE 35kHz 型 SM 35-400-3 (Heraeus PSP)。微流化器可商购得自例如Microfluidics Corporation。还可以通过使用SLM Aminco French破碎仪破坏包装细胞膜。还可以使用高速匀浆器破坏包装细胞膜。高速匀浆器可商购得自例如SilversonMachines 或 Ika-Labotechnik。本发明使用的优选高速勻衆器是 SILVERSON L4R (SiIversonMachines) 0破坏包装细胞膜后获得的混合物可以在搅拌条件下进一步温育至少I小时以允许先前添加(在步骤d))的核酸酶降解从包装细胞释放的核酸(例如DNA)。在本发明的具体实施方案中，因此步骤e)之前是I.允许破坏包装细胞膜的步骤，优选通过使用高速匀浆器或通过超声处理；和2.将步骤I)获得的混合物温育至少I小时的步骤，以允许在步骤d)添加的核酸酶降解从包装细胞释放的核酸(例如DNA)。根据本发明，步骤2)的持续时间优选在I到5小时之间，更优选是2小时(如实施例I所述)。根据本发明，在步骤2)期间核酸酶(先前添加的(在步骤d))在22°C到28°C之间的温度下温育，优选在23°C到27°C之间的温度、更优选在24°C到26°C之间的温度和甚至更优选在25°C的温度温育(如实施例I所述)。将一价盐添加到步骤e)回收的正痘病毒的步骤f)允许在合适条件下-抑制核酸酶活性；和-避免正痘病毒吸附到步骤g)的阴离子交换吸附剂上，即避免超过10%的正痘病毒吸附到阴离子交换吸附剂上。因此在步骤g)将只有核酸(例如DNA)吸附到阴离子交换吸附剂上。—价盐包括但不限于NaCl和KCl。步骤f)使用的优选一价盐是NaCl。根据本发明，步骤f)的一价盐浓度范围是200mM到300mM，优选250mM或300mM。根据本发明，步骤
f)在7. O到9. O之间的pH、优选在7. 5到8. 5之间的pH、更优选在8. O的pH下进行。根据本发明，将一价盐添加到步骤e)回收的正痘病毒的步骤f)优选根据实施例I描述的条件进行，其中使用PH 8. O的NaCl 250mM或更优选300mM。将步骤f)获得的混合物与阴离子交换吸附剂接触的步骤g)允许在合适条件下捕获所述混合物中包含的核酸(例如DNA)。由于在步骤f)进行的处理，正痘病毒不被阴离子交换吸附剂所捕获。根据本发明，步骤g)在7. O到9. O之间的pH、优选在7. 5到8. 5之间的pH下、更优选在8. O的pH下进行(如实施例I所述)。
根据本发明，步骤g)的持续时间优选在I到3小时之间，更优选是I小时(如实施例I所述)。根据本发明，步骤g)使用的阴离子交换吸附剂的官能团是伯氨基，仲氨基，叔氨基和季氨基，如例如二甲基氨基乙基(DMAE)，二乙基氨基乙基(DEAE)，三甲基氨基乙基(TMAE)，三乙基氨乙基(TEAE)，基团-R-CH (OH) -CH2-N+- (CH3) 3 (也称为Q基；参见Streamline 树脂，Pharmacia)和其它基团如例如聚乙烯亚胺(PEI)，其在7. O到9. O的PH范围内已经具有或将具有正式的正电荷。步骤g)使用的优选的阴离子交换吸附剂的官能团选自二甲基氨基乙基(DMAE)，二乙基氨基乙基(DEAE)，三甲基氨基乙基(TMAE)和三乙基氨基乙基(TEAE)，更优选三甲基氨基乙基(TMAE)。步骤g)使用的阴离子交换吸附剂可以包括例如珠形式基质或膜。根据本发明优选的实施方案，步骤g)使用的阴离子交换吸附剂包括珠形式基质。基质可以是例如琼脂糖，亲水聚合物，纤维素，葡聚糖或硅石。链(例如葡聚糖链)与基质偶联。先前描述的官能团通过化学稳定键(例如醚键)与链连接。珠形式基质的优选官能团是三甲基氨基乙基(TMAE)。根据本发明，珠形式基质的珠具有比用于净化步骤h)的滤器孔径更大的直径。因此珠形式基质的珠优选具有大于8 μ m的直径，更优选50 μ m到150 μ m的直径，更优选90 μ m到120 μ m的直径，和甚至更优选为120 μ m的直径。基于本发明的现有特征，正痘病毒(具有200-300nm的直径)在净化步骤h)期间将通过滤器的孔径(即正痘病毒将在流过物中回收)。包括本发明所用珠形式基质中的阴离子交换吸附剂优选是可高压消毒的。包括珠形式基质的可高压消毒的阴离子交换吸附剂已被描述，其中一些可商购获得，如例如UNOsphere Q (BioRad)，UNOsphere S (BioRad)，STREAMLINE Q Sepharose XL (Amersham Biosciences), STREAMLINE SP Sepharose XL (AmershamBiosciences) 或BioSepra Q hyperZ(Pall Corporation)。包括本发明珠形式基质的优选可高压消毒的阴离子交换吸附剂是UNOsphere Q (BioRad)。UNOsphere Q(BioRad)包括亲水球形聚合珠，具有120 μ m的直径，并带有三甲基氨基乙基(TMAE)官能团。将步骤f)获得的混合物与阴离子交换吸附剂(其中所述交换吸附剂包括珠形式基质)接触的步骤g)优选根据实施例I描述的条件进行，其中使用UNOsphere Q(BioRad)。根据本发明另一个优选的实施方案，步骤g)使用的阴离子交换吸附剂包括膜。膜的官能团可以如先前描述。膜的优选官能团是三甲基氨基乙基(TMAE)。根据本发明，膜具有大于正痘病毒直径(即200nm)的孔径。因此将在流过物中回收正痘病毒。就这点来说，根据本发明的膜具有I μ m到5 μ m的孔径，优选孔径为3 μ m。包括本发明所用膜的阴离子交换吸附剂优选是可高压消毒的。包括膜的可高压消毒的阴离子交换吸附剂已被描述，其中一些可商购获得，如例如Sartobind 75Q (Sartorius), CUNO PolyNet Filters (例如 PolyNet PB P010, P020, P030, P050)或 CUNO Betapure Filters (例如 Betapure Z13-020, Z13-030, Z13-050)。包括本发明膜的优选的可高压消毒的阴离子交换吸附剂是Sartobind 75Q (Sartorius)。当利用膜形式的阴离子交换吸附剂进行步骤g)时，不需要下列净化步骤h)(允许去除细胞碎片)。细胞碎片被膜(具有Iym到5μπ ι的孔径，优选孔径为3μπι)截留。在合适条件下将步骤g)获得的混合物净化的步骤h)允许去除细胞碎片。根据本发明，优选通过深度过滤进行步骤h)的净化。深度过滤包括但不限于使用一或多种商购可获得的产品，如来自Sartorius的Sartopure 滤器(例如Sartopure PP2)，CUNOIncorporated AP系列深度滤器(例如APOI), CUNO Incorporated CP系列深度滤器(例如CP10, CP30, CP50, CP60, CP70, CP90)，CUNO Incorporated HP 系列深度滤器(例如 HP10，HP30, HP50, HP60, HP70, HP90)，CUNO Incorporated Calif.系列深度滤器(例如 CA10，CA30, CA50, CA60, CA70, CA90)，CUNO Incorporated SP 系列深度滤器(例如 SP10, SP30,SP50，SP60，SP70，SP90)，CUNO Delipid and Delipid Plus 滤器，Millipore CorporationCE 系列深度滤器(例如 CE15, CE20, CE25, CE30, CE35, CE40, CE45, CE50, CE70, CE75)，Millipore Corporation DE 系列深度滤器(例如 DE25，DE30，DE35，DE40，DE45，DE50，DE55，DE560, DE65, DE70, DE75)，Millipore Corporation HC 滤器(例如 A 1HC, B1HC, C0HC)，CUNO PolyNet Filters (例如 PolyNet PB P050, P100, P200, P300, P400, P500, P700)，Millipore Clarigard and Polygard 滤器，CUNO Life Assure 滤器，ManCel Associates深度滤器(例如 PR 12UP，PR12，PR 5UP);和 PALL 或 SeitzSchenk Incorporated 滤器。为了提高可用深度过滤装置的净化能力，将两个或更多个孔径减小的单元偶联是有用的。在这种实施方案中，待净化混合物通过第一深度过滤单元(其中最大的污染物被截留)，随后通过第二深度过滤单元。就这点来说，根据本发明优选的实施方案，步骤h)的净化通过深度过滤进行，优选在孔径为8μπι的滤器(与孔径为5μπι的滤器偶联)上进行。本发明使用的具有孔径为8 μ m和5 μ m的优选滤器是由Sartorius商品化供应的Sartopure 滤器(Sartopure PP2)。深度过滤可以按照至少IL/分钟的流速进行，优选流速为IL/分钟。根据本发明，步骤h)在7. O到9. O的pH、优选在7. 5到8. 5的pH、更优选在8. O的pH下进行。将步骤g)获得的混合物净化的步骤h)优选根据实施例I描述的条件进行，其中所述净化通过在具有8 μ m孔径的滤器(与具有5 μ m孔径的滤器偶联)上深度过滤进行，流速为IL/分钟。在净化步骤h)期间正痘病毒(直径为200_300nm)穿过滤器的孔径。因此将在流过物中回收正痘病毒。用包括一价盐的溶液清洗阴离子交换吸附剂的步骤i)允许在合适条件下回收流过物中剩余的正痘病毒。使用的一价盐包括但不限于NaCl和KCl。步骤i)使用的优选一价盐是NaCl。根据本发明，步骤i)使用的一价盐浓度范围是200mM到300mM，优选250mM或300mM。根据本发明，步骤i)在7. O到9. O的pH、优选在7. 5到8. 