专利名称：镶嵌式高通量基因芯片检测技术及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型的镶嵌式高通量基因芯片检测技术及试剂盒的制备方法。该技术灵敏快速、信息量大，制备方法简便、成本低，能同时检测样品中多种不同的核酸分子、生物化学分子、微生物或细胞等成分，可广泛地用于生物学、医药学、预防医学、动植物学、农牧业、食品与卫生、能源与化工、环境监测以及医学诊断与检测等领域。
固相吸附、分离与合成技术在样品或样品溶液、生物体液(如血液、血清、血浆、脑脊液、尿液等，泪液、汗液、消化液和精液等分泌液，组织液、渗出液、呕吐物、粪便、组织/细胞匀浆液等)、微生物或细胞中的蛋白、核酸等生物化学分子的检测、分析、分离、纯化以及蛋白多肽、寡核苷酸、先导化合物和药物的合成等方面已被广为应用。
生物固相技术主要是利用不溶的固相基质材料，通过表面吸附或结合以捕获液相被分析物和被纯化物中的靶分子或固定新合成的靶分子，借助重力、压力、离心、过滤、磁力、流体等，经过一步或多步操作很方便的将未结合的分子(液相、游离相或流动相)与结合分子(固相)分离，以便获得纯的目的分子，或将靶分子从复杂的样品混合物或悬液中分离出来，用于进一步的分析研究。根据实验的不同，固相基质可用多种不同的材料，如玻璃、塑料、乳胶、葡聚糖、琼脂糖、磁性材料、陶瓷、金属和非金属等制成平板、多孔板、微颗粒和微孔颗粒等。
在样品的检测分析、分离纯化、合成等实验中，大部分情况下需要在同一个容器里、同时进行两项或多项实验，以便对样品中多种不同成分的有无、含量和来源等做出平行的定性、定量、定位等检测分析；或对单一种分子的多种不同特性(如单核苷酸多样性)进行平行检测与分析；或对多种物质同时进行分离纯化，或同时进行多种不同分子的合成。在此情况下，传统的固相吸附试验所存在的问题是对超过3种以上的不同被检测物，纯化物或合成物由于难以区分，很难同时进行。也就是说，用传统的固相技术或方法，在一个容器或试验中被检测物、合成物或分离物的数量受固相系统的限制或制约，更无法同时或连续进行合成、分离与检测等操作。
在现代基因组学、蛋白质组学和功能组学的分析研究和技术开发中，需要同时对同一样品中大量的、多种不同生物化学物质进行快速、灵敏的高通量合成、分离、纯化与检测，以分析生物化学物资的种类、数量、组成、变异以及多态性、翻译后修饰、结构、氨基酸/核苷酸/糖基等的排列顺序、不同生物分子间的相互作用，或个体的健康、感染状态与用药特性，个体免疫系统的功能状态、遗传差异等。传统解决办法是首先通过合成与分离纯化等技术和工艺，分别合成或纯化大量的各种不同的生物探针，如药物分子、核酸分子、蛋白分子、生长因子与受体、抗原和各种不同特异性的抗体等，再分别将生物探针固相化在不同的微孔板或微珠等固相基质的表面，分别与样品中对应的化学物质、抗体或/和抗原分别反应，再分别进行检测分析，由于合成、分离纯化与检测分析等操作相互脱节，因此如要检测十几种成分就需进行十几次不同的合成、分离纯化与检测分析实验，异常繁琐复杂。现有的生物芯片技术(如Affymatrix公司等提供的技术方案)虽将检测分析集成为一体，使样品的高通量检测被简化，但其生物探针的制备和固相化技术、工艺依然十分复杂，效率低。Illumina公司通过一种带有电磁波发射装置的微珠所建立的检测技术，虽进一步简化了生物探针的制备和固相化技术，但是由于电磁波发射装置的存在，不仅制造成本较高，同时也使得微珠的大小和固相中生物探针的容量和检测灵敏度等受到限制，同时还需解决电磁屏蔽等问题。本发明的目的就是要提供一种技术和工艺更为简便灵敏、快速及时，又可同时检测样品中多种不同物质成分、特别是核酸与蛋白分子的生物合成、分离纯化、检测以及可以将三者有机结合，贯通一起的新的高通量生物技术。
本发明的主要技术特征是，将表面连接有不同核酸分子的微珠，分别镶嵌在检测板的不同微孔中，微孔间有微管相连，并与进/出液口形成微流路与外界相通，样品通过微流路与微珠表面连接的核酸分子反应，各孔的反应结果可用目测或用仪器记录分析，根据微珠在检测板中的排列位置和顺序，对样品、细胞和微生物等生物标本中的化学物质、生物靶分子、核酸、寡核苷酸、药物等多种不同成分的有无、性质、含量、来源、组织和细胞学定位等同时进行鉴定分析。
本项发明同时还提供了一种基于镶嵌式高通量基因芯片检测技术制备试剂盒的方法，其主要技术特征在于试剂盒由镶嵌有微珠，带有微流路的多孔检测板及各种相关的配套试剂分别组成；根据检测板各微孔反应的有无与强弱，以及各微孔在检测板中的排列位置和顺序，可对不同样品中多种不同成分同时进行比对分析，利用试剂盒中所提供的试剂和方法还可对检测板中各孔所捕获的样品成分，做分子克隆、分子结构、亲和力、分子量、等电点、糖基化、磷酸化、核苷酸或氨基酸序列测定等进一步分析。该试剂盒不仅大大简化了同一样品进行多因素检测分析的操作步骤，缩短了操作时间，降低了工作强度，更增加了检测结果的精确性、灵敏度、重现性和可比性，而且还可同时对检测样品中多种不同的物质成分做进一步的不同分析，使用更方便，操作更快捷，并且可广泛地应用于环境检测、疾病诊断、新药开发、疫苗研究、生物分子相互作用、基因组学、蛋白质组学和功能组学等技术、研究领域。
