专利名称：一种快速调控水稻内源miRNA活性的方法
技术领域：
本发明涉及反义核苷酸以及miRNA模拟物技术。
背景技术：
Micro RNA (miRNA)是一类 22nt的内源非编码小分子RNA。在真核生物中， miRNA通过与靶mRNA互补配对结合，以抑制基因翻译或剪切mRNA的方式，起到转录后负数调控的作用。对拟南芥、水稻等模式植物的研究显示，植物miRNA不仅调控根系发生、开花时序等多种生长发育过程，而且在氧自由基、干旱、盐分、严寒和无机营养缺失等胁迫响应中也起重要作用。miRNA作为广泛分布的转录后调节因子，已日益成为功能基因组研究中不可缺少的组分，但绝大部分miRNA的功能尚不清楚。目前，在植物中对miRNA进行功能研究的手段主要有两种1)通过靶基因模拟 (target mimics)的策略，利用过表达目标miRNA靶基因的类似物，间接实现knockdown目标miRNA的活性；2)通过人工miRNA (artificial miRNA, amiRNA)技术，利用过表达目标 miRNA的前体，实现增强miRNA的活性。上述方法均以构建靶基因或miRNA前体的表达载体为前提，并需要利用转基因技术获得稳定遗传的转基因植株或者利用病毒转染进行瞬时表达。除此之外，在动物中有利用反义miRNA寡核苷酸(Anti-miRNA Oligonucleotide, ΑΜ0) 或miRNA模拟物(miRNA mimics)，通过将其显微注射入动物胚胎或者转染细胞系，实现快速抑制或增强miRNA活性的报道。尽管动物中脂质体可以有效帮助寡核苷酸跨膜运输，但在植物中脂质体却不容易穿过细胞壁。由于寡核苷酸跨膜运输的局限性，反义寡核苷酸技术在植物中并未得到广泛应用。最近，有报道在大麦叶片中反义寡脱氧核糖核酸(antisense oligodeoxynucleotides, antisense 0DN)可以通过蔗糖转运蛋白主动运输入植物细胞从而抑制mRNA的表达(Sun et al.，2005; Sun et al.，2007)，提示有可能通过促进寡核苷酸跨膜运输实现快速调控植物内源miRNA的活性。目前，利用AMO或miRNA mimics在植物活体内抑制或增强内源miRNA的报道尚未见报道；同时对多个植物miRNA活性进行调控，在同一处理中既能抑制部分miRNA活性又能增强另外某些miRNA活性的研究尚未见报道。
发明内容
本发明针对目前植物miRNA功能研究受限于以人工microRNA或靶基因表达载体构建为基础的技术，存在实验周期长、费时费力的问题，提供了一种快速调控植物内源 miRNA活性的方法。该方法按以下步骤实施一、根据目标miRNA成熟体序列设计并合成反义寡核苷酸或模拟物(mimics) ；二、利用蔗糖-核苷酸溶液浸泡水稻组织或植株，将核苷酸导入植物细胞，实现在特异地抑制或增强目标miRNA的活性；所述的核苷酸为目标miRNA的反义寡核苷酸或miRNA的双链寡核苷酸模拟物。浸泡前，预先在清水中黑暗处理1214小时。其中的反义寡核苷酸是采用2’ -Ο-methyl修饰并与miRNA成熟体序列完全互补的反义寡核苷酸。不同miRNA的反义寡核苷酸和模拟物可以混合使用。采用水稻组织时，可以是离体根、茎、叶、花序或小穗。此时蔗糖-寡核苷酸溶液浸泡为一次性浸泡，先在蔗糖浓度为50mlT200mM的蔗糖-寡核苷酸溶液中浸泡3飞小时，再在蔗糖浓度为50mlTl00mM的蔗糖-寡核苷酸溶液中浸泡直至1214小时。蔗糖-寡核苷酸溶液中核苷酸的浓度为2. 5 μ μ Μ。采用水稻植株时，可以是植物活体的幼苗或成体。此时蔗糖-寡核苷酸溶液浸泡可采用间歇多次浸泡或一次浸泡。多次浸泡为每次在蔗糖浓度为50mlTl00mM的蔗糖-寡核苷酸溶液中浸泡1214小时，每两次浸泡之间的间隔期为2、天，间歇期间水稻植株正常培养生长；多次浸泡次数可以为2次或以上，每次使用的蔗糖-寡核苷酸溶液中核苷酸的浓度为0. 625 μ 5 μ Μ。一次浸泡先在蔗糖浓度为50mlT200mM的蔗糖-寡核苷酸溶液中浸泡3飞小时，再在蔗糖浓度为50mlTl00mM的蔗糖-寡核苷酸溶液中浸泡直至1214小时。曾有报道利用蔗糖-寡核苷酸溶液将未加修饰的18-mer反义ODN运输进大麦的离体叶片或花序，以抑制目标基因的mRNA表达(Sun et al. , 2005, 2007)，但即使基于现有的研究，开展本发明的研究工作仍存在着一系列不确定性