5的pH、更优选在8. O的pH下进行。根据本发明优选的实施方案，步骤i)中包括一价盐的溶液是药学上可接受的溶液，包括IOOmM Tris-HCl，蔗糖5% (w/v)，IOmM谷氨酸钠和50mM NaCl, pH 8.0，具有生理学渗透性(290m0sm/kg)(即S08缓冲液)。根据本发明其它优选的实施方案，步骤i)中包括一价盐的溶液是药学上可接受的溶液，包括例如Tris缓冲液,三乙醇胺缓冲液或磷酸盐缓冲液。用包括一价盐的溶液清洗阴离子交换吸附剂的步骤i)优选根据实施例I描述的条件进行，其中利用S08药学上可接受的缓冲液(包括NaCl 250mM，或更优选300mM)进行清洗。浓缩步骤h)获得的流过物和步骤i)获得的流过物的步骤j)允许清除所述流过物级分中存在的蛋白。在本发明优选的实施方案中，浓缩步骤j)通过微量过滤进行。微量过滤是压力驱动的膜方法，其浓缩和纯化大分子。更具体地，溶液穿过滤器，其孔径已被选择以拒绝保留物中的正痘病毒并允许小分子(例如蛋白)穿过滤器进入渗透物中。微量过滤降低提取液的体积。就这点来说，因此使用具有以下孔径的滤器进行微量过滤孔径小于O. 2 μ m，优选孔径在O. 09 μ m到O. 15 μ m之间,和更优选孔径为O. I μ m。本发明使用的滤器优选是可高 压消毒的。步骤j)使用的可高压消毒的滤器可商购获得，例如Prostak MicrofiltrationModules (Millipore),其中优选 Prostak Microfiltration Module PSVVAG021, PSVVAG041和SK2P12E1。浓缩步骤h)获得的流过物和步骤i)获得的流过物的步骤j)优选根据实施例I描述的条件进行，其中通过在孔径为O. I μ m的滤器上微量过滤进行浓缩。在本发明另一个优选的实施方案中，浓缩步骤j)通过超滤进行。根据本发明，超滤优选是交叉流过滤。交叉流过滤的原理是本领域技术人员已知的(参见例如Richards, G. P. and Goldmintz,D. , J. Virol. Methods (1982),4 (3), pages 147-153. " Evaluation of a cross-flowfltration technique for extraction of polioviruses from inoculated oystertissue homogenates")。将步骤j)获得的包括正痘病毒的级分(例如当已经通过微量过滤或超滤进行浓缩步骤k)时的保留物)进行渗滤的步骤k)是微量过滤的改进，涉及用溶液稀释包括正痘病毒的所述级分以降低所述级分中杂质的浓度。包括正痘病毒的级分的稀释允许从所述级分清洗掉更多杂质。应理解渗滤可以采用批量方式，半连续方式，或连续方式进行。渗滤步骤k)可有利地用于改变其中包括正痘病毒的缓冲液。例如，它可用于利用药学上可接受的缓冲液来替换纯化过程使用的缓冲液。根据本发明，使用具有以下孔径的滤器来进行微量过滤孔径小于O. 2 μ m，优选孔径在O. 09 μ m到O. 15 μ m之间，和更优选孔径为O. I μ m。本发明使用的滤器优选是可高压消毒的。步骤k)使用的可高压消毒的滤器可商购获得，例如 Prostak Microfiltration Modules (Millipore),其中优选 Prostak MicrofiltrationModule PSVVAG021，PSVVAG041和SK2P12E1。将步骤j)获得的包括正痘病毒的级分渗滤的步骤k)优选根据实施例I描述的条件进行，其中在孔径为O. I μ m的滤器上进行渗滤。浓缩步骤j)和渗滤步骤k)可以有利地利用相同类型的滤器完成。本发明的当前方法A还可以包括I.凝胶过滤步骤(即步骤I));和2.渗滤步骤(即步骤m))。凝胶过滤步骤(即步骤I):根据本发明，步骤k)获得的样品在包括珠的固相支持物上进行处理，所述珠的直径在3 μ m到160 μ m之间，有利地在80 μ m到160 μ m之间，优选在40 μ m到105 μ m之间，更优选在25 μ m到75 μ m之间，更优选在20 μ m到80 μ m之间，和甚至更优选在20 μ m到60 μ m之间。根据本发明，所述支持物具有接近于正痘病毒直径的孔隙(即200nm-300nm)以便后者不渗入珠。另一方面，大小更小的分子渗入珠，其迁移被减慢。用于步骤I)凝胶过滤的支持物可以基于例如琼脂糖，葡聚糖，丙烯酰胺，硅石，乙二醇/甲基丙烯酸共聚物，或其混合物，如例如琼脂糖和葡聚糖的混合物。根据本发明，优选使用不含官能团的支持物。凝胶过滤层析支持物可商购获得，如例如■乙二醇/甲基丙烯酸凝胶过滤层析支持物(例如Toyopearl HW 55,Toyopearl HW 65 和 Toyopearl HW 75,具有在 20 μ m 到 60 μ m 之间的珠直径，Tosohaas)；■烯丙基葡聚糖/亚甲基双丙烯酰胺凝胶过滤层析支持物(例如S印hacryl S300HR，具有在25μπι到75 μ m之间的珠直径；Sephacry I S400HR，具有在25 μ m到75 μ m 之间的珠直径；SephacryI S500HR,具有在25 μ m至Ij 75 μ m之间的珠直径；SephacryI S1000SF，具有在40μπι至Ij 105 μ m之间的珠直径，全部购自Pharmacia)；■ N-丙烯酰胺轻基丙二醇凝胶过滤层析支持物(例如Trisacryl,具有在80 μ m到160 μ m之间的珠直径，Biosepra)；■琼脂糖凝胶过滤层析支持物(例如Macro-Prep SE,具有在20 μ m到80 μ m之间的珠直径，Bio-Rad)。乙二醇/甲基丙烯酸凝胶过滤层析支持物(例如Toyopearl HW 55，Toyopearl HW 65和Toyopearl 服75，具有在20 μ m到60 μ m之间的珠直径，Tosohaas)是优选的。本发明用于凝胶过滤步骤I)的优选条件是-一价盐，选自NaCl和KCl，优选NaCl，浓度范围是200mM到2M，优选范围是200mM到1M，和更优选为500mM ；-在7.O到9. O之间的pH，优选在7. 5到8. 5之间，和更优选8. O的pH。渗滤步骤m)按照先前在渗滤步骤k)中描述的方式和条件进行。根据本发明，先前描述的方法A的步骤f)到步骤I)中的每个步骤之前可以是在存在一或多种稳定剂下温育包括正痘病毒的样品的步骤。如本文所用，“稳定剂”是指允许保存正痘病毒的物质。稳定剂包括但不限于糖(例如蔗糖，海藻糖，山梨糖，松三糖，山梨醇，水苏糖，棉子糖，果糖，甘露糖，麦芽糖，乳糖，阿拉伯糖，木糖，核糖，鼠李糖，半乳糖，葡萄糖，甘露醇，木糖醇，赤藓醇，苏糖醇，山梨醇，甘油)，氨基酸(例如甘氨酸；亮氨酸；赖氨酸；精氨酸；天冬氨酸；缬氨酸；谷氨酸)，去污剂(例如Triton X-100 ;Tween如例如Tween
20,Tween 80或Tween 85)和盐(例如NaCl ;KC1)。根据本发明优选的实施方案，用于该温育步骤的稳定剂是糖，更优选是蔗糖。根据本发明，用于该温育步骤的蔗糖浓度范围是25g/L到100g/L，优选50g/L。根据本发明，稳定剂可以包括在包含药学上可接受的溶液的溶液中，包括IOOmM Tris-HCl，蔗糖5% (w/v)，IOmM谷氨酸钠和50mM NaCl，pH 8.0，具有生理学渗透性(290m0sm/kg)(即S08缓冲液)。根据本发明，稳定剂可以包括在由药学上可接受的溶液组成的溶液中，包括例如Tris缓冲液，三乙醇胺缓冲液或磷酸盐缓冲液。根据本发明，在稳定剂存在条件下的该温育步骤是在以下PH进行的7. O到9. O之间，优选7. 5到8. 5之间，和更优选为8. O的pH。根据本发明，在稳定剂存在条件下该温育步骤的持续时间是I小时到20小时之间，更优选为18小时。根据本发明，在稳定剂存在条件下的该温育步骤是在2到8 °C之间的温度下进行，优选在3°C到7 °C之间的温度、更优选在4°C到6°C之间的温度和甚至更优选为5°C的温度下进行。在稳定剂存在条件下的该温育步骤优选如实施例I所述，在5°C的温度、存在50g/L蔗糖的条件下进行18小时。根据如先前描述的本发明方法A的另一个实施方案，在从培养上清液和/或包装细胞回收正痘病毒的步骤e)之后进行净化步骤(步骤h))。根据本发明另一个实施方案，不进行在合适条件下向步骤e)回收的正痘病毒中添加一价盐以抑制核酸酶活性并避免步骤g)中所述正痘病毒吸附到阴离子交换吸附剂的步骤f)。就这点来说，因此本发明还涉及一种用于产生和纯化野生型、减毒和/或重组正 痘病毒的方法(即方法B)，包括下列步骤)制备包装细胞的培养物；b/ )用正痘病毒感染包装细胞培养物；c,)培养感染的包装细胞直至产生子代正痘病毒；(T)在一或多种核酸酶存在下温育；e')从培养上清液和/或包装细胞回收正痘病毒；f,)在存在以下试剂的条件下温育步骤e')回收的正痘病毒I. 一或多种能够抑制核酸酶活性的物质，和任选存在的2. 一或多种稳定剂。g')在合适条件下将步骤f')获得的混合物与阴离子交换吸附剂接触以捕获正痘病毒和核酸；h')在合适条件下将步骤g')获得的混合物净化以去除细胞碎片；)用包括一价盐的溶液洗脱正痘病毒；j')浓缩步骤i')获得的混合物；k')将步骤j')获得的包括正痘病毒的级分进行渗滤。制备包装细胞培养物的步骤a')是指先前描述的制备包装细胞培养物的步骤a)。用正痘病毒感染包装细胞培养物的步骤b')是指先前描述的用正痘病毒感染包装细胞培养物的步骤b)。培养感染的包装细胞直至产生子代正痘病毒的步骤c')是指先前描述的培养感染细胞直至产生子代正痘病毒的步骤c)。在一或多种核酸酶存在下的温育步骤cT )是指先前描述的在一或多种核酸酶存在下的温育步骤d)。从培养上清液和/或包装细胞回收正痘病毒的步骤e')是指先前描述的从培养上清液和/或包装细胞回收正痘病毒的步骤e)。然后步骤e')中回收的正痘病毒在存在以下的条件下温育(步骤f’ ))I. 一或多种能够抑制核酸酶活性的物质，和任选存在的2. 一或多种稳定剂。