为了达到上述目的本发明所采用的技术方案其基本特征在于，镶嵌式高通量基因芯片检测技术及试剂盒的制备至少包括下述成分或步骤①一种由微孔板(1)、微珠(2)等组成的检测板；微孔板由板体(3)、板盖(4)、微孔(9)、和微流路等结构组成；微珠通过手臂分子(12)上的活性基团连接核酸(13)或寡核苷酸(14)分子探针形成表面分子涂层，并按一定的顺序镶嵌在不同的微孔中；②被检样品，如固/液体标本、生物体液、组织、细胞、微生物等经过处理，如稀释、去除颗粒性物质、组织/细胞的裂解、分离纯化、反转录、PCR扩增、标记等；或不处理直接由进液孔(5)进入微孔板、沿微槽和/或微管流经微孔与微珠表面连接的核酸分子相互作用，使样品中的蛋白或序列互补的核酸分子与固相核酸分子探针在特定的条件下杂交或特异性结合，未结合的样品成分经出液孔(6)流出；③用标记分子(15)，如荧光素、同位素、生物素和半抗原，胶体金、酶、稀土离子及其螯合物等物质或其衍生物(如Cy5-dCTP，32P-dCTP等)直接标记被检样品；或用标记分子的不同标记产物，如荧光抗体等标记物(16)标记被检样品；
④漂洗，去除微孔板中非特异性结合的或残留的样品或样品标记物和标记物(16)、等；⑤目测或用扫描仪等检测各微孔中标记分子(15)的有无与含量，如荧光、发光产物、放射性的有无，强弱或显色产物的有无，颜色的深浅等，分析被检样品中被检物的有无、含量、组成、来源、分子结构、亲和力、组织/细胞学定位以及核苷酸或氨基酸序列等；⑥标记物为酶时，如HRP(辣根过氧化物酶)，AP(碱性磷酸酶)、荧光素酶(Luciferin)等，观察结果前需先加入显色剂或发光试剂等底物试剂，如OPD(邻苯二胺)、DAB(二氨基联苯胺)或发光试剂(如鲁米诺、甲基伞形酮磷酸酯、对羟基苯乙酸)等。
本发明的特征还在于微孔板由板体、板盖、微孔和微流路组成；板体和板盖为任何可加工成型的、透光的、不透光的或反光的硬质或软质材料，如玻璃、塑料、高分子合成材料、陶瓷、金属、非金属等多种不同材料或复合材料等，可加工成方形、长方形、园盘型或其它外观形状的实体结构；在板体和板盖上可分别具有进液孔、出液孔、密封圈(7)、蠕动管(8)、微孔、微槽(10)、微管(11)、驱动孔、定位孔和视窗等部分或全部结构；微孔按一定的格式排列，其间有微槽或/和微管直接或间接两两相连，通过微流路与外界相通或形成闭合环路；板体和板盖分别或共同经不同的化学修饰或表面处理，①产生反光层，反射光信号；②获得惰性化学涂层，如辛胺、泰富隆(Teflon)涂层、硅化等处理以减少样品和/或标记物等对板体和板盖的非特异性吸附。
本发明的特征还在于微珠是由任何可加工成型的材质，如玻璃、塑料、葡聚糖、聚蔗糖、琼脂糖、高分子合成材料、纤维素、乳胶、硅胶、层析基质、陶瓷、磁性材料、金属或非金属等多种不同材料或复合材料，经加工而成的，大小均一、具有不同外观形状的多孔或实心体；微珠经表面处理可获得带有不同活性基团的手臂分子；手臂分子上的活性基团可进一步与不同的核酸分子或寡核苷酸分子探针等连接，获得具有不同结合特性的表面分子涂层。
本发明的特征还在于微流路由进液孔、出液孔、微槽、微管、密封圈、蠕动管等结构组成，可分别位于板体或板盖上，也可全部位于板体或板盖上，其在板体或板盖上的不同位置与组合，可形成具有不同几何特征，满足不同实验需求的微流路；微流路通过微槽或/和微管与微孔相连，并通过进液孔和出液孔与外界相通；蠕动管位于进/出液孔之间，将微流路连接成闭合环路，以便液相可与固相充分反应；蠕动管可位于检测板上也可以外置，蜂巢式微孔板可无微槽和微管，亦或无进/出液孔等结构，使用时可通过视窗添加样品和漂洗；蜂巢式微孔板可无微槽和微管，或也无进/出液孔等微流路结构；微流路经表面处理可获得不同的惰性表面涂层。
本发明的特征还在于表面分子涂层是指通过手臂分子上的活性基团，分别连接的具有不同序列和长度的核酸分子或寡核苷酸分子探针，在微珠和微孔的固相基质表面形成的具有一定结合特性的核酸分子表面；分子涂层的种类和制备方法至少包括①通过核酸合成仪直接在微珠的固相基质表面合成，获得小分子的寡核苷酸分子探针的表面分子涂层；②通过手臂分子上的活性基团，连接或吸附各种不同序列的核苷酸或寡核苷酸探针，形成表面分子涂层；
③以微珠表面的寡核苷酸分子探针为特异性引物，已知序列核酸为模板，在试管或微孔板中通过PCR反应延长寡核苷酸链并扩增，获得长链核酸分子探针的表面涂层。
本发明的特征还在于被检样品和长链核酸分子探针，可用寡核苷酸引物，通过至少一个循环周期的PCR反应进行扩增或延长，扩增或延长反应可在微孔板中也可在试管中进行。该循环周期包括a)样品核苷酸的加熱变性；b)引物与模板或样品中的靶核苷酸退火杂交；c)用DNA聚合酶延长靶核苷酸链序列。
本发明的特征还在于以荧光染料(如FITC，Cy3，Cy5，Texas Red等荧光素)、同位素(125I，32P，35S，3H等)、生物素和半抗原，胶体金、酶(HRP，AP，半乳糖苷酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，尿素梅和荧光素酶等)、稀土离子(如Eu，Sm，Tb和Dy等)及其螯合物(如Eu3+-DTPA)等或其衍生物(如Cy5-dCTP，32P-dCTP等)直接标记被检样品；或用标记分子的不同标记产物，如荧光抗体、酶标抗体、生物素化抗体、生物素化酶、Eu3+-DTPA-抗体等能与样品中的被检物特异性结合的标记物(16)标记被检样品(间接标记)；标记反应可在微孔板中进行，也可以在试管中进行；但在微孔板中进行标记时只采用掺入标记，而不使用偶联或修饰等标记方法。
8.本发明的特征还在于可采用下述方法进行定量分析①在同一块微孔板上连接相同序列核酸分子的微孔或镶嵌微珠的微孔数量可有1个或1个以上的复孔，当样品沿微流路逐孔流经各微孔及其复孔时，对应的被检物被不断结合，并不断地从样品液中去除，因此，各微孔及其复孔的结合量，因前后排列顺序的不同逐渐减少，即使进行PCR扩增，也因各微孔结合模板数量的不同，导致扩增量有明显不同；因此可根据各微孔与复孔反应的有无与强弱变化，进行定量分析；②在进行定量分析时，可按此方法设定标准参照物，借助计算机分析可绘出标准参照物的浓度-反应孔数量或拷贝数与其强弱变化曲线，对照标准曲线，结合标本体积，获得精确的定量分析结果。