首先，文献中报道的作用机理是根据RNaseH酶切割杂合分子中的RNA链的特性，利用反义DNA与目标mRNA结合形成DNA =RNA杂合分子，从而激活RNase H导致目标miRNA降解。本发明中的AMO为与miRNA成熟体完全互补的单链RNA ( 21nt)，其抑制miRNA功能的作用机理主要是根据空间位阻效应，通过阻止miRNA与其靶基因在RNA诱导沉默复合体 (RNA Induced Silencing Complex, RISC)中的结合，达到抑制miRNA生物学功能的效果。 两者的作用机理有着本质区别。其次，现有文献中被报道用于抑制mRNA的ODN未加修饰(naked 0DN)，而本发明中用于抑制miRNA功能的AMO经过2’-0-methyl修饰。甲基化修饰可以保护寡核苷酸不被核酸外切酶和内切酶的作用，增加其在细胞内的稳定性。对文献中利用ODN抑制mRNA的应用而言，甲基化修饰的ODN将保护DNA =RNA分子，抑制RNase-H介导的RNA降解，从而严重影响其抑制mRNA的效果。而由于本发明的作用机理是通过空间位阻效应抑制miRNA的生物学功能，因此甲基化修饰将增加AMO在细胞内的稳定性及其与目标miRNA的结合能力，增强对miRNA活性抑制的效果。 第三，化学修饰导致本发明中AMO的分子量相对较大，沿用文献中ODN处理的摩尔浓度及时间，将由于蔗糖-核苷酸溶液的质量百分比浓度过高而形成对植物细胞的干旱胁迫，影响植物细胞的正常功能及寡核苷酸的跨膜运输。而本发明经过多次摸索试验发现，采用本发明方案可以在保持植物或组织完整性的同时将miRNA的反义寡核苷酸或模拟物转运至植物细胞，实现对植物内源miRNA活性的快速调控，达到抑制或增强miRNA生物学功能的显著效果。与现有技术相比，本发明的有益效果如下
1.本发明操作简便快捷，干扰效果显著、稳定持久，避免了现有方法由于依赖过表达载体构建及遗传转化或病毒转染技术，因而实验周期长、费时费力的缺点；对活体植株采用 “少量多次”的实施方式，减少了高浓度的蔗糖-寡核苷酸溶液可能导致的细胞干旱胁迫。2.不受品系或物种局限性，即使是转化体系不完善的籼稻品系或其他非模式植物，也可使用本发明方便快捷地沉默或过表达目的miRNA，为研究不同遗传背景下植物miRNA的生物学功能提供了新手段；
3.本发明可以通过将不同靶miRNA的反义寡核苷酸或模拟物混合使用，实现对多个目标miRNA同时进行正调控或负调控，为深入进行植物调控网络的功能研究、发现控制复杂性状的关键基因奠定了基础。
图1是以OSa-MIR820a-C为例，糖溶液及反义寡核苷酸浓度对水稻叶片中 miRNA沉默的量效关系。a)不同浓度的糖溶液及anti-OSa-MIR820a-C处理水稻叶片后 osa-MIR820a-c 的表达量；b) anti-osa-MIR820a_c 处理后 osa_MIR169f，g 的表达量，用于检测反义寡核苷酸的偏靶效应。图2是以OSa-MIR820a-C为例，反义寡核苷酸处理水稻叶片对内源miRNA沉默的时效关系。a) anti-osa-MIR820a_c处理水稻叶片不同时间后osa-MIR820a_c的表达量； b)相同处理条件下对应的osa-MIR820a-c靶基因0s03g02010的表达量。图3是以OSa-MIR820a-C为例，反义寡核苷酸处理水稻幼苗对内源miRNA沉默的时效关系。a) anti-osa-MIR820a-c处理水稻幼苗12小时或M小时后osa-MIR820a_c在不同时间点的表达量；b)相同处理条件下对应的oSa-MIR820a-C靶基因0s03g02010的表达量。图4是miRNA反义寡核苷酸及模拟物的混合物处理水稻幼苗对内源miRNA的调控效应。a) miRNA反义寡核苷酸及模拟物的混合处理后，各个miRNA表达量。b) miRNA反义寡核苷酸及模拟物的混合处理后，各个靶基因的表达量。