能够抑制核酸酶活性的物质包括但不限于螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA) ;二亚乙基三胺五乙酸(DTPA);次氨基三乙酸(NTA))，一价盐(例如NaCl或KC1)，蛋白酶，磷酸盐，一价阳离子(例如Na+ ；Li+ ；K+ ；Ag+)，盐酸胍和硫酸铵。螯合剂如例如EDTA，DTPA或NTA除去金属离子(例如Mg2+ ;Mn2+)，如前所述，所述金属离子构成核酸酶活性的必需辅因子。浓度在50mM到150mM之间(优选为大约IOOmM)的一价盐(例如NaCl或KCl)导致核酸酶灭活。浓度在大约IOOmM或以上的磷酸盐和/或一价阳离子(例如Na+ ；Li+ ；K+ ；Ag+)导致核酸酶灭活。浓度高于IOOmM的盐酸胍和硫酸铵导致核酸酶灭活。根据本发明优选的实施方案，步骤f,)中能够抑制核酸酶活性的物质是螯合剂，更优选是乙二胺四乙酸(EDTA)。根据本发明，步骤f')中使用的EDTA浓度范围是5mM到20mM，优选是10mM。根据本发明另一个优选的实施方案，步骤Γ )中能够抑制核酸酶活性的物质是一价盐，优选NaCl，更优选NaCl 100mM。根据本发明另一个优选的实施方案，步骤f')中能够抑制核酸酶活性的物质是一价盐和螯合剂，优选NaCl和EDTA，更优选NaCl IOOmM和EDTA IOmM (如实施例4所述)。根据本发明，步骤f')在7. O到9. O的pH下进行，优选在7. 5到8. 5、更优选在 8.O的pH进行(如实施例4所述)。根据本发明，步骤f')是在2 V到8 V之间的温度下进行，优选在3 V到7 V之间的温度、更优选在4°C到6°C之间的温度和甚至更优选为5°C的温度下进行。根据本发明，步骤r )的持续时间在5分钟到20小时之间。在本发明优选的实施方案中，步骤P )的持续时间在2到20小时之间，优选18小时。在该实施方案中，除了能够抑制核酸酶活性的物质外(如先前所述)，还在一或多种稳定剂存在的条件下温育步骤e')中获得的正痘病毒。步骤f,)中的“稳定剂”是指所述步骤f,)用能够抑制核酸酶活性的物质处理期间允许保存正痘病毒的物质。稳定剂包括但不限于糖(例如蔗糖，海藻糖，山梨糖，松三糖，山梨醇，水苏糖，棉子糖，果糖，甘露糖，麦芽糖，乳糖，阿拉伯糖，木糖，核糖，鼠李糖，半乳糖，葡萄糖，甘露醇，木糖醇，赤藓醇，苏糖醇，山梨醇，甘油)，氨基酸(例如甘氨酸；亮氨酸；赖氨酸；精氨酸；天冬氨酸；缬氨酸；谷氨酸)，去污剂(例如Triton X-100 ；Tween,如例如Tween 20, Tween 80或Tween 85)和盐(例如NaCl ;KC1)。根据本发明优选的实施方案，用于步骤Γ )的稳定剂是糖，优选蔗糖。根据本发明，用于步骤Γ )的蔗糖浓度范围是25g/L到100g/L，优选50g/L。根据本发明，稳定剂可以包括在由药学上可接受的溶液组成的溶液中，包括IOOmMTris-HCl，蔗糖5% (w/v)，IOmM谷氨酸钠和50mM NaCl，pH 8.0，具有生理学渗透性(290m0sm/kg)(即S08缓冲液)。根据本发明，稳定剂可以包括在由药学上可接受的溶液组成的溶液中，包括例如Tris缓冲液，三乙醇胺缓冲液或磷酸盐缓冲液。将步骤f,)获得的混合物与阴离子交换吸附剂接触的步骤g')允许在合适条件下捕获所述正痘病毒以及同样含在所述混合物中的核酸(例如DNA)。根据本发明，步骤g')在7. O到9. O之间的pH下进行，优选在7. 5到8. 5、更优选在8. O的pH下进行(如实施例4所述)。根据本发明，步骤g')的持续时间优选在I到3小时之间，更优选I小时(如实施例4所述)。根据本发明，步骤g')使用的阴离子交换吸附剂的官能团是伯氨基，仲氨基，叔氨基和季氨基，如例如二甲基氨基乙基(DMAE)，二乙基氨基乙基(DEAE)，三甲基氨基乙基(TMAE)，三乙基氨基乙基(TEAE)，基团-R-CH(OH)-CH2-N+-(CH3)3(也称为Q基；参见Streamline 树脂，Pharmacia)和其它基团如例如聚乙烯亚胺(PEI)，其在7. O到9. O的pH范围内已经具有或将具有正式的正电荷。步骤g,)使用的优选的阴离子交换吸附剂的官能团选自二甲基氨基乙基(DMAE)，二乙基氨基乙基(DEAE)，三甲基氨基乙基(TMAE)和三乙基氨基乙基(TEAE)，更优选三甲基氨基乙基(TMAE)。步骤g')使用的阴离子交换吸附剂可以包括例如珠形式基质或膜。根据本发明优选的实施方案，步骤g')使用的阴离子交换吸附剂包括珠形式基质。基质可以是例如琼脂糖，亲水聚合物，纤维素，葡聚糖或硅石。链(例如葡聚糖链)与基质偶联。先前描述的官能团通过化学稳定键(例如醚键)与链连接。珠形式基质的优选官能团是三甲基氨基乙基(TMAE)。根据本发明，珠形式基质的珠具有比用于净化步骤h')的滤器孔径更大的直径。因此珠形式基质的珠优选具有大于8 μ m的直径，更优选在50 μ m到150 μ m之间的直径，更优选在90 μ m到120 μ m之间的直径和甚至更优选120 μ m的直径。基于本发明的当前特征，在净化步骤h')期间吸附正痘病毒的珠形式基质的珠以及细胞碎片将被滤器保留。包括本发明所用珠形式基质的阴离子交换吸附剂优选是可高压消毒的。 包括珠形式基质的可高压消毒的阴离子交换吸附剂已经被描述，其中一些可商购获得，如例如UNOsphere Q (BioRad), UNOsphere s (BioRad), STREAMLINE Q Sepharose XL (Amersham Biosciences), STREAMLINE SP Sepharose XL (Amersham Biosciences)或BioSepra Q hyperZ (Pall Corporation)。包括本发明珠形式基质的优选的可高压消毒的阴离子交换吸附剂是 UNOsphere Q (BioRad)和 BioSepra Q hyperZ (Pal ICorporation)。 UNOsphere Q(BioRad)包括亲水球形聚合珠，具有120 μ m的直径并带有三甲基氨基乙基(TMAE)官能团。BioSepra Q hyperZ (Pall Corporation)包括非常致密和多孔的二氧化锆珠，具有约75 μ m的直径并带有季胺Q官能团。将步骤f')获得的混合物与阴离子交换吸附剂(其中所述交换吸附剂包括珠形式基质)接触的步骤g')优选根据实施例4描述的条件进行,其中使用BioSepra Q hyperZ (Pall Corporation)。根据本发明另一个优选的实施方案，步骤g')使用的阴离子交换吸附剂包括膜。膜的官能团可以如先前描述。膜的优选官能团是三甲基氨基乙基(TMAE)。根据本发明优选的实施方案，用于步骤^ )的膜具有Iym到5μπι的孔径，优选3μπι的孔径。根据本发明另一个优选的实施方案，用于步骤g')的膜具有低于正痘病毒大小(即200nm)的孔径，更具体为O. Ιμπι的孔径。包括膜的许多阴离子交换吸附剂已经被描述，其中一些可商购获得，如例如Sartobind 75Q (Sartorius)。本发明所用的包括膜的阴离子交换吸附剂优选是可高压消毒的。包括膜的可高压消毒的阴离子交换吸附剂已经被描述，其中一些可商购获得，如例如Sartobind 75Q(Sart0riUS)。包括本发明膜的优选的可高压消毒的阴离子交换吸附剂是Sartobind 75Q (Sartorius)。当利用阴离子交换膜形式的阴离子交换吸附剂进行步骤g')时，不需要下列净化步骤h')(允许去除细胞碎片)。细胞碎片已经被用于步骤f')的阴离子交换膜保留(如先前所述)。将步骤g')获得的混合物净化的步骤h')是指先前描述的将步骤g)获得的混合物净化的步骤h)。根据本发明优选的实施方案，当用珠形式基质的阴离子交换吸附剂进行步骤g')时，步骤h')之前可以是允许去除吸附正痘病毒的所述珠形式基质的步骤。就这点来说，通过使用例如具有小于珠形式基质珠大小的孔径的滤袋进行所述步骤。根据本发明，滤袋的孔径在10 μ m到100 μ m之间，优选在25 μ m到100 μ m之间，更优选是50 μ m。本发明使用的滤袋优选是可高压消毒的。可高压消毒的滤袋已经被描述，其中一些可商购获得，如例如 CUNO Felt Filter Bags (CUNO)，其中聚酯 Felt Filter Bags (例如 NB EES0010,0025，0050，0100)，聚酯 / 聚丙烯 Felt Filter Bags (例如 NB PES 0010，0025，0050，0100)和尼龙单丝 Felt Filter Bags (例如 NB NYS 0025，0050，0100)是优选的。用包括一价盐的溶液洗脱正痘病毒的步骤i')允许从阴离子交换吸附剂回收捕获的正痘病毒。使用的一价盐包括但不限于NaCl和KC1。步骤i,)使用的优选一价盐是NaCl。根据本发明的一个实施方案，通过优选O到2. 5M、更优选O到2M和甚至更优选O到I. 5M范围增加的一价盐浓度梯度进行洗脱。根据本发明另一个实施方案，通过在低于IM(优选在300mM到750mM之间，更优选为500mM)的一价盐浓度下的单步洗脱来进行洗脱。根据本发明，步骤P )在7. O到9. O之间的pH下进行，优选在7. 5到8. 5、更优选在8. O 的PH下进行。根据本发明优选的实施方案，步骤i')中包括一价盐的溶液是由药学上可接受的溶液，包括IOOmM Tris-HCl，蔗糖5% (w/v)，IOmM谷氨酸钠和50mM NaCl，pH 8.0，具有生理学渗透性(290m0sm/kg)(即S08缓冲液)。根据本发明其它优选的实施方案，步骤