9.本发明的特征还在于试剂盒至少装有一块检测板，微孔中至少镶嵌一粒微珠，微珠表面分别连接某种特定序列的核酸分子，并与下述成分分别或共同组成不同的试剂盒①至少有一管组织/细胞或微生物样品处理液，用于DNA，RNA或蛋白质的提取；处理液可分别含有适量的去垢剂(如Triton X-100，NP40，Chaps等)、核酸酶抑制剂(如DNA酶和RNA酶抑制剂)、蛋白酶抑制剂，如PMSF，EDTA，TPCK，TLCK，aprotinin，leupeptin，antipain等，以保证样品充分裂解和溶解，同时保证DNA、RNA或蛋白分子等不被降解；②至少有一管为dNTP(三磷酸脱氧核苷)，引物和用于PCR扩增的热稳定的DNA聚合酶用于样品的扩增或微珠捕获的样品成分的基因克隆；③至少有一管为dNTP和反转录酶，用于用于样品mRNA互补cDNA的合成；④至少有一管含标记分子及其衍生物(如FITC，Cy3，Cy5，Texas Red，地高辛和生物素、Cy5-dCTP，32P-dCTP等)或标记物(如荧光抗体、酶标抗体等)用于对样品的直接或间接标记；⑤在标记物为酶类时，至少有一种显色底物或发光底物，如OPD或DAB与过氧化氢/脲、鲁米诺，甲基伞形酮磷酸酯，ATP等；⑥至少有一管洗涤液或其浓缩液，如含有适量BSA或小牛血清、鲑精DNA，脱脂奶粉、去垢剂等的缓冲液，可用于检测板的漂洗或流洗，以去除反应中的各种非特异性结合物；⑦至少有一管为蛋白质浓度检测分析试剂，如Folin-酚试剂，Bradford试剂等；
⑧至少有一管为核酸内切酶(如EcoRI等)、蛋白水解酶(如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，羧肽酶等)，用于微珠捕获核酸或蛋白的消解，以便进行蛋白质的质谱分析、核苷酸或氨基酸序列分析；⑨至少有一管为电泳样品缓冲液，如含适量SDS或尿素等不同蛋白质变性剂的SDS-PAGE电泳样品缓冲液或含有尿素或Chaps等的IEF电泳样品缓冲液及核酸电泳样品缓冲液等用于电泳分析；⑩至少有一管为蛋白质糖基化或蛋白质磷酸化分析试剂，如PNGase F，磷酸酶(如细菌碱性磷酸酶，马铃薯磷酸酶等)。
本发明的特征还在于在完成基本检测分析后，还可用试剂盒中的试剂通过下述不同的方法对检测板各不同孔所结合的样品成分分别做质谱分析、核苷酸/氨基酸序列测定、蛋白质磷酸化以及糖基化等进一步分析前的处理①直接在感兴趣的各微孔中加入核酸内切酶、蛋白水解酶、磷酸酶或电泳样品缓冲液或蛋白质糖基化分析等试剂，对微孔和微珠的结合物在原位做基因克隆或进一步分析前的样品处理；②将微孔中的生物微珠取出，在微量反应器中分别加入对应试剂做基因克隆或进一步分析前的样品处理；③将新鲜样品分别与感兴趣微孔的复本微珠共育，以同样的条件重复微孔板的操作步骤，将样品中感兴趣的物质成分与样品液分离，加入对应试剂，对结合物做基因克隆或进一步分析前的样品处理。
本发明具有以下优点1信息量大。微珠的大小可从毫米到纳米，目前各种商售的固相基质颗粒一般在几十微米到数百微米之间，如按50微米计算，则每平方毫米至少可容纳100枚，每平方厘米可容纳约10万枚，相当于人类全部基因的2-3倍。因此，如能将全部基因探针连接在微珠表面，用于基因表达的研究，经一次检测分析，就可同时获得数万种不同表达基因平行检测分析的结果与数据资料。2.易于制备、成本低。本发明所述的微珠可选用各种商售产品为原材料，如寡核苷酸固相合成用的基质材料多孔玻璃珠、聚苯乙烯珠、各种层析基质、硅胶珠等，本发明将核酸探针的扩增、PCR引物的合成、样品的标记与扩增等固相合成、分离纯化与生物微珠的制备融为一体，省略了繁杂的生物分离纯化过程；3.自由组合，灵活易变。可完全依照使用目的的不同，自由组合，或灵活地改变微孔板中任何一孔镶嵌微珠的种类和结合特性以改变检测的内容，而无需变动全部排列顺序和格式；4.灵敏度高。本技术方法所用的固相基质采用了三维立体结构，即微珠与微孔均可或分别作固相。每个微珠相当于固化了配基/配体的亲和层析基质，与传统方法相比，有更大的比表面积和比结合容量。同时由于通过手臂分子上的化学活性基团连接核酸分子，消除了空间位阻对分子杂交时的影响，进一步提高了比结合容量。为提高反应灵敏度，还可采用多孔微珠和微孔作固相，使比表面积远远超过现有技术和方法。当样品逐孔流过串珠样排列的微孔时，可与固相中的核酸探针杂交或特异结合(具有过滤、亲和层析、分离与浓缩效用)；同时被固相吸附后的样品液不再与样品原液混合，减少了被检测物(如抗原/抗体等)因反复扩散、平衡而被稀释的影响，故更加灵敏；5.操作简便，节省样品与试剂。采用本发明所述的高密度微孔板进行检测分析，样品、标本、标记物、洗液和底物沿微流路逐一流经各孔，改变了传统和现有技术分别反应、清洗或在较大的容器中反应和浸洗的操作方式，因此可解决因样品不易获得和标记物价格昂贵所带来的困扰，可大量节约试剂，并且易于实现全自动化操作；6.定量分析更准确。本方法将数十种甚至数千种化学物质和生物分子的检测分析集中在一块检测板上同时进行，根据检测板中各微孔中荧光、胶体金沉积、发光的有无，或成色产物的生成与否，对照其排列位置，不仅可以确定样品的组成及各组分的来源、含量，组织/细胞定位，同时又便于不同样品间和同一样品不同成分间的平行比对。微珠的表面分子的连接、扩增和标记可在同一试管中一次性大量制备，从而可保证各复孔和各检测板之间的检测结果的平行一致。在需要对某一成分进行定量分析时，通过增加相同包被物平行包被的复孔数量，配合微流路解决了定量分析的问题；7.保留了传统和现有检测方法重复性好，准确性高、可靠性强等优特点。8.结果易于分析。由于微珠的形状和尺寸相同，封闭式镶嵌立体结构可避免灰尘引起的噪声信号，因而能获得均匀和最小的图像背景强度，同时每个微孔和微珠的排列可与光电信号转换元件的排列一致，因此可获得最佳的基因芯片图像。9.用途更广泛。本发明不仅可直接用于疾病的诊断、新药的开发和蛋白质组学等现代生命科学的研究与开发；而且对感兴趣的微孔还可直接在检测板中进行基因克隆、核苷酸/氨基酸变异与序列分析、DNA结合蛋白的糖基化、磷酸化、以及分子结构、功能、亲和力与组织/细胞及亚微或超微结构定位等进一步分析。