具体实施例方式以下结合实施例和附图进一步对本发明进行详细说明，但是具体实施例并不在任何意义上构成对本发明保护范围的限制。实施例1材料与方法。1.反义寡核苷酸的设计与合成
从miRbase中获得目标miRNA的成熟体序列，根据序列互补原理设计其反义寡核苷酸序列，反义寡核苷酸采用2’ -Ο-methyl修饰；miRNA模拟物为与成熟体序列一致的双链核糖核苷酸，为增强其稳定性3’末两位碱基可为脱氧核糖核苷酸。同时利用BLAST软件分析， 确定miRNA反义寡核苷酸和模拟物的随机对照序列。MiRNA反义寡核苷酸及模拟物均由上海吉玛公司合成。2.植物材料及栽培条件
水稻品系日本晴(Nipponbare)的种子用5%次氯酸钠溶液浸泡10分钟，灭菌水冲洗干净，在室温下水中浸泡三天，然后在37° C下发芽一天(保持黑暗)，生长同步的种子在自然条件下用水稻土培养至一个月大小。3.糖溶液介导的miRNA沉默
选取健康的生长状况一致的一个月大的水稻，将其连根拔出后用水清洗干净。培养在清水中黑暗处理M小时，之后分离带叶鞘的叶片，叶片用蔗糖-反义寡核苷酸溶液浸泡处理M小时。每种处理进行三个生物学重复，处理后的样品经超纯水漂洗用于后续的RNA提取。4.总 RNA 提取
1)用1%。的DEPC溶液浸泡需要使用的离心管、磁珠和石英砂过夜，然后包装，并于 121°C高压蒸汽灭菌50分钟。所有使用的去离子水均为经过高压灭菌的1%。DEPC水。2)在2ml的离心管内加入适量石英砂和一粒磁珠，以及500 μ 1的抽提缓冲液及 75μ 1的β-巯基乙醇。抽提缓冲液的配方如下
d)Tris · HCl(1M，PH 8. 0) IOml (IOOmM)
e)EDTA (0. 5M, PH 8. 0) 8ml (20mM)
3)在上述管子中加入少于250mg的新鲜组织样品，然后用！^astft 印仪震荡粉碎， speed 5. 5级，time 30秒。粉碎后的样品从hsterfr印仪上取出后马上用离心机高速甩去气泡，然后立即加入75μ 1的β-巯基乙醇和500 μ 1的抽提缓冲液，混勻后室温静置10 分钟。4)短暂离心后将上清转移到一新管，加入约800 μ 1氯仿异戊醇(24 :1)，混勻。 4°C下，IOOOOrpm 离心 8min。5)小心吸出上层清夜移至新管，再加700 μ 1的氯仿异戊醇(24 :1)，混勻后4°C离心(10000rpm，8min) 1 次。6)小心吸出上层清液倒新管，加入1/3倍体积的8M LiCl，并混勻。_20°C沉淀6小时或过夜。7) 4°C，IOOOOrpm 离心 15min,取上清。8)加入 800ul 75% 的乙醇，混勻，4°C，7500rpm 离心 5min。9)吸去乙醇，将沉淀真空抽干。加入30ul DEPC水溶解沉淀，取Iul电泳检测，Iul 用Thermo NanoDrop 2000测浓度，其余样品_20°C保存。5. miRNA的荧光实时定量PCR检测
miRNA的荧光实时定量PCR采用Varkonyi-Gasic等(2007)的UPL探针方法。首先， 根据成熟体序列设计miRNA特异的Stem-loop RT-PCR引物(Chen et al.，2005)，利用 TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (AB)，在 7. 5ul 体系中加入 200ng 总 RNA 进行反转录，反应程序为16°C 30min, 42°C 30min, 85°C 5min, 4°C 20min。然后，取 Iul反转录产物作为模板，在含Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen)的IOul反应体系中力口入 0. Iul 浓度为 IOuM 的 Universal PorbeLibrary Probe #21 (Roche)探针，进行 miRNA荧光实时定量PCR。使用仪器为Roche LightCycler480，反应程序为94°C IOmin ； (940C 15sec, 60°C lmin) 45个循环，60°C收集信号。运行结束后利用LightCycler480 Softwarel. 5分析数据。每种样品进行三个生物学重复，以5. 8s rRNA作为内参基因，miRNA 的相对表达水平采用计算。6. mRNA的荧光实时定量PCR检测