)中包括一价盐的溶液是药学上可接受的溶液，包括例如Tris缓冲液，三乙醇胺缓冲液或磷酸盐缓冲液。用包括一价盐的溶液洗脱正痘病毒的步骤P )优选根据实施例4描述的条件进行，其中通过S08缓冲液中增加的NaCl浓度梯度(300mM ；400mM ；500mM)进行洗脱。浓缩步骤i,)获得的混合物的步骤j')允许清除所述流过物级分中存在的蛋白。在本发明优选的实施方案中，浓缩步骤j')通过微量过滤进行(如先前步骤j)中描述的)。在本发明另一个优选的实施方案中，浓缩步骤j')通过超滤进行(如先前步骤j)中描述的)。将步骤j')中获得的包括正痘病毒的级分进行渗滤的步骤k')是指先前描述的将步骤j)中获得的包括正痘病毒的级分进行渗滤的步骤k)。本发明的当前方法B可以进一步包括I.凝胶过滤步骤(即步骤Γ ));和2.渗滤步骤(即步骤m' )) ο凝胶过滤步骤I')是指凝胶过滤步骤I)。渗滤步骤m')是指渗滤步骤m)。根据本发明，先前描述的方法B的步骤f')到步骤Γ )中的每个步骤之前可以是在一或多种稳定剂存在下温育包括正痘病毒的样品的步骤。如本文所用，“稳定剂”是指允许保存正痘病毒的物质。稳定剂包括但不限于糖(例如蔗糖，海藻糖，山梨糖，松三糖，山梨醇，水苏糖，棉子糖，果糖，甘露糖，麦芽糖，乳糖，阿拉伯糖，木糖，核糖，鼠李糖，半乳糖，葡萄糖，甘露醇，木糖醇，赤藓醇，苏糖醇，山梨醇，甘油)，氨基酸(例如甘氨酸；亮氨酸；赖氨酸；精氨酸；天冬氨酸；缴氨酸；谷氨酸)，去污剂(例如Triton X-100 ；Tween,如例如Tween 20, Tween 80或Tween 85)和盐(例如NaCl ;KC1)。根据本发明优选的实施方案，用于该温育步骤的稳定剂是糖，更优选是蔗糖。根据本发明，用于该温育步骤的蔗糖浓度范围是25g/L到100g/L，优选是50g/L。根据本发明，稳定剂可以包括在由药学上可接受的溶液组成的溶液中，包括IOOmM Tris-HCl,鹿糖5% (w/v), IOmM谷氨酸钠和50mM NaCl,pH
8.O，具有生理学渗透性(290m0sm/kg)(即S08缓冲液)。根据本发明，稳定剂可以包括在由药学上可接受的溶液组成的溶液中，包括例如Tris缓冲液，三乙醇胺缓冲液或磷酸盐缓冲液。根据本发明，在稳定剂存在下的该温育步骤是在以下PH进行在7.0到9.0之间，优选在7. 5到8. 5之间，和更优选为8. O的pH。根据本发明，在稳定剂存在下该温育步骤的持续时间在I小时到20小时之间，更优选为18小时。根 据本发明，在稳定剂存在下的该温育步骤是在2°C到8°C之间的温度下进行，优选在3°C到7°C之间的温度、更优选在4°C到6V之间的温度和甚至更优选在5°C的温度下进行。在稳定剂存在下的该温育步骤优选在5°C的温度、存在50g/L蔗糖的条件下进行18小时。根据如先前描述的本发明方法B的另一个实施方案，在从培养上清液和/或包装细胞回收正痘病毒的步骤e')之后进行净化步骤(步骤h'))。本发明还涉及组合了先前描述的方法A的步骤和方法B的步骤的方法。就这点来说，本发明更具体涉及一种用于产生和纯化野生型、减毒和/或重组正痘病毒的方法(即方法C)，包括下列步骤a")制备包装细胞培养物；b")用正痘病毒感染包装细胞培养物；c")培养感染的包装细胞直至产生子代正痘病毒；d")在一或多种核酸酶存在下温育；e")从培养上清液和/或包装细胞回收正痘病毒； ")在存在以下物质的条件下温育步骤e")回收的正痘病毒I. 一或多种能够抑制核酸酶活性的物质，和任选存在的2. 一或多种稳定剂；g")在合适条件下将步骤f")获得的混合物与阴离子交换吸附剂接触以允许捕获所述正痘病毒和核酸；h")在合适条件下将步骤g")获得的混合物净化以允许去除细胞碎片；i")用包括一价盐的溶液洗脱正痘病毒；j")向步骤i")洗脱的正痘病毒中添加一价盐以避免步骤k")中所述正痘病毒吸附到阴离子交换吸附剂上；k")在合适条件下将步骤j")获得的混合物与阴离子交换吸附剂接触以允许捕获核酸；I")在合适条件下用包括一价盐的溶液清洗阴离子交换吸附剂以回收流过物中剩余的正痘病毒；m")浓缩步骤I")获得的流过物；η")将步骤m")获得的包括正痘病毒的级分进行渗滤。制备包装细胞培养物的步骤a")是指先前描述的制备包装细胞培养物的步骤a)。
用正痘病毒感染包装细胞培养物的步骤b")是指先前描述的用正痘病毒感染包装细胞培养物的步骤b)。培养感染的包装细胞直至产生子代正痘病毒的步骤c ")是指先前描述的培养感染细胞直至产生子代正痘病毒的步骤c)。在一或多种核酸酶存在下的温育步骤d")是指先前描述的在一或多种核酸酶存在下的温育步骤d)。从培养上清液和/或包装细胞回收正痘病毒的步骤e")是指先前描述的从培养上清液和/或包装细胞回收正痘病毒的步骤e)。在存在(I) 一或多种能够抑制核酸酶活性的物质和任选存在的(2) —或多种稳定剂的条件下将步骤e")回收的正痘病毒温育的步骤f")是指先前描述的在存在(I) 一或多种能够抑制核酸酶活性的物质和任选存在的(2) —或多种稳定剂的条件下将步骤e')回收的正痘病毒温育的步骤Γ )。
在合适条件下将步骤f")获得的混合物与阴离子交换吸附剂接触以允许捕获所述正痘病毒和核酸的步骤g")是指先前描述的在合适条件下将步骤f,)获得的混合物与阴离子交换吸附剂接触以允许捕获所述正痘病毒和核酸的步骤g')。将步骤g")获得的混合物净化的步骤h")是指先前描述的将步骤g)获得的混合物净化的步骤h)。用包括一价盐的溶液洗脱正痘病毒的步骤i")是指先前描述的用包括一价盐的溶液洗脱正痘病毒的步骤P )。向先前在步骤i")中洗脱的正痘病毒中添加一价盐的步骤j")允许在合适条件下避免步骤k")中所述正痘病毒吸附到阴离子交换吸附剂(即避免超过10%的正痘病毒吸附到阴离子交换吸附剂)。因此在步骤k")只有核酸(例如DNA)将吸附到阴离子交换吸附剂上。一价盐包括但不限于NaCl和KCl。步骤j")使用的优选一价盐是NaCl。根据本发明，步骤j")的一价盐浓度范围是200mM到300mM，优选是250mM或300mM。根据本发明，步骤j ")在7. O到9. O之间的pH下进行，优选在7. 5到8. 5、更优选在8. O的pH下进行。在合适条件下将步骤j")获得的混合物与阴离子交换吸附剂接触以允许捕获核酸的步骤k")是指先前描述的在合适条件下将步骤f)获得的混合物与阴离子交换吸附剂接触以允许捕获核酸的步骤g)。在合适条件下用包括一价盐的溶液清洗阴离子交换吸附剂以回收流过物中剩余的正痘病毒的步骤I")是指先前描述的在合适条件下用包括一价盐的溶液清洗阴离子交换吸附剂以回收流过物中剩余的正痘病毒的步骤i)。将步骤I")获得的流过物浓缩的步骤m")允许清除所述流过物级分中存在的蛋白。在本发明优选的实施方案中，浓缩步骤m")通过微量过滤进行(如先前步骤j)中描述的)。在本发明另一个优选的实施方案中，浓缩步骤m")通过超滤进行(如先前步骤j)中描述的)。将步骤m")中获得的包括正痘病毒的级分进行渗滤的步骤η")是指先前描述的将步骤j)中获得的包括正痘病毒的级分进行渗滤的步骤k)。本发明的当前方法C可以进一步包括I.凝胶过滤步骤(即步骤O"));和
2.渗滤步骤(即步骤P"))。凝胶过滤步骤O ")是指凝胶过滤步骤I)。渗滤步骤P ")是指渗滤步骤m)。根据本发明，先前描述的方法C的从步骤f")到步骤P")的每一步(优选从步骤k")到步骤P")的每一步)之前可以是在一或多种稳定剂存在下温育包括正痘病毒的样品的步骤。如本文所用，“稳定剂”是指允许保存正痘病毒的物质。稳定剂包括但不限于糖(例如蔗糖，海藻糖，山梨糖，松三糖，山梨醇，水苏糖，棉子糖，果糖，甘露糖，麦芽糖，乳糖，阿拉伯糖，木糖，核糖，鼠李糖，半乳糖，葡萄糖，甘露醇，木糖醇，赤藓醇，苏糖醇，山梨醇，甘油)，氨基酸(例如甘氨酸；亮氨酸；赖氨酸；精氨酸；天冬氨酸；缬氨酸；谷氨酸)，去污剂(例如 Triton X-100 ;Tween,如例如 Tween20, Tween 80 或 Tween 85)和盐(例如NaCl ;KC1)。根据本发明优选的实施方案，用于该温育步骤的稳定剂是糖，更优选是蔗糖。根据本发明，用于该温育步骤的蔗糖浓度范围是25g/L到100g/L，优选是50g/L。根据本发明，稳定剂可以包括在由药学上可接受的溶液组成的溶液中，包括IOOmM Tris-HCl，蔗糖5% (w/v)，IOmM 谷氨酸钠和 50mM NaCl, pH 8. 0，具有生理学渗透性(290m0sm/kg)(即 S08缓冲液)。根据本发明，稳定剂可以包括在由药学上可接受的溶液组成的溶液中，包括例如Tris缓冲液，三乙醇胺缓冲液或磷酸盐缓冲液。根据本发明，在稳定剂存在下的该温育步骤是在以下pH进行的7. O到9. O之间，优选7. 5到8. 5之间，更优选为8. O的pH。根据本发明，在稳定剂存在下该温育步骤的持续时间是I小时到20小时之间，更优选为18小时。根据本发明，在稳定剂存在下的该温育步骤是在2°C到8°C之间的温度下进行，优选在3°C到7°C之间的温度、更优选在4°C到6°C之间的温度和甚至更优选在5°C的温度下进行。在稳定剂存在下的该温育步骤优选在5°C的温度、存在50g/L蔗糖的条件下进行18小时。根据如先前描述的本发明方法C的另一个实施方案，在从培养上清液和/或包装细胞回收正痘病毒的步骤e")之后进行净化步骤(步骤h"))。根据本发明，可以通过本领域技术人员熟知的冷冻来保存本发明方法每一步骤后获得的包括正痘病毒的样品。根据本发明，本发明的方法是在以下pH进行的7. O到9. O之间，优选7. 5到8. 5之间，更优选为8. O的pH。 在本发明优选的实施方案中，正痘病毒是痘苗病毒(VV)。根据本发明优选的VV是例如专利申请PCT/EP2008/009720 (W02009/065546,描述包括缺陷型I4L和/或F4L基因的VV)或 PCT/EP2008/009721 (W02009/065547,描述包括缺陷型 F2L 基因的 VV)所述的 W。在本发明另一个优选的实施方案中，正痘病毒是修饰的安卡拉痘苗病毒(MVA) ο 本发明优选的 MVA 是之前保藏于 Collection Nationale de Cultures deMicroorganismes(CNCM)保藏号为 N ° 1-721 的 MVA，MVA 575 (ECACC V00120707)和MVA-BN(ECACC V00083008)。