图中所示为微孔板1，微珠2，板体3、板盖4、进液孔5、出液孔6、密封圈7、蠕动管8、微孔9、微槽10，其中微珠2镶嵌在微孔9中；各微孔间的微槽10将微孔9与进液孔5、出液孔6，相连并和密封圈7等结构组成微流路；图中微孔9与微槽10、进液孔5、出液孔6和密封圈7形成微流路，再与蠕动管8构成闭合环路。图2为3种典型检测板的外观结构示意中2A，2B，2C分别为3种典型检测板的外观结构示意图，图中所示为微孔板1、进液孔5、出液孔6，驱动孔20，定位孔21和视窗22等结构。图2C所示的检测板也可为蜂巢式，微孔间可无微槽或微管，但保留进液孔5，出液孔6；或者无进液孔5，出液孔6等结构，使用时直接经视窗22添加样品和漂洗。图3是图2A中虚线框A部分的放大图。
图3A为平面图，图中所示为微孔板1、微孔9、不连续的微槽10，镶嵌在微孔9中的微珠2，以及与微槽10相通的进液孔5、密封圈7；图3B为图3A的A-A剖面图，图中所示为板体3、板盖4、微孔9、微槽10、微管11、镶嵌在微孔9中的微珠2，进液孔5、密封圈7等；图中微孔9上端的微槽10与板盖4形成微管11，并与下端的微管11将微孔9两两相连，与进液孔5、出液孔6等形成完整的微流路。图4是图2A中虚线框B部分的放大图。
图4A为平面图，图中所示为微孔板1、微孔9、微槽10，镶嵌在微孔9中的微珠2；
图4B为图4A的A-A剖面图，图中所示为板体3、板盖4、微孔9，镶嵌在微孔9中的微珠2；图中微孔9两端的微槽与板盖形成微管11，将微孔9两两相连，与进液孔5，出液孔6等形成完整的微流路。图5是具有不同微流路的检测板的局部放大图。
图中所示为板体3、微孔9、微槽10，镶嵌在微孔9中的微珠2；图中两个相邻微孔的侧壁上有微管11，其上端的开口与微槽10相通，微槽10与板盖4形成微管11，微管11上下两端的开口将微孔9两两相连，并可与进液孔，出液孔等形成完整的微流路。图6是微珠2的结构示意图。
图6A显示多面体微珠2，通过手臂分子12上的活性基团连接寡核苷酸分子探针14；图6B是用纤维素膜或微孔膜制成的片状微珠2，表面吸附核酸13分子探针。
图6C是多面体微珠2的剖面图，显示多孔结构，微珠2的表面通过带活性基团的手臂分子12连接核酸分子探针13；图6D是球体微珠2的外观结构示意图，表面是手臂分子12上的寡核苷酸14分子探针引物，经PCR延长、扩增反应获得产物25和嵌合分子核酸分子探针23。图7固相PCR制备长链核酸分子探针原理示意图。
图中微珠2的表面是固相合成的或通过带活性基团的手臂分子12连接的寡核苷酸分子探针14。寡核苷酸14分子探针与已知序列的模板27杂交，在DNA聚合酶的催化下延长，获得与模板27碱基序列互补的长链核酸分子23(扩增产物25与寡核苷酸分子14的嵌合分子)；或以寡核苷酸分子探针14为引物与寡核苷酸引物26配对，通过PCR反应扩增，最终在微珠表面获得足量的长链单股核酸分子探针23或双股核酸分子探针28。图8镶嵌式基因芯片核酸分子探针工作原理示意图。
图8A，样品核酸分子24在试管中经标记分子15标记后，与微珠2表面手臂分子12上的核酸分子探针13杂交，未杂交的样品核酸分子经漂洗去除，检测标记物获得分析结果。
图8B，样品中的核酸分子24，24’24”等在试管中经标记分子15标记后，分别与镶嵌在不同微孔中的微珠2，2’2”等表面手臂分子12上的核酸分子探针13，13’13”等杂交，未杂交的核酸分子经漂洗去除，检测标记物获得高通量分析结果。
图8C，在试管中样品中的核酸分子24用5’端带有标记分子15的引物，经至少一个循环的PCR扩增后，扩增产物25与微珠2表面手臂分子12上的核酸分子探针13杂交，未杂交的样品核酸分子经漂洗去除，检测标记物获得分析结果。
图8D，样品中的核酸分子24，24’24”等在试管中用5’端带有标记分子15的引物，经至少一个循环的PCR扩增后，扩增产物25，25’25”等与镶嵌在不同微孔中的微珠2，2’2”等表面手臂分子12上的核酸分子探针13，13’13”等杂交，未杂交的样品核酸分子经漂洗去除，检测标记物获得高通量分析结果。图9是镶嵌式基因芯片寡核苷酸分子探针工作原理示意图。
图9A，样品中的核酸分子24在试管中经标记分子15标记后，与微珠2表面手臂分子12上的寡核苷酸分子探针14杂交，未杂交的样品核酸分子24经漂洗去除，检测标记物获得分析结果。
图9B，样品中的核酸分子24，24’24”等在试管中经标记分子15标记后，与镶嵌在不同微孔中的微珠2，2’2”等表面手臂分子12上的不同核酸分子14，14’14”等杂交，未杂交的样品核酸分子可经漂洗去除，检测标记物获得高通量分析结果。
图9C，在试管中，样品中的核酸分子24用5’端带有标记分子15的引物，经至少一个循环的PCR扩增后，扩增产物25与微珠2表面手臂分子12上的寡核苷酸分子探针14杂交，未杂交的样品核酸分子可经漂洗去除，检测标记物获得分析结果。
图9D，在试管中，样品中的核酸分子24，24’24”等用5’端带有标记分子15的引物，经至少一个循环的PCR扩增后，扩增产物25，25’25”等与2，2’2”等微珠表面手臂分子12上的寡核苷酸分子探针14，14’14”等杂交，未杂交的样品核酸分子经漂洗去除，检测标记物获得高通量分析结果。