IOOrnl
a)CTAB
b)PEG4000
c)NaCl
2g (2%终浓度) Ig (1%终浓度) 8. 18g (1. 4M )总RNA用TURBO DNA-free kit (Ambion)处理去除残留的DNA。反转录反应参照 SuperScript III First-Stand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen)提供的说明书操作。实时定量参照Platinum SYBR Green qPCR SuperMix Gnvitrogen)提供的说明书操作。反应程序94°C 2min, (94°C 15sec, 60°C 20sec, 72°C 20sec) 45 个循环，72°C 收集信号，使用仪器为Roche LightCyclerfSO。每种样品进行三个生物学重复及两次技术重复，以Actin作为内参基因，mRNA的相对表达水平采用2 _ΔΔετ计算。实施例2 反义寡核苷酸对水稻叶片中miRNA活性抑制的最佳作用浓度。如实施例1，其中步骤3的蔗糖-反义寡核苷酸溶液，分别采用4种蔗糖溶液浓度(200mM-IOOmM, IOOmM, 100mM-50mM, 50mM)及两种 anti-osa-MIR820a_c (SEQ ID NO: 1 :5，-CUGGUCCAUCCACGAGGCCGA-3，)溶液浓度(2. 5 μ M 和 5 μ M)，一共 8 种浓度组合的溶液对水稻叶片进行M小时处理。对照组采用anti-mock (SEQ ID NO:2 5‘-GGUUGUCCUACCUAGGGCGCC-3‘)处理，处理条件同上。其中 200mM-100mM及 100mM-50mM 的蔗糖浓度，是指先用高浓度处理3小时然后降至低浓度处理直至M小时。图Ia表明在各种浓度组合下，oSa-MIR820a-C的表达量均下降到对照组的约1%左右，miRNA沉默效果非常显著(Student's t-test, p<0. 001 )。不同的反义寡核苷酸浓度对miRNA沉默效应的影响不显著；高浓度的蔗糖溶液能在一定程度上促进反义寡核苷酸的转运，但当使用IOOmM或以上浓度的蔗糖溶液处理超过3小时后叶片出现萎蔫，随后降低糖浓度症状能得到缓解。因此在后续实验中我们使用了 100mM-50mM蔗糖溶液浓度与较低的反义寡核苷酸浓度(2. 5μΜ) 的组合进行处理。图Ib表明使用100-50uM蔗糖溶液及2. 5 μ M anti-osa-MIR820a_c处理水稻叶片M小时后，oSa-MIR-169f，g的表达量与对照组并无显著差异，因此反义寡核苷酸处理有较好的特异性，对其他非目的miRNA的影响较小。实施例3 反义寡核苷酸对水稻叶片中miRNA活性抑制作用的时效性。如实施例1，但步骤三中处理浓度及时间为先在蔗糖浓度为IOOmM的蔗糖-寡核苷酸溶液中浸泡3小时，再在蔗糖浓度为50mM的蔗糖-寡核苷酸溶液中浸泡直至5小时、 12小时和M小时，所有处理的蔗糖-寡核苷酸溶液中反义寡核苷酸的浓度均为2. 5 μ M。如图2a所示，在不同anti-osa-MIR820a_c的处理时间下，osa-MIR820a_c的表达量相对对照组均有显著下调(P<0. 001)，且下调程度随时间增加而加强；与之对应， osa-MIR820a-c的靴基因0s03g02010的表达量在anti-osa-MIR820a_c处理24小时后上调至对照组的约5倍(图2b)。因此，蔗糖溶液介导的反义寡核苷酸处理可以有效抑制水稻离体叶片中内源miRNA的活性，延长处理时间能加强miRNA沉默的效果。