术语“重组正痘病毒”是指包括插入其基因组的外源序列的正痘病毒。如本文所用，外源序列是指不是天然存在于亲代正痘病毒中的核酸。在一个实施方案中，外源序列编码具有直接或间接细胞毒功能的分子。“直接或间接”细胞毒，我们是指外源序列编码的分子本身是毒性的(例如蓖麻毒蛋白，肿瘤坏死因子(TNF)，白介素-2(IL2)，干扰素-ga_a (IFN Y )，核糖核酸酶，脱氧核糖核酸酶，假单胞菌外毒素A)或它可以被代谢形成毒性产物，或它可以作用于其它东西以形成毒性产物。Lamb等(Eur. J. Biochem.，1985，148,265-270)公开了蓖麻毒蛋白cDNA的序列。在本发明优选的实施方案中，外源序列是自杀基因。自杀基因编码能够将相对无毒前体药物转化为毒性药物的蛋白。例如，胞嘧啶脱氨酶将5-氟胞嘧啶(5-FC)转化为5-氟尿嘧啶(5-FU) (Mullen et al (1922) PNAS 89，33);单纯疱疹酶胸苷激酶使细胞对抗病毒剂更昔洛韦(GCV)或阿昔洛韦的处理敏感(Moolten(1986)Cancer Res. 46,5276 ；Ezzedine et al (1991)New Biol 3,608)。可以使用任意生物体(例如大肠杆菌(E. coli)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))的胞卩密唳脱氨酶。因此,在本发明优选的实施方案中，自杀基因编码具有胞嘧啶脱氨酶活性的蛋白，更优选是FCUl蛋白或FCU1-8蛋白，其被援引加入本文的专利申请WO 99/54481，W005/07857, PCT/EP2008/009720和PCT/EP2008/009721 涵盖。就这点来说，根据本发明方法产生的优选重组正痘病毒是
■ MVA-FCUl (参见 TO 99/54481)，也称为 TG4023 ；■ MVA-FCU1-8 (参见 W 05/07857);和■ vv-rcui，其中所述VV更具体包括缺陷型I4L和/或F4L基因，以及缺陷型J2R基因(参见 PCT/EP2008/009720/W02009/065546 和 PCT/EP2008/009721/W02009/065547)。前体药物/酶组合的其它实例包括Bagshawe等公开的那些(W088/07378)，即各种烧化剂和假单胞菌属CPG2酶，以及Epenetos&Rowlinson-Busza公开的那些(W091/11201)，即生氰前体药物(例如扁桃苷)和植物来源的beta-葡糖苷酶。可用于本发明这个实施方案的酶包括但不限于用于将含磷酸盐前体药物转化为游离药物的碱性磷酸酶；用于将含硫酸盐前体药物转化为游离药物的芳基硫酸酯酶；蛋白酶，如沙雷氏菌蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶，羧肽酶和组织蛋白酶(如组织蛋白酶B和L)，它们可用于将含肽前体药物转化为游离药物；D-丙氨酰羧肽酶，用于转化含D-氨基酸取代基的前体药物；碳水化合物切割酶，如beta-半乳糖苷酶和神经氨酸酶，用于将糖基化前体药物转化为游离药物；beta_内酰胺酶，用于将beta-内酰胺衍生的药物转化为游离药物；以及青霉素酰胺酶，如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶，用于分别将在它们的胺氮用苯氧乙酰基或苯乙酰基衍生的药物转化为游离药物。可选地，具有酶活性的抗体(本领域还称为抗体酶)可用于将本发明的前体药物转化为游离活性药物(Massey R.等，Nature, 1987, 328,457-458)。类似地，前体药物包括但不限于上文所列的前体药物，例如含磷酸盐前体药物，含硫代磷酸盐前体药物，含硫酸盐前体药物，含肽前体药物，D-氨基酸修饰前体药物，糖基化前体药物，含beta-内酰胺前体药物，任选地含取代的苯氧乙酰胺的前体药物或任选地含取代的苯乙酰胺的前体药物，5-氟胞嘧啶和其它可以被转化的5-氟尿苷前体药物。可以衍生为用于本发明的前体药物形式的细胞毒药物实例包括但不限于鬼臼亚乙苷，表鬼臼毒噻吩糖苷，阿霉素，柔红霉素，洋红霉素，氨基蝶呤，更生霉素，丝裂霉素，顺钼和顺钼类似物，博来霉素，埃斯波霉素(参见例如US 4，675，187)，5-氟尿嘧啶，苯丙氨酸氮芥和其它相关氮芥。在进一步的实施方案中，外源基因编码能够切割靶RNA或DNA的核酶。待切割的靶RNA或DNA可以是对细胞功能必不可少的RNA或DNA，其切割导致细胞死亡，或待切割的RNA或DNA可以是编码不想要的蛋白(例如癌基因产物)的RNA或DNA，该RNA或DNA的切割可以防止细胞变为癌性的。在仍然进一步的实施方案中，外源基因编码反义RNA。“反义RNA”表示与编码蛋白的mRNA分子杂交并干扰其表达的RNA分子，或与细胞内另一 RNA分子如前mRNA或tRNA或rRNA杂交的RNA分子，或与基因杂交并干扰其表达的RNA分子。在本发明另一个实施方案中，外源序列取代靶细胞中缺陷型基因的功能。存在数千种哺乳动物(包括人)的遗传疾病(inherited genetic diseases),其由缺陷型基因造成。这类遗传疾病的实例包括囊性纤维化，其中已知存在CFTR基因突变；Duchenne肌营养不良，其中已知存在肌养蛋白基因突变；镰刀形细胞 病，其中已知存在HbA基因突变。许多类型的癌症由缺陷型基因造成，尤其是原癌基因以及经历突变的肿瘤抑制基因。原癌基因的实例是ras，src, bcl等等；肿瘤抑制基因的实例是p53和Rb。在本发明进一步的实施方案中，外源序列编码肿瘤相关抗原(TAA)。TAA是指在肿瘤细胞中检测出频率或密度比相同组织类型的非肿瘤细胞更高的分子。TAA的实例包括但不限于 CEA、MARTI、MAGEl、MAGE3、GP-100、MUCl (参见 WO 92/07000，WO 95/09241 和Rochlitz 等 J Gene Med. 2003Aug ；5(8) :690_9，援引加入本文)、MUC2、点突变的 ras 癌基因、正常或点突变的 P53、过表达的 p53、CA-125、PSA、C_erb/B2、BRCA I、BRCA II、PSMA、酪氨酸酶、TRPl、TRP2、NY-ES0-1、TAG72、KSA、HER-2/neu、bcr-abl、pax3_fkhr、ews-fli-1、生存素(surviving)和LRP。根据更优选的实施方案，TAA是MUCl。在本发明另一个实施方案中，外源基因编码抗原。如本文所用，“抗原”是指可以被抗体结合的配体；抗原自身无需是免疫原性的。优选抗原来源于病毒如例如HIV-I (如gp120或gp 160)、猫免疫缺陷病毒、人或动物疱疹病毒中的任何一种，如gD或其衍生物或立即早期蛋白如ICP27，来自HSVl或HSV2，巨细胞病毒(如gB或其衍生物)，水痘带状疱疹病毒(如gpl、II或III)或来自肝炎病毒如乙肝病毒(HBV)例如乙肝表面抗原或其衍生物，甲肝病毒(HAV)，丙肝病毒(HCV ;参见WO 04/111082 ;优选来自基因型Ib菌株ja的非结构HCV蛋白)，和戊肝病毒(HEV)，或来自其它病毒病原体，如呼吸道合胞病毒，人乳头瘤病毒(HPV ;参见 TO 90/10459，WO 95/09241，WO 98/04705, WO 99/03885W0 07/121894 和 WO07/121894 ;来自HPV16株的E6和E7蛋白是优选的；还参见Liu等Proc Natl Acad Sci U
SA. 20040ct 5 ；101Suppl 2:14567-71)或流感病毒，或衍生自细菌病原体如沙门氏菌、奈瑟氏菌、疏螺旋体(例如OspA或OspB或其衍生物)，或衣原体，或博德特氏菌例如P. 69,PT和FHA，或衍生自寄生虫如疟原虫或弓形虫。根据更优选的实施方案，抗原选自HCV或HPV。就这点来说，根据本发明方法产生的优选重组正痘病毒是MVA-HCV(参见WO04/111082)，也称为 TG4040。重组正痘病毒可以包括一种以上的外源序列，而每种外源序列可以编码一种以上的分子。例如，将编码例如TAA(如前所述)或抗原(如前所述)的外源序列与编码细胞因子(例如白介素(IL，例如IL2);肿瘤坏死因子(TNF);干扰素-(IFN);集落刺激因子(CSF))的外源序列连接在相同重组正痘病毒中是有用的。就这点来说，根据本发明方法产生的优选重组正痘病毒是■ MVA-[MUC1-IL2](参见 WO 92/07000 和 WO 95/09241)，也称为 TG4010 ;和■ MVA-[HPV-IL2](参见 WO 90/10459, WO 95/09241, WO 98/04705, WO 99/03885，WO 07/121894 和 WO 07/121894)，也称为 TG4001。