图9E，样品中的核酸分子24与微珠2表面的寡核苷酸分子探针14杂交；以样品中的核酸分子为模板，微珠2表面的寡核苷酸分子探针14和5’端带有标记分子15的寡核苷酸26为引物，经至少一个循环的PCR扩增后，扩增产物25与微珠2表面手臂分子12上的寡核苷酸分子探针14或寡核苷酸引物26形成嵌合分子，未杂交的样品核酸分子经漂洗去除，检测标记物获得分析结果。
图9F样品中的核酸分子24，24’24”等与检测板中微珠2，2’2”等表面的寡核苷酸分子探针14，14’14”等杂交，以样品中的核酸分子为模板，以微珠2表面的寡核苷酸分子探针14，14’14”和5’端带有标记分子15的寡核苷酸26，或/和26’26”等为引物，经至少一个循环的PCR扩增后，扩增产物25，25’25”等与微珠2表面的寡核酸分子探针14，14’14”等，寡核苷酸26或/和26’26”等形成嵌合分子，未杂交的样品核酸分子经漂洗去除，检测标记物获得高通量分析结果。
图10固相PCR扩增长链核酸分子探针工作原理示意10A和图10B在试管或在检测板中，以已知序列的核酸分子27为模板，微珠2表面的寡核苷酸分子探针14和寡核苷酸26为引物，经至少一个循环的PCR延长、扩增后，扩增产物与微珠2表面的寡核苷酸分子探针14或寡核苷酸26嵌合，形成的单链嵌合分子23或双链的嵌合分子28，被固定在微珠2的表面；样品中的核酸分子24经标记，或用5’端带有标记分子15的寡核苷酸分子引物经至少一个循环的PCR扩增，产物25与微珠2表面的嵌合分子23或28杂交，未杂交的样品核酸分子经漂洗去除，检测标记物获得分析结果。
图10C和图10D在试管或在检测板中，以N个已知不同序列的核酸分子27，27’27”等为模板，微珠表面的不同寡核苷酸分子探针14，14’14”和寡核苷酸26或26’26”等为引物，经至少一个循环的PCR延长、扩增，获得的扩增产物与微珠2表面的寡核苷酸分子探针14，14’14”或寡核苷酸26或26’26”嵌合，形成不同的单链嵌合分子23或双链的嵌合分子28等固定在微珠的表面；样品中不同的核酸分子24，24’24”等经标记，或用5’端带有标记分子15的寡核苷酸分子引物经至少一个循环的PCR扩增的产物25，25’25”与微珠2，2’2”表面的不同嵌合分子23或28杂交，未杂交的样品核酸分子经漂洗去除，检测标记物获得高通量分析结果。图11酶标记法技术原理示意11A，样品中的核酸分子24经生物素分子(30)标记后，与微珠2表面手臂分子12上的核酸分子探针13杂交，未杂交的样品核酸分子经漂洗可去除，加入酶(18)标记的亲合素或链亲合素(31)与生物素(30)结合，未结合的酶标记物经漂洗去除；在酶(18)的催化下，加入的底物(19)生成有色产物或发光产物(32)，检测各孔有色产物或发光产物的有无及颜色的深浅或发光的强弱，获得分析结果。
图11B，样品中的核酸分子24经生物素分子(30)标记后，与微珠2表面的核酸分子探针13杂交，未杂交的样品核酸分子经漂洗可去除，加入酶(18)标记的抗生物素抗体(33)与生物素(30)结合，未结合的酶标记抗体经漂洗去除；在酶(18)的催化下，底物(19)生成有色产物或发光产物(32)，检测各孔有色产物或发光产物的有无及颜色的深浅或发光的强弱，获得分析结果。图12核酸-蛋白质相互作用检测分析原理图12A，样品中的蛋白分子34经荧光素分子(15)标记后，与微珠2表面的核酸分子探针13或寡核苷酸14结合，未结合的样品蛋白分子经漂洗去除，检测荧光的有无及强弱，获得分析结果。
图12B，样品中的蛋白分子34经生物素分子(30)标记后，与微珠2表面的核酸分子探针13或14结合，未结合的样品蛋白分子经漂洗去除，加入酶(18)标记的抗生物素抗体(33)与生物素(30)结合，未结合的酶标记抗体经漂洗去除；在酶(18)的催化下，底物(19)生成有色产物或发光产物(32)，检测各孔有色产物或发光产物的有无及颜色的深浅或发光的强弱，获得分析结果。
本发明在实施中的基本操作步骤和方法如下一.检测板的制备检测板的制备方法包括以下基本方法和步骤1.表面处理微孔板和微珠的表面处理因所选材料的不同而略有不同，每种材料其具体处理方法和条件都有多种，本发明在此将《生物分子固定化技术及应用》(蒋中华等，1998年，化学出版社)及中国专利号为01207812.3和申请号为00120798.9的专利为主要参考文献。运用公知的各种生物大分子固相化技术，处理各种材料的微珠和微孔板，使其表面带有特定的活性基团，与核酸分子上的活性基团反应，而具有特定的吸附能力。如用2％丙氨基-三乙基硅烷无水丙酮溶液(APES，3-Aminopropyltriethoxysilane，Sigma公司，目录号A3648)处理的多孔玻璃微珠(Weetall，H.H.，Biochem.Biophys.Acta，1970；2121)。或商售的经表面处理的各种层析基质(如溴化氰活化的Sepharose-4B)，寡核苷酸固相合成用的聚苯乙烯珠或控孔玻璃珠(美国应用生物系统公司，Sigma公司)等。