实施例4 反义寡核苷酸对水稻幼苗中miRNA活性抑制作用的时效性。如实施例3，但步骤二中的植物材料为2-3天大小的水稻黄化幼苗；步骤三中的处理则是将小苗根部先在蔗糖浓度为IOOmM的蔗糖-反义寡核苷酸溶液中直接浸泡3小时， 再在蔗糖浓度为50mM的蔗糖-寡核苷酸溶液中浸泡直至12小时和M小时，随后将幼苗转 A^shida培养液进行水培。对处理12小时的幼苗，分别在12小时、M小时、2天、5天和 7天收集材料提取RNA ；对处理M小时的幼苗，分别在M小时、2天、3天、5天和7天收集材料提取RNA。其他步骤与3相同。如图3a 所示，水稻幼苗经 anti-osa-MIR820a_c 处理 12 小时后，osa-MIR820a_c 的表达量降至对照组的30%左右，osa-MIR820a-c的表达量在M小时降至最低，并可以一直维持在约为对照组5-8%的水平直至第五天，第七天OSa-MIR820a-C的表达略有回升但仍能保持在对照组的24% ；anti-osa-MIR820a-c处理M小时后，幼苗osa-MIR820a_c 的表达量降至对照组的5%，osa-MIR820a-c的表达量在第二天降至最低，随后直至第七天OSa-MIR820a-C的表达量都可以稳定保持在对照组的 10%。如图北所示，水稻幼苗经 anti-osa-MIR820a-c处理后，osa-MIR820a_c靶基因的表达量与对照组相比略有上调，最多可上调 21%左右。蔗糖溶液介导的反义寡核苷酸处理可以有效地在水稻幼苗活体内抑制内源miRNA的活性，而且作用时间可以持续至少7天。实施例5 反义寡核苷酸与miRNA模拟物的混合物对水稻幼苗中内源miRNA的调控。如实施例4，但步骤三中的单个miRNA的反义寡核苷酸由多个miRNA的反义寡核苷酸与miRNA模拟物的混合物替代，混合物中含有
0.625 μ M anit-osa-MIR390 (SEQ ID NO:3 5，- GGCGCUAUCCCUCCUGAGCUU-3，)、 0. 625 μ M anit-osa-MIR160a-d (SEQ ID N0:4 5' - UGGCAUACAGGGAGCCAGGCA-3')、 0. 625 μ M anit-osa-MIR167d-h (SEQ ID N0:5 5' - CAGAUCAUGCUGGCAGCUUCA-3')、 0. 625 μ M anit-osa-MIR171g (SEQ ID NO:6 :5，- GAUAUUGGCUCGGCUCACCUC-3，)禾口 2. 5 μ M mimic-osa-MIR164a, b, f (sense: SEQ ID N0:7 5' -UGGAGAAGCAGGGCACGUGCA-3', antisense: SEQ ID N0:8 :5，_ UGCAC⑶GCCCUGCUUCUCCA-3，);幼苗根系在蔗糖浓度为 50mM、 寡核苷酸混合物浓度如前所述的蔗糖-寡核苷酸溶液中浸泡M小时后，转入^shida营养液中水培两天，然后在同样浓度的蔗糖-寡核苷酸溶液中进行第二次反义寡核苷酸与 miRNA模拟物的混合物处理M小时，随后再转入^shida营养液中水培两天后收集幼苗的根系材料提取 RNA。对照组采用 anti-mock(SEQ ID NO: 2 :5，-GGUU(iUCCUACCUAGGGCGCC-3，) 或 mimic-mock (sense :SEQ ID N0:9 :5’ - GGCGCCCUAGGUAGGACAACC-3’ ； anti-sense SEQ ID NO: 2 :5，-GGUU⑶CCUACCUAGGGCGCC-3，)处理，两者核苷酸浓度均为2. 5 μ M，处理条件同上。其他步骤与实施例4相同。如图如所示，经miRNA反义寡核苷酸和模拟物的混合处理后，四种反义寡核苷酸的靶标miRNA的表达量均有不同程度的下调，除oSa-iOR171g外其他miRNA的表达下调非常显著(P<0. 001)，而miRNA模拟物的靶标OSa-iOR16^，b, f的表达量有显著上调(ρ <0. 001 )。如图4b所示，尽管osa-iOR390和osa-iOR-160的靶基因的表达与对照相比变化和不显著，但osa-MIR167和0s_MIR171的靴基因均有显著上调(p< 0. 01)且osa_MIR164 的靶基因表达量显著下调(P<0. 05)。因此，通过将不同靶miRNA的反义寡核苷酸或模拟物混合使用，可以实现同时抑制或者增强多个目标miRNA的活性。