有利地,重组正痘病毒进一步包括表达外源序列必需的元件。表达必需的元件包括下组元件允许将核苷酸序列转录为RNA和将mRNA翻译为多肽的元件，特别是在被本发明重组正痘病毒感染的细胞中有效的启动子序列和/或调节序列，和任选存在的允许所述多肽在细胞表面分泌或表达的序列。这些元件可以是诱导型或组成型的。当然，启动子适合于挑选的重组正痘病毒和宿主细胞。举例来说，提及的有痘苗病毒启动子p7. 5KpH5R、pKlL、p28、pll或所述启动子的组合。文献提供了大量有关这类启动子序列的信息。此外，必需元件可以包括改良外源序列表达或其在宿主细胞中维持的额外元件。特别提及的可以是内含子序列(W0 94/29471)，分泌信号序列，核定位序列，用于IRES型翻译重启动的内部位点，用于转录终止的polyA序列。本发明还涉及通过本发明方法获得的纯化的野生型、减毒和/或重组正痘病毒用做药物组合物，优选用做疫苗。如本文所用，“药物组合物”是指包括药学上可接受载体的组合物。所述药学上可接受的载体优选是等渗、低渗或弱高渗的，并具有相对低的离子强度，如例如蔗糖溶液。此夕卜，这类载体可以包含任何溶剂，或水性或部分水性的液体如无热原无菌水。此外，调节并 缓冲药物组合物的PH以便满足体内使用的需要。药物组合物还可以包含药学上可接受的稀释剂，佐剂或赋形剂，以及增溶剂，稳定剂和防腐剂。为了注射施用，水性、非水性或等渗溶液制剂是优选的。它可以采用液体或干燥(粉末，冻干物等等)形式以单剂量或多剂量形式提供，所述干燥形式可以在使用时用合适的稀释剂重建。本发明还涉及通过本发明方法获得的纯化的野生型、减毒和/或重组正痘病毒用于治疗和/或预防癌症，传染病和/或自身免疫病。如本文所用，“癌症”是指但不限于肺癌(例如小细胞肺癌和非小细胞肺)，支气管癌，食管癌，咽癌，头颈癌(例如喉癌，唇癌，鼻腔和鼻旁窦癌以及咽喉癌)，口腔癌(例如舌癌)，胃癌(gastric cancer)(例如胃癌(stomach cancer)),肠癌，胃肠癌，结肠癌,直肠癌(rectal cancer),结肠直肠癌,直肠癌(anal cancer),肝癌,胰腺癌,尿道癌,膀胱癌，甲状腺癌，肾癌，癌(carcinoma)，腺癌，皮肤癌(例如黑色素瘤)，眼癌(例如成视网膜细胞瘤)，脑癌(例如神经胶质瘤，髓母细胞瘤和脑星形细胞瘤)，中枢神经系统癌，淋巴瘤(例如皮肤B细胞淋巴瘤，Burkitt’ s淋巴瘤，何杰金氏综合征和非霍奇金氏淋巴瘤)，骨癌，白血病，乳腺癌，生殖道癌，宫颈癌(例如宫颈上皮瘤)，子宫癌(例如子宫内膜癌)，卵巢癌，阴道癌，外阴癌，前列腺癌，睾丸癌。“癌症”还指病毒诱导的肿瘤，包括但不限于乳头瘤病毒诱导的癌，疱疹病毒诱导的肿瘤，EBV诱导的B细胞淋巴瘤，乙肝诱导的肿瘤，HTLV-I-诱导的淋巴瘤和HTLV-2-诱导的淋巴瘤。如本文所用，“传染病”是指由传染性生物体引起的任何疾病。传染性生物体包括但不限于病毒(例如单链RNA病毒，单链DNA病毒，人类免疫缺陷病毒(HIV),甲肝、乙肝和丙肝病毒，单纯疱疹病毒(HSV)，巨细胞病毒(CMV)，呼吸道合胞病毒(RSV)，EB病毒(EBV)或人乳头瘤病毒(HPV))，寄生虫(例如原生动物和多细胞动物病原体，如疟原虫属，利什曼虫属，血吸虫属或锥虫属)，细菌(例如分枝杆菌(具体来说是结核分枝杆菌(M. tuberculosis)),沙门氏菌,链球菌,大肠杆菌或葡萄球菌)，真菌(例如假丝酵母属或曲霉属)，卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii),和朊蛋白。如本文所用，“自身免疫病”是指两种常规类型‘全身性自身免疫病’(即破坏众多器官或组织的病症)和‘局部自身免疫病’(即只破坏单个器官或组织的病症)。但是，
‘局部自身免疫病’的影响可以通过间接影响其它机体器官和系统而是全身性的。‘全身性自身免疫病’包括但不限于类风湿性关节炎，其可影响关节，和可能影响肺和皮肤；狼疮，包括全身性红斑狼疮(SLE)，其可影响皮肤，关节，肾，心脏，脑，红细胞以及其它组织和器官；硬皮病，其可影响皮肤，肠，和肺；Sjogren’ s综合征，其可影响唾液腺，泪腺，和关节；Goodpasture' s综合征,其可影响肺和肾；Wegener' s肉芽肿,其可影响窦，肺,和肾；风湿性多肌痛，其可影响大的肌群，以及颞动脉炎/巨细胞性动脉炎，其可影响头部和颈部的动脉。‘局部自身免疫病’包括但不限于I型糖尿病，其影响胰岛！Hashimoto' s甲状腺炎和Grave’ s病，其影响甲状腺；乳糜湾，Crohn’ s病，和溃疡性结肠炎，其影响胃肠道；多发性硬化(MS)和Guillain-Barre综合征,其影响中枢神经系统；Addison’ s病,其影响肾上腺；原发性胆管纤维硬化，硬化性胆管炎，和自身免疫性肝炎，其影响肝脏；和Raynaud’s现象，其可影响手指，脚趾，鼻，耳。本发明还涉及ー种药物组合物，优选疫苗，包括通过本发明方法获得的纯化的野 生型、减毒和/或重组正痘病毒。根据本发明，所述药物组合物g在治疗和/或预防癌症，传染病和/或自身免疫病。本发明还涉及通过本发明方法获得的纯化的野生型、减毒和/或重组正痘病毒在制备用于治疗和/或预防癌症、传染病和/或自身免疫病的药物组合物、优选疫苗中的用途。可以按照常规来制备药物组合物和特别是疫苗以用于通过局部、肠胃外或消化途径施用。施用途径可以是例如胃内，皮下，心内，肌内，静脉内，腹膜内，肿瘤内，鼻内，肺内或气管内途径。对于后3种实施方案，通过气雾剂或滴注施用是有利的。可以采用单次剂量或在某ー时间间隔后重复一次或数次来完成施用。施用的合适途径和剂量作为例如个体、待治 疗疾病或待转移的感兴趣基因的各种參数的函数而变化。根据第一种可能性，可以直接在体内施用药物组合物，特别是疫苗(例如通过静脉内注射施用入可及的肿瘤或在其周围施用，皮下用于治疗性或预防性接种)。还可以采用离体(ex vivo)方法，其包括从患者收集细胞(骨髄干细胞，外周血淋巴细胞，肌细胞等等)，在体外根据现有技术转染或感染它们，并将它们重新施用给患者。此外还可以预见，在合适的和不离开本发明范围的情况下，可以通过不同途径同时或连续施用包含在药物组合物、特别是疫苗中的各种组分。本发明还涉及获自属于鸭科的禽类细胞的永生化禽类细胞系用于根据本发明的方法产生野生型、减毒和/或重组正痘病毒的用途。在鸭科中，属于栖鸭属或鸭属的细胞是尤其优选的。甚至更优选地，永生化禽类细胞系属于番鸭或绿头鸭种。根据本发明优选的实施方案，番鸭永生化禽类细胞系是包括被专利申请WO2007/077256涵盖的编码端粒酶逆转录酶(TERT)的核酸序列的番鸭永生化禽类细胞系。尤其优选下列永生化禽类细胞系-以登录号08060502保藏于欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)(參见图2，3和4)的T3-17490或其衍生物；-以登录号08060501保藏于欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)(參见图5，6和7)的T6-17490或其衍生物；就这点来说，本发明还涉及■包括编码端粒酶逆转录酶(TERT)的核酸序列的番鸭永生化禽类细胞系用于根据本发明的方法产生野生型、减毒和/或重组正痘病毒的用途。■以登录号08060502保藏于欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)的T3-17490番鸭永生化禽类细胞系(描述于实施例2)或其衍生物用于根据本发明的方法产生野生型、减毒和/或重组正痘病毒的用途。■以登录号08060501保藏于欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)的T6-17490番鸭永生化禽类细胞系(描述于实施例3)或其衍生物用于根据本发明的方法产生野生型、减毒和/或重组正痘病毒的用途。根据本发明另ー个优选的实施方案，番鸭永生化禽类细胞系是包括ElA核酸序列和被专利申请WO 2009/004016涵盖的编码端粒酶逆转录酶(TERT)的核酸序列的番鸭永生化禽类细胞系。
就这点来说，本发明还涉及包括ElA核酸序列和编码端粒酶逆转录酶(TERT)的核酸序列的番鸭永生化禽类细胞系用于根据本发明的方法产生野生型、减毒和/或重组正痘病毒的用途。如整个申请所用，保藏的永生化禽类细胞系的“衍生物”是指包括编码“感兴趣物质”的核酸序列的永生化禽类细胞系。如本文所用，“感兴趣物质”可以包括但不限于药学上有活性的蛋白例如生长因子，生长调节物，抗体，抗原，它们可用于免疫或接种等等的衍生物，白介素，胰岛素，红细胞生成素，G-CSF, GM-CSF, hPG-CSF, M-CSF，干扰素(干扰素-alpha,干扰素-beta,干扰素-gamma),凝血因子(例如因子VIII,因子IX ;tPA)或其组
ム
ロ ο附图
简述图I :显示不同Benzonase 浓度(即IOmM ；50mM)对Benzonase 核酸内切酶活
性(温度 25°C ；Mg2+2mM ；pH 8)的影响。图2 :显示T3-17490(ECACC 08060502)番鸭永生化禽类细胞系(第39代)的光
学显微镜图像。图3 :显示T3_17490(ECACC 08060502)番鸭永生化禽类细胞系生长曲线(第7代到第75代)。图4 :显示T2-17490 (ECACC 08060502)番鸭永生化禽类细胞系群体倍增时间进展(第7代到第75代)。图5 :显示T6-17490 (ECACC 08060501)(第45代)的光学显微镜图像。图6 :显示T6_17490(ECACC 08060501)番鸭永生化禽类细胞系生长曲线(从第15代到第51代)。图7 T6-17490(ECACC 08060501)番鸭永生化禽类细胞系群体倍增时间进展(从第16代到第51代)。为了说明本发明，提供下列实施例。所述实施例不意图以任何方式限制本发明的范围。
实施例实施例I :方法A.步骤a)制备包装细胞培养物。