微孔板也可依据实验要求做不同的表面处理。如进行硅化处理或泰富隆(Teflon)涂层处理，仅仅作为反应容器或微流路，以减少实验中的非特异性吸附。2.固相涂层将不同的核酸分子分别与微珠或微孔板表面的活性基团连接，或在微珠或微孔板表面进行原位固相合成以获得不同核酸分子的表面涂层。表面涂层的获得方法主要是①修饰连接。利用固相表面手臂分子上的活性基团将核酸分子或寡核苷酸分子通过化学键连接在固相基质表面；②固相合成。运用固相化学合成技术，直接在微珠表面进行寡核苷酸分子的固相合成(Edge R.Wang等，1998，核酸探针的合成、标记及应用，科学出版社)；合成反应可以在试管中或装填于合成仪的专用柱体中进行，也可以在微孔板中进行；③PCR固相扩增。以已知序列的核苷酸分子为模板，将其成对引物中的一个引物连接在微珠上，或以固相合成的寡核苷酸分子为引物进行PCR扩增，扩增产物通过固相化的引物连接并固相化在微珠或微孔的表面，扩增时可分别在不同的试管中同时进行不同的或相同的模板扩增，也可在微孔板中同时进行不同的或相同的模板扩增；3.镶嵌微珠人工或用全自动机械手系统，将固相涂层处理的微珠按一定顺序分别嵌入微孔板的各个微孔中，各微孔中的微珠具有不同的结合特性；在蜂巢式微孔板中，微珠也可具有相同的结合特性，以便对不同的样品标本同时进行相同的检测分析。4.封盖使微孔、微槽与进/出液孔形成微流路，并只能通过进/出液孔与外界相通。5.封闭经进/出液孔用封闭缓冲液以封闭去除微珠、微孔板或微流路等表面可能残留的活性基团或非特异性结合位点，以减少检测中可能出现的非特异性结合。由此即获得能与化学分子、生物分子、抗体和/或抗原，酶、核酸或寡核苷酸分子等特异性结合，并可用于对结合物进行检测的三维立体镶嵌式高通量基因芯片。常用的封闭液添加剂有鲑精或酵母DNA聚蔗糖、肝素、聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白(0.5-5％)、脱脂奶粉(0.1-6％)、酪蛋白(0.5-2％)、白明胶(0.1-0.5％)，正常动物血清(0.5-5％)和去垢剂等(如Tween 20，NP40，Triton X-100、SDS)等。但蜂巢式检测板无微管、微槽或也无进/出液孔，需封盖前封闭，使用时揭掉粘封的盖膜或除去板盖即可使用，漂洗方式采用浸洗。二.样品的检测分析 样品的检测分析一般包括以下基本步骤和方法1.样品的制备根据检测目的的不同，生物样品在检测前将分别进行不同的处理。常见样品处理方法包括①核酸提取物用DNA或RNA抽提液处理各种生物样品、生物体液或标本以提取样品中的DNA或RNA等；②蛋白等生物成分提取物用组织细胞裂解液配合匀浆或超声粉碎等处理使组织细胞裂解获得真性蛋白溶液或生物样品、生物体液或生物标本等的分离提取物；③人工合成产物运用各种人工合成技术获得的药物前体、先导化合物以及多肽合成仪、核酸合成仪等的合成产物等；④反转录合成cDNA；⑤PCR或RT-PCR扩增。2.样品的标记①直接标记。运用公知的生物分子标记技术，分别用生物素、酶、荧光素、胶体金、同位素或稀土离子及其螯合剂等物质或其衍生物等标记分子作为指示剂直接标记样品或生物标本；②采用间接标记。运用生物分子的相互作用，用标记分子的标记产物(如荧光抗体，生物素-HRP等标记物)标记样品；③掺入标记，运用各种合成技术，如固相合成技术、PCR扩增等将标记分子或标记物掺入被标记分子中。3.加待检样品①将样品或处理样品经进液孔加入检测板中，使之与各孔中的微珠表面已固相化的不同核酸分子或寡核苷酸分子等杂交或结合。被检样品中与互补或对应的生物分子被固相捕获或特异结合，剩余的和未结合的部分经出液孔流出检测板。②将寡核苷酸引物、dNTP，可掺入标记物和耐热DNA聚合酶等与微量的核酸样品加入微孔板中，进行至少一个循环的PCR或RT-PCR扩增反应。4.漂洗借助检测板的微流路，用洗液流洗，蜂巢式检测板可经进/出液孔流洗或通过视窗(22)浸洗，以去除检测板中残留的被检样品(未结合物或称游离物)或标记物等。5.结果分析根据标记分子的不同，目测或用扫描仪等仪器观察并记录各孔反应的有无以及强弱(如生成产物颜色的深浅、胶体金沉积、荧光强度、放射强度等的强弱变化)。对照微珠的排列位置，借助计算机分析即可以确定该样品中，被检测物的组成以及各组分的含量，核酸序列，蛋白结合或识别的核酸序列。但是在标记物为蛋白酶时，操作中必须增加添加底物等操作步骤才能观察检测结果，其检测结果为呈色反应或发光反应。
本发明在实施中，上述操作步骤依据固相探针、被检测物、标记物和显示结果等的不同，可有多种不同的组合方式。各种生化反应可在微孔板中进行，也可部分或全部在试管中进行。在微孔板中进行时，各微孔中镶嵌的微珠表面分子涂层可以相同(蜂巢式微孔板)，用于检测不同样品中的相同成分；也可以不同，用于对同一样品中的不同成分进行高通量的检测分析。
下面结合实施例对本发明做进一步的说明。实施例I镶嵌式高通量基因芯片在预防先天畸形和宫内感染中的应用。
风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、柯萨基病毒、弓形体是引起宫内感染并导致胎儿畸形的主要病原体；乙肝、梅毒和艾滋病等是可以通过垂直传播引起新生儿感染的传染性疾病的病原体。对育龄和妊娠妇女开展上述病原体感染的检测诊断是预防先天性畸形和新生儿感染的重要手段，在实施中的具体操作步骤如下1.微珠的制备①寡核苷酸探针微珠的制备将病原微生物特异核酸分子探针的PCR扩增引物通过固相合成分别连接在微珠的手臂分子上，获得具有不同互补序列的寡核苷酸分子表面涂层。
②核酸探针微珠的制备将上述病原微生物的特异核酸分子探针分别连接在微珠的手臂分子上，获得具有不同互补序列的分子表面涂层。
③PCR扩增以微珠手臂分子上固相合成的寡核苷酸分子为引物，病原微生物特异核酸分子探针为模板，通过PCR扩增反应，获得具有不同互补序列的核酸分子探针表面涂层。2.检测板的制备从进液孔端开始，将上述封闭处理的微珠依序嵌入微孔板的微孔中，加盖封板。经进液孔加入预杂交液封闭非特异性结合位点。3.检测样品待检者血清加入核酸抽提液，提取病原体核酸，以多对末端带有标记分子的病原微生物特定序列的寡核苷酸分子为引物；①核酸提取物经进液孔加入检测板中，与微珠表面固相化的寡核苷酸分子杂交；核酸提取物作为模板在检测板中进行PCR扩增和掺入标记；②核酸提取物作为模板，在试管中进行PCR扩增和掺入标记，去除残留的引物、dNTP等，经进液孔加入检测板中，与微珠表面固相化的核酸分子杂交；流洗去除未结合的及非特异性结合的杂质等。4.观察结果检测板置荧光显微镜或扫描仪分析结果。阳性孔表示有感染，处于带毒状态，有传染性，不宜妊娠。实施例II镶嵌式高通量基因芯片在细胞差异表达研究中的应用。1.微珠的制备