权利要求
1.一种快速调控水稻内源miRNA活性的方法，其特征在于通过以下步骤实现利用蔗糖-核苷酸溶液浸泡水稻组织或植株，将核苷酸导入植物细胞，实现特异地抑制或增强目标miRNA的活性；所述的核苷酸为目标miRNA的反义寡核苷酸或miRNA的双链寡核苷酸模拟物或它们的组合。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述水稻组织为离体根、茎、叶、花序或小穗。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述水稻植株为植物活体的幼苗或成体。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的蔗糖-寡核苷酸溶液浸泡为一次性浸泡，先在蔗糖浓度为50mlT200mM的蔗糖-寡核苷酸溶液中浸泡3飞小时，再在蔗糖浓度为50mlTl00mM的蔗糖-寡核苷酸溶液中浸泡直至1214小时。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的蔗糖-寡核苷酸溶液中核苷酸的浓度为2. 5 μ M 5 μ M。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的蔗糖-寡核苷酸溶液浸泡为间歇多次浸泡或一次性浸泡；多次浸泡为每次在蔗糖浓度为50mlTl00mM的蔗糖-寡核苷酸溶液中浸泡12 24小时，每两次浸泡之间的间隔期为2 7天，间歇期间水稻植株正常培养生长；一次浸泡先在蔗糖浓度为50mlT200mM的蔗糖-寡核苷酸溶液中浸泡3飞小时，再在蔗糖浓度为50mlTl00mM的蔗糖-寡核苷酸溶液中浸泡直至1214小时。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述的多次浸泡次数为2次或以上，单次使用的蔗糖-寡核苷酸溶液中核苷酸的浓度为0. 625 μ 5 μ Μ。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的水稻组织是浸泡前，预先在清水中黑暗处理12 24小时。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述反义寡核苷酸是采用2’-Ο-methyl修饰并与miRNA成熟体序列完全互补的反义寡核苷酸。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述核苷酸是单个或多个不同miRNA的反义寡核苷酸或双链寡核苷酸模拟物的组合。
全文摘要
本发明公开了一种快速调控水稻内源miRNA活性的方法。该方法通过以下步骤实现一、根据目标miRNA成熟体序列设计并合成反义寡核苷酸或模拟物(mimics)；二、利用糖溶液将目标miRNA的反义寡核苷酸或模拟物经糖转运蛋白主动运输入植物细胞，从而实现在植物活体中特异性地抑制或增强目标miRNA活性。该方法具有操作简便快捷，干扰效果显著、稳定持久的优点，避免了现有方法由于依赖转基因技术因而实验周期长、费时费力的缺点。同时，该方法可以将不同靶miRNA的反义寡核苷酸或模拟物混合使用，实现对多个目标miRNA同时进行正调控或负调控。
文档编号C12N15/87GK102181482SQ20111002674
公开日2011年9月14日 申请日期2011年1月25日 优先权日2011年1月25日
发明者何涟, 吴仲义, 唐恬, 张添元, 文海军, 施苏华 申请人:中山大学