将66只SPF卵在2%甲醛溶液中温育60秒。在用70 %こ醇清洗后，打开卵，提取胚胎并解剖。然后通过分散酶(Ul/ml)和triple select (Ul/ml)将所获组织在36. 5°C消化120分钟。将混合物过滤以除去未消化的组织，并通过离心(2300rpm，15分钟)收集CEF。将 CEF 在 55L VP-SFM(Invitrogen)中于 36. 5°C温育 2 天。步骤b):用IH痘病毒感染包装细胞培养物。然后弃去细胞培养基，将MVA-[MUC1-IL2]也称为TG4010 (O. 05M0I) (MVA之前保藏于 Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM),保藏号为N。1-721)添加于 55L Basal Medium Eagle (Invitrogen)。步骤c):培养感染的包装细胞肓至产生子代IH痘病毒。然后将感染的CEF在36. 5°C温育3天。 步骤d):在一或多种核酸_存在下温育。然后在下列条件下，在存在Benzonase ου/ml 或 50U/ml (Merck !ReferenceI. 01653. 0001)时温育包括MVA子代的感染的CEF -在25°C的温度下搅拌2小吋；-Mg2+2mM ；-8. O 的 pH。步骤e):从培养上清液和/或包装细胞回收IH痘病毒。收集细胞培养基和CEF。然后利用Silverson L4R高速勻衆器(Silverson)将混合物在 llml/min 匀浆 15 分钟，或利用 SONITUBE 36kHz 型 SM35/3WU (Heraeus PSP)将混合物在1500ml/min匀浆75分钟。然后在25°C和pH 8. O搅拌条件下将获得的混合物温育2小吋。步骤f):在合适条件下向步骤e)回收的正痘病毒中添加一价盐以抑制核酸酶活性并避免步骤K)中所述正痘病毒吸附到阴离子交換吸附剂。然后在存在NaCl 250mM和pH 8. O的条件下温育获得的混合物。步骤0:在合适条件下将步骤f)获得的混合物与阴离子交換吸附剂接触以捕获核酸。然后将获得的混合物添加到UNOsphere Q (BioRad)。首先用无菌水清洗UNOsphere Q(BioRad)珠形式基质，然后在Tris IOmM缓冲液(pH 8.0)中高压消毒，随后用NaCl 250mM或300mM缓冲液(pH 8. O)平衡。然后使用Watson-Marlow 螺动泵(Reference 323ES/4D, 520S ；ffatson-Marlow)将UNOsphere Q(BioRad)珠形式基质添加到步骤f)获得的包含在Flexboy 袋(Reference FFB 101961 ；Sartorius Stedim biotech)的混合物中。在室温(20°c到22°C )缓慢搅拌条件下将UNOsphere Q(BioRad)珠形式基质与步骤f)获得的混合物保持接触I小吋。步骤h):在合适条件下将步骤0获得的混合物净化以去除细胞碎片。然后将所获混合物在与Sartopure PP2 5 μ m(Sartorius) 连接的Sartopure PP2 8 μ m(Sartorius)上以IL/分钟流速通过深度过滤净化。步骤i)在合适条件下用包括一价盐的溶液清洗阴离子交換吸附剂以回收流过物中剩余的正痘病毒。
通过使用Watson-Marlow螺动泵(Reference 323ES/4D, 520S ；ffatson-Marlow)利用溶于 S08 缓冲液(IOmM Tris-HCL ;蔗糖 5% (w/v) ;10mM 谷氨酸钠；50mM NaCl ；pH 8.0，具有生理学渗透性(290m0sm/kg))的 NaCl 250mM 或 300mM 来清洗(v/v) UNOsphere Q (BioRad)。然后在存在蔗糖50g/L终浓度的条件下在5°C将步骤h)获得的流过物和步骤i)获得的流过物温育过夜(即18小时)。步骤i):浓缩步骤h)获得的流过物和步骤i)获得的流过物。然后通过O. I μ m Prostak Microfiltration Module (Reference PSVVAG021,Millipore)将步骤h)获得的流过物和步骤i)获得的流过物浓缩18倍。步骤k):将步骤i)获得的包括IH痘病毒的级分滲滤。
然后在相同组件即O. I μ m Prostak Microfiltration Module (ReferencePSVVAG021,Millipore)上将渗余物渗滤。使用Quant_iT Picogreen dsDNA分析试剂盒(产品目录号P7589, Invitrogen)进行DNA的定量。结果没有检测到残余DNA。实施例2 T3-17490永牛化番鸭细朐系(保藏于ECACC,登录号08060502)用于根
据本发明方法产生ιΗ痘病毒。Τ3-17490细胞(第39代)具有同质成纤维细胞样形态(图2)。静止单层直至100%融合都是稳定的并受到接触抑制。经检测细胞对干支原体污染以及微生物污染都是阴性。Τ3-17490细胞系生长曲线(第7代到第75代)(图3)显示从第19代到第75代的连续指数生长期。聚焦于群体倍增时间(TOT)的进展，观察到逐渐稳定和減少，具体来说注意到在最近10代期间在48小时标记下TOT是稳定的(图4)。通过累积2个指数生长期计算群体倍増的对应数目(群体倍増水平，PDL):在75次传代期间细胞经历至少147次群体倍増(PD)。原代细胞在进入老化前经历的群体倍増数目是组织和种属依赖性的。通常认为上限位于50到60Η)之间。因此T3-17490细胞远远超过Hayflick限制，所以被称作永生化细胞系。N. B.■群体倍増水平(TOL)是指细胞代数(生物量2倍増加)。PDL计算PDL = Ln (最终细胞数/初始细胞数)/Ln (2)；■群体倍增时间(I3DT)，也称作传代时间，是ー个群体倍增所需时间。PDT计算PDT = Δ t*Ln (2) /Ln (最终细胞数/初始细胞数)。实施例3 T6-17490永牛化番鸭细胞系(保藏于ECACC,登录号08060501)用于根
据本发明方法产生正痘病毒。Τ6-17490细胞(第45代)具有同质成纤维细胞样形态(图5)。静止单层直至100%融合都是稳定的并受到接触抑制。经检测细胞对干支原体污染以及微生物污染都是阴性。Τ6-17490细胞系生长曲线(第15代到第51代)(图6)显示从第19代开始的连续指数生长期。在此期间测量的群体倍增时间(PDT)逐渐降低。平均PDT从94小时(第20到35代)变为52小时(第36到51代)(图7)。根据第51代计算的群体倍増(I3DL)数是至少71次群体倍増。因此Τ6-17490细胞远远超过Hayflick限制，所以被称作永生化细胞糸ON. B.■群体倍増水平(TOL)是指细胞代数(生物量2倍増加)。PDL计算PDL = Ln (最终细胞数/初始细胞数)/Ln (2)；■群体倍增时间(TOT)，也称作传代时间，是ー个群体倍增所需时间。PDT计算PDT = Δ t*Ln (2) /Ln (最终细胞数/初始细胞数)。实施例4 :方法B。步骤a'_):制备包装细胞士音养物。将66只SPF卵在2%甲醛溶液中温育60秒。在用70 %こ醇清洗后，打开卵，提 取胚胎并解剖。然后通过分散酶(Ul/ml)和triple select (Ul/ml)将所获组织在36. 5°C消化120分钟。将混合物过滤以除去未消化的组织，并通过离心(2300rpm，15分钟)收集CEF。将 CEF 在 55L VP-SFM(Invitrogen)中于 36. 5°C温育 2 天。步骤b'):用IH痘病毒感染包装细胞培养物。然后弃去细胞培养基，将MVA-[MUC1-IL2]也称为TG4010(0. 05M0I) (MVA之前保藏于Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM),保藏号为 N。1-721)添カロ于 55L Basal Medium Eagle (Invitrogen) 步骤ど)培养感染的包装细胞肓至产生子代lH痘病毒。然后将感染的CEF在36. 5°C温育3天。步骤d'):在一或多种核酸_存在下温育。然后在下列条件下，在存在Benzonase 10U/ml (Merck ;Referencel. 01653. 0001)时温育包括MVA子代的感染的CEF -在25°C的温度下搅拌2小时；-Mg2+2mM ；-8. O 的 pH。步骤e'):从培养上清液和/或包装细胞回收正痘病毒。收集细胞培养基和CEF。然后利用Silverson L4R高速匀浆器(Silverson)将混合物在 llml/min 匀浆 15 分钟，或利用 SONITUBE 36kHz 型 SM35/3WU(Heraeus PSP)将混合物在1500ml/min匀浆75分钟。步骤f'):在一或多种能够抑制核酸酶活件的物质存在下温育步骤e')回收的IH痘病毒。然后在存在NaCl IOOmM和EDTA IOmM, pH 8. O的条件下温育获得的混合物。步骤W):在合适条件下将步骤f')获得的混合物与阴离子交換吸附剂接触以捕获所述正痘病毒和核酸。然后将获得的混合物添加到BioSepra Q hyperZ (Pall Corporation)。首先用无菌水清洗BioSepra Q hyperZ (Pall Corporation)珠形式基质,然后用NaOH O. 5N消毒，Tris IOmM缓冲液(pH 8.0)清洗，然后用Tris IOmM NaCllOmM蔗糖5%缓冲液(pH8. O)进行平衡。然后使用Watson-Marlow 螺动泵(Reference 323ES/4D, 520S ；ffatson-Marlow)将 BioSepra Q hyperZ (Pall Corporation)珠形式基质添加到包含于 Flexboy 袋(Reference FFB 101961 ；Sartorius Stedim biotech)的步骤 f')获得的混合物中。在室温(20 V到22 V )缓慢搅拌条件下将BioSepra Q hyperZ(PallCorporation)珠形式基质与步骤f')获得的混合物保持接触I小时。步骤h'):在合适条件下将步骤V )获得的混合物净化以去除细胞碎片。然后在与Sartopure PP25 Um(Sartorius)连接的 Sartopure PP28 u m(Sartorius)上以IL/分钟流速通过深度过滤净化所获混合物。步骤i'):用包括一价盐.的溶液洗脱IH痘病毒。通过使用Watson-Marlow 螺动泵(Reference 323ES/4D, 520S ；ffatson-Marlow), 利用 S08 缓冲液(IOmM Tris-HCL;蔗糖 5% (w/v) ;10mM 谷氨酸钠；50mM NaCl ；pH 8.0，具有生理学渗透性(290m0sm/kg))中增加的NaCl浓度梯度(300mM ；400mM ；500mM)来洗脱正