①寡核苷酸探针微珠时制备用核酸固相合成仪，以mRNA起始密码加其后面的3-12个随机碱基N的方式，在微珠表面合成一套PCR扩增引物。通过这种合成方式，根据起始密码后面所加的碱基长度，就可以将扩增的总mRNA分成4n个组别，如有8个碱基的寡核苷酸可有45个不同序列的寡核苷酸分子，并可获得45种具有不同互补序列的寡核苷酸分子表面涂层的微珠。2.检测板的制备从进液孔端开始，将上述4n种合成微珠微珠依序嵌入微孔板的微孔中，加盖封板。经进液孔加入预杂交液封闭非特异性结合位点，就可获得已知起始密码端部分碱基序列的寡核苷酸基因芯片检测板。3.检测样品待检样品加入核酸抽提液，提取mRNA。以oligo dT后面加1-8个随机碱基N为引物，每一位上的随机碱基N除oligo dT后的第一位不能有T外，均可分别为A，T，G，C四种不同碱基的同位排列，如以12个胸腺嘧啶核苷后面加2个随机碱基的寡核苷酸分子为第二引物，oligo dT后面第1和2位的NN碱基排列为dT-AA，dT-AC，dT-AG，dT-ATdT-CA，dT-CC，dT-CG，dT-CTdT-GA，dT-GC，dT-GG，dT-GT由此可获得12种不同排列的通配引物。用以此方式获得的带有末端荧光标记的oligodT引物对提取的mRNA进行反转录，然后再以所得到的cDNA为模板，以同样的oligo dT和微珠表面的寡核苷酸分子为引物，加入检测板中进行PCR扩增，为保证流洗去除残留的引物、dNTP，未结合的及非特异性结合的杂质等。4.观察分析结果检测板置荧光显微镜或扫描仪检测分析各孔荧光的有无和强弱，并与不同来源的样品作比较，就可以发现差异表达的基因。5.克隆与测序对照差异表达基因在检测板中的位置可以查知起始密码端的核酸碱基序列，通过PCR扩增获得差异表达的基因克隆，并可进一步测序。实施例III镶嵌式高通量基因芯片在核酸-蛋白质相互作用研究中的应用。
用寡核苷酸筛选核酸结合蛋白、细胞生长因子、激素小肽等生物活性分子已经在基础医学、临床诊断及药物筛选等方面得到广泛应用。运用本发明所述的基因芯片技术，以控孔玻璃或聚苯乙烯等固相合成专用基质为镶嵌微珠，应用固相寡核苷酸合成技术很容易构建库容足够大，序列确定的单链寡核苷酸文库，而每个微珠表面所结合的该种寡核苷酸分子的绝对数量远大于光控标址并行合成技术。1.微珠的制备按需要在固相合成专用基质上合成特定序列的单链寡核苷酸分子，建立组合化学寡核苷酸微珠库2.检测板的制备
从进液孔端开始，将寡核苷酸微珠依序嵌入高密度微孔检测板的微孔中，加盖封板，经进液孔加入封闭液，获得单链寡核苷酸文库基因芯片检测板。3.检测样品组织、细胞、细菌、病毒或噬菌体等或经裂解处理的蛋白抽提液，用直接标记技术或间接标记技术进行标记后，取适量经进液孔缓慢加入检测板中，孵育，流洗以去除残留的或非特异性结合的杂质。4.观察结果扫描仪分析结果，①比较不同流洗条件以及竞争结合物或拮抗剂对各阳性孔结合强度及结合量的影响，并给出各孔寡核苷酸的碱基序列；②比较不同来源或经不同处理的组织、细胞或细菌等的蛋白质结合谱，分析差异谱带与结构、功能、基因调控或与疾病等的关系。5.质谱分析对分析中感兴趣的反应孔，取出相应的微珠置微量反应试管中，加入解吸附液，然后取适量进行质谱分析以测定蛋白质的分子量；或在原反应孔中加入胰蛋白酶(蛋白质水解酶)，室温或37℃反应2-6小时或消化过夜，取适量点样进行质谱分析，获得蛋白指纹图谱，通过计算机检索以分析蛋白质的氨基酸顺序。6.蛋白质磷酸化分析取适量酶水解液，加入适量体积的细菌碱性磷酸酶(溶于HEPES 20mmol/L，pH7.0，含NaCl 150mmol/L，0.1％Triton X-100，10％甘油)，30℃反应60分钟，取适量进行质谱分析；或将复孔中的微珠取出置微量反应试管中，加入磷酸酶，待反应彻底后加入解吸附液，然后取适量进行质谱分析，对照未经磷酸酶处理的微珠分析结果，以测定和分析蛋白质有无磷酸化以及磷酸化的可能部位。7.蛋白质糖基化分析将微珠取出置微量反应试管中或在原孔中，加入PNGase试剂(溶于Tris-HCl缓冲液中，20mmol/L，pH7.2，含50mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA)适量，37℃反应60-120分钟，取适量进行质谱或色谱分析，以测定和分析蛋白质有无糖基化及糖基化的程度。8.蛋白质等电点和分子量测定取适量细胞裂解液，根据步骤4的分析结果，与对应微珠反应，充分漂洗后，分装于不同的微量试管中，分别加入专用等电聚焦和SDS-PAGE电泳样品缓冲液，取出适量分别电泳，以测定等电点和分子量。9.基因克隆以该寡核苷酸分子为特异性引物，应用PCR技术进行上下游核酸片段的扩增，以克隆全长或长链核酸分子片段。
本发明把固相合成技术和吸附层析、毛细管电泳等分离技术与生物芯片等分析技术相结合，是一种全新概念的生物学分析检测技术，集数种技术的优点于一身，具有信息量大、定量准确、灵敏度高、制造成本低，用途广等突出优点，可广泛用于生物学、医学、药物学，环境科学等领域。
权利要求
1.一种可检测样品中的核酸、蛋白与化学分子的镶嵌式高通量基因芯片检测技术及试剂盒的制备方法，该技术和试剂盒至少包括下述成分或步骤①一种检测板由微孔板和微珠组成；微孔板由板体、板盖、微孔和微流路等结构组成；微珠通过手臂分子上的活性基团连接不同或相同的核酸或寡核苷酸分子探针形成表面分子涂层，并按一定的顺序镶嵌在不同的微孔中；②样品经过处理或不经处理直接由进液孔进入微孔板，流经微孔时与微珠表面连接的各种核酸分子相互作用，被检分子与固相分子杂交或特异性结合；未结合的样品成分经出液孔流出；③标记被检样品；④漂洗；⑤目测或用扫描仪等对各微孔中标记分子的有无、强弱或含量进行检测和分析；⑥标记物为酶时，观察结果前需加入底物。
2.根据权利要求1所述的微孔板由板体、板盖、微孔和微流路等结构组成；板体和板盖为任何可加工成型的、透光的、不透光的或反光的硬质或软质材料，可加工成方形、长方形、园盘型或其它外观形状；在板体和板盖上可分别具有微孔、微流路、驱动孔、定位孔和视窗等部分或全部结构；微孔按一定的格式排列，通过微流路与外界相通或形成闭合环路。
3.根据权利要求1所述的微珠是由任何可加工成型的材质，经加工而成的，大小均一、具有不同外观形状的多孔或实心体；微珠经表面处理可获得带有不同活性基团的手臂分子；手臂分子上的活性基团可进一步与不同的核酸或寡核苷酸分子探针等连接，获得具有不同结合特性的表面分子涂层。
4.根据权利要求1所述的微流路由进液孔、出液孔、微槽或/和微管、密封圈、蠕动管等结构组成，可分别位于板体或板盖上，也可全部位于板体或板盖上；微流路通过微槽或/和微管与微孔相连，并通过进液孔和出液孔与外界相通；蠕动管位于进液孔和出液孔之间，将微流路连接成闭合环路；蠕动管可位于检测板上也可以外置；蜂巢式微孔板可无微槽和微管，或也无进/出液孔等微流路结构；微流路经表面处理可获得不同的惰性表面涂层。
5.根据权利要求1和权利要求3所述的表面分子涂层，是指通过手臂分子上的活性基团，分别连接的具有不同序列和长度的核酸分子或寡核苷酸分子探针，在微珠和微孔的固相基质表面形成的具有一定结合特性的表面分子；分子涂层的种类和制备方法至少包括①通过DNA合成仪直接在微珠的固相基质表面合成，获得连接寡核苷酸分子探针的表面分子涂层；②通过手臂分子上的活性基团，连接各种不同序列的核苷酸或寡核苷酸分子探针；③以微珠表面的寡核苷酸分子探针为特异性引物，已知序列核酸为模板，在试管或微孔板中通过聚合酶链反应(PCR)延长寡核苷酸链并进一步扩增，获得长链核酸分子探针表面分子涂层。
6.根据权利要求1和权利要求5所述的样品和长链核酸分子探针，可用寡核苷酸引物，通过至少一个循环周期的PCR反应进行延长或扩增；延长或扩增反应可在微孔板中也可在试管中进行，引物均可溶于液相中，或通过手臂分子连接在微珠等固相基质表面；PCP反应循环周期包括a)热变性；b)退火，引物与模板或样品中的靶核苷酸杂交；c)用DNA聚合酶延长靶核苷酸链序列。
7.根据权利要求1所述的标记是指，用荧光染料、酶类、生物素、半抗原、胶体金、同位素、稀土离子及其螯合剂等标记分子或其衍生物直接标记样品；或用能与样品中被检物特异性结合的标记物标记样品；标记反应可在试管中进行，也可以在微孔板中进行。
8.根据权利要求1所述的检测方法，可采用下述方法进行定量分析在同一块微孔板上连接相同序列核酸分子的微孔或镶嵌微珠的微孔数量可有1个或1个以上的复孔；当样品逐孔流经各微孔及其复孔时，对应的被检测物被不断结合，并不断地从标本液中去除，因此，各微孔及其复孔的结合量，因前后排列顺序的不同逐渐减少；根据各微孔与复孔反应的有无与强弱变化，即可进行定量分析；在进行定量分析时，可按此方法设定标准参照物，借助计算机分析绘出标准参照物浓度-反应孔数量及其强弱变化曲线，对照标准曲线结合标本体积，获得定量分析结果。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，至少装有一块检测板，微孔中至少镶嵌一粒微珠，微珠表面分别连接某种特定序列的核酸分子，并与下述成分分别或共同组成不同的试剂盒①至少有一管为样品处理液；②至少有一管为dNTP、引物和用于PCR扩增的热稳定的DNA聚合酶；③至少有一管为dNTP和反转录酶；④至少有一管为含标记分子或标记物的标记试剂；⑤在标记物为酶类时，至少有一种显色底物或发光底物；⑥至少有一管为洗涤液或其浓缩液；⑦至少有一管为蛋白质浓度检测分析试剂；⑧至少有一管为核酸内切酶或蛋白水解酶；⑨至少有一管为电泳样品缓冲液；⑩至少有一管为蛋白质糖基化或蛋白质磷酸化分析试剂；
10.根据权利要求1和权利要求9所述的检测方法和试剂盒，可以用试剂盒中的试剂通过下述不同的方法对微孔板各不同孔所结合的样品成分分别做基因克隆、质谱分析、序列测定、蛋白质磷酸化、糖基化或电泳等进一步分析前的处理(1)直接在感兴趣的微孔中加入PCR试剂或核酸内切酶、蛋白水解酶、磷酸酶或电泳样品缓冲液、蛋白质糖基化等分析试剂，对结合物在原位做进一步分析前的样品处理；(2)将微孔中的微珠取出，在微量反应器中加入PCR试剂或核酸内切酶、蛋白水解酶、磷酸酶或电泳样品缓冲液或蛋白质糖基化分析等试剂做进一步分析前的样品处理；(3)将新鲜样品分别与感兴趣微孔的复本微珠共育，以同样的条件重复微孔板的操作步骤，将样品中感兴趣的物质成分吸附在微珠上，充分漂洗去除未结合的样品混合物，加入PCR试剂、核酸内切酶或蛋白水解酶、磷酸酶或电泳样品缓冲液或蛋白质糖基化分析等试剂，对结合物做进一步分析前的样品处理。
全文摘要
本发明公开了一种镶嵌式高通量基因芯片检测技术及试剂盒的制备方法，该技术灵敏快速、信息量大，制造简便、成本低，可对样品中多种不同的核酸、蛋白和化学分子等同时进行检测分析。主要特征在于将连接不同序列核酸分子的微珠，分别镶嵌在检测板的不同微孔中，微孔间有微管相连，并同进/出液口形成微流路与外界相通，样品经微流路可与微珠表面的核酸分子杂交或结合。检测结果可用目测或仪器记录分析。本发明可广泛地用于环境检测、医药研究、疾病诊断基因组·/蛋白质组学和分子文库等领域的研究与开发。
文档编号C12Q1/68GK1464071SQ0212377
公开日2003年12月31日 申请日期2002年6月27日 优先权日2002年6月27日
发明者赵翀 申请人:赵翀