痘病毒。步骤i'):浓缩步骤i')获得的混合物。然后通过0. I U m Prostak Microfiltration Module (Reference PSVVAG021,Millipore)将步骤i')获得的洗脱物浓缩18倍。步骤k'):将步骤i')获得的包括IH痘病毒的级分滲滤。然后将渗余物在相同组件即0. I U m Prostak Microfiltration Module(Reference PSVVAG021, Millipore)上渗滤。使用Quant-iT Picogreen dsDNA分析试剂盒(产品目录号P7589, Invitrogen)进行DNA的定量。结果没有检测到残余DNA。上述说明书中引用的所有文献(专利，专利申请，出版物)在此援引加入本文。本发明的各种改变和变化对本领域技术人员来说是显而易见的，并不脱离本发明的范围和精神。尽管本发明针对特别优选的实施方案进行了描述，但应理解所请求保护的本发明不应过度限于这类特定的实施方案。实际上，对本领域技术人员显而易见的用于实施本发明的所述方式的各种改变意图在下列权利要求的保护范围内。
权利要求
1.一种产生和纯化野生型、减毒和/或重组正痘病毒的方法，包括下列步骤 a)制备包装细胞培养物； b)用正痘病毒感染包装细胞培养物； c)培养感染的包装细胞直至产生子代正痘病毒； d)在一或多种核酸酶存在下温育； e)从培养上清液和/或包装细胞回收正痘病毒； f)在合适条件下将一价盐添加到步骤e)回收的正痘病毒中以抑制核酸酶活性并避免步骤g)中所述正痘病毒吸附到阴离子交换吸附剂上； g)在合适条件下将步骤f)获得的混合物与阴离子交换吸附剂接触以捕获核酸； h)在合适条件下将步骤g)获得的混合物净化以去除细胞碎片； i)在合适条件下用包括一价盐的溶液清洗阴离子交换吸附剂以回收流过物中剩余的正痘病毒; j)浓缩步骤h)获得的流过物和步骤i)获得的流过物； k)将步骤j)获得的包括正痘病毒的级分渗滤。
2.一种产生和纯化野生型、减毒和/或重组正痘病毒的方法，包括下列步骤)制备包装细胞培养物； )用正痘病毒感染包装细胞培养物； Ci )培养感染的包装细胞直至产生子代正痘病毒； cT )在一或多种核酸酶存在下温育； e,)从培养上清液和/或包装细胞回收正痘病毒； f,)在存在以下物质的条件下温育步骤e,)回收的正痘病毒 1.一或多种能够抑制核酸酶活性的物质，和任选存在的
2.—或多种稳定剂 g,)在合适条件下将步骤f,)获得的混合物与阴离子交换吸附剂接触以捕获所述正痘病毒和核酸； h')在合适条件下将步骤g')获得的混合物净化以去除细胞碎片； )用包括一价盐的溶液洗脱正痘病毒；)浓缩步骤P )获得的混合物； k')将步骤j')获得的包括正痘病毒的级分进行渗滤。
3.权利要求I或2的方法，其中所述包装细胞是永生化细胞系，并且优选是永生化禽类细胞系。
4.权利要求3的方法，其中所述永生化禽类细胞系获自属于鸭科的禽类细胞，优选获自番鸭种。
5.权利要求4的方法，其中所述永生化禽类细胞系包括编码端粒酶逆转录酶(TERT)的核酸序列。
6.权利要求5的方法，其中所述永生化禽类细胞系是以登录号08060502保藏于欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)的T3-17490或其衍生物。
7.权利要求5的方法，其中所述永生化禽类细胞系是以登录号08060501保藏于欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)的T6-17490或其衍生物。
8.权利要求4的方法，其中所述永生化禽类细胞系包括ElA核酸序列和编码端粒酶逆转录酶(TERT)的核酸序列。
9.权利要求I或2的方法，其中所述包装细胞是原代或继代禽类细胞，优选是鸡胚成纤维细胞(CEF)。
10.权利要求I或2的方法，其中pH在7.O到9. O之间，优选在7. 5到8. 5之间，和更优选是8. O。
11.权利要求I或2的方法,其中所述核酸酶是核酸内切酶,优选是Benzonase 。
12.权利要求I或2的方法，其中核酸酶的浓度范围是5U/ml到100U/ml，优选范围是 5U/ml 到 50U/ml，和更优选是 10U/ml。
13.权利要求I或2的方法，其中回收正痘病毒的步骤之前是 1)破坏包装细胞膜的步骤，优选通过使用高速匀浆器或通过超声处理；和 2)将步骤I)获得的混合物温育至少I小时的步骤，以允许先前添加的核酸酶降解从包装细胞释放的核酸。
14.权利要求I或2的方法，其中所述阴离子交换吸附剂包括珠形式基质，所述珠形式基质具有大于用于净化步骤的滤器孔径的直径，优选直径大于8 μ m，更优选直径在50 μ m到150 μ m之间，更优选直径在90μπι到120 μ m之间，和甚至更优选直径为120 μ m。
15.权利要求I或2的方法，其中阴离子交换吸附剂的官能团选自二甲基氨基乙基(DMAE)，二乙基氨基乙基(DEAE)，三甲基氨基乙基(TMAE)和三乙基氨基乙基(TEAE)，优选是三甲基氨基乙基(TMAE)。
16.权利要求I或2的方法，其中所述净化步骤通过深度过滤进行，优选在与具有5μ m孔径的滤器连接的具有8 μ m孔径的滤器上进行。
17.权利要求I或2的方法，其中浓缩步骤通过在具有O.09μπι到O. 15 μ m之间孔径的滤器上、优选在具有O. I μ m孔径的滤器上的微量过滤进行。
18.权利要求I或2的方法，其中渗滤步骤在具有O.09 μ m到O. 15 μ m之间孔径的滤器上、优选在具有O. I μ m孔径的滤器上进行。
19.权利要求I或2的方法，其中所述方法进一步包括 1)凝胶过滤步骤；和 2)渗滤步骤。
20.权利要求I的方法，其中用于步骤f)的一价盐是NaCl。
21.权利要求I的方法，其中用于步骤f)的一价盐浓度范围是50mM到150mM，优选是IOOmM0
22.权利要求2的方法，其中步骤f’)中能够抑制核酸酶活性的物质是螯合剂，优选是乙二胺四乙酸(EDTA)。
23.权利要求22的方法，其中EDTA的浓度范围是5mM到20mM，优选是10mM。
24.权利要求2的方法，其中用于步骤i')的一价盐是NaCl。
25.权利要求2的方法，其中步骤i')通过范围从O到2.5M、优选范围从O到2M和更优选范围从O到I. 5M的增加的一价盐浓度梯度进行。
26.前述权利要求中任一项的方法，其中所述正痘病毒是痘苗病毒。
27.前述权利要求中任一项的方法，其中所述正痘病毒是修饰的安卡拉痘苗病毒(MVA)。
28.前述权利要求中任一项的方法，其中所述重组正痘病毒包括外源序列，其是编码具有胞嘧啶脱氨酶活性的蛋白优选是FCUl蛋白FCU1-8蛋白的自杀基因。
29.前述权利要求中任一项的方法，其中所述重组正痘病毒包括外源序列，其编码肿瘤相关抗原(TAA)，优选MUCI。
30.前述权利要求中任一项的方法，其中所述重组正痘病毒包括外源序列，其编码抗原，优选HCV或HPV。
31.权利要求29或30的方法，其中所述重组正痘病毒进一步包括外源序列，其编码细胞因子，优选IL2。
32.权利要求28到31中任一项的方法，其中所述重组正痘病毒进一步包括表达外源序列必需的元件。
33.通过前述权利要求I到32中任一项的方法获得的纯化的野生型、减毒和/或重组正痘病毒，用做药物组合物，优选用做疫苗。
34.通过前述权利要求I到32中任一项的方法获得的纯化的野生型、减毒和/或重组正痘病毒，用于治疗和/或预防癌症、传染病和/或自身免疫病。
35.一种药物组合物，优选疫苗，包括根据前述权利要求I到32中任一项的方法获得的纯化的野生型、减毒和/或重组正痘病毒。
36.权利要求35的药物组合物，用于治疗和/或预防癌症、传染病和/或自身免疫病。
37.通过前述权利要求I到32中任一项的方法获得的纯化的野生型、减毒和/或重组正痘病毒在制备用于治疗和/或预防癌症、传染病和/或自身免疫病的药物组合物、优选疫苗中的用途。
38.获自属于鸭科、优选获自番鸭种的禽类细胞的永生化禽类细胞系用于产生前述权利要求I到32中任一项的野生型、减毒和/或重组正痘病毒的用途。
39.包括编码端粒酶逆转录酶(TERT)的核酸序列的番鸭永生化禽类细胞系用于产生前述权利要求I到32中任一项的野生型、减毒和/或重组正痘病毒的用途。
40.以登录号08060502保藏于欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)的T3-17490番鸭永生化禽类细胞系或其衍生物用于产生前述权利要求I到32中任一项的野生型、减毒和/或重组正痘病毒的用途。
41.以登录号08060501保藏于欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)的T6-17490番鸭永生化禽类细胞系或其衍生物用于产生前述权利要求I到32中任一项的野生型、减毒和/或重组正痘病毒的用途。
42.包括ElA核酸序列和编码端粒酶逆转录酶(TERT)的核酸序列的番鸭永生化禽类细胞系用于产生前述权利要求I到32中任一项的野生型、减毒和/或重组正痘病毒的用途。
全文摘要
本发明涉及一种产生和纯化野生型、减毒和/或重组正痘病毒的方法。本发明涉及通过本发明方法获得的纯化的野生型、减毒和/或重组正痘病毒和用于治疗和/或预防癌症、传染病和/或自身免疫病的包括所述纯化正痘病毒的药物组合物(优选疫苗)及其用途。本发明还涉及获自属于鸭科的禽类细胞的永生化禽类细胞系(具体来说是包括编码端粒酶逆转录酶(TERT)的核酸序列和任选存在的E1A核酸序列的番鸭永生化禽类细胞系)根据本发明的方法用于产生野生型、减毒和/或重组正痘病毒的用途。
文档编号C12N7/02GK102740881SQ201080031647
公开日2012年10月17日 申请日期2010年5月11日 优先权日2009年5月12日
发明者C·塞内, S·康普尔西, Y·科迪尔 申请人:特兰斯吉恩股份有限公司