专利名称：定点插入和/或敲除真核细胞基因的方法及其专用载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域中插入和/或敲除基因的方法，特别是涉及一种在真核细胞中定点插入和/或敲除基因的方法。
背景技术：
利用体细胞转基因技术进行细胞治疗、细胞学研究、转基因动物生产、基因功能探讨等研究与应用，已经成为现代生物技术领域的重要组成部分。无论在基础理论研究和生产推广等方面都具有重要的作用和巨大的商业价值。
1983年世界上第一只转生长激素基因的转基因小鼠诞生，转基因阳性小鼠的体重达到了同窝非转基因小鼠的2-3倍，在《Nature》杂志上发表后，立即引起了学术界的广泛关注，此后转基因技术得到了迅速发展，制备了转基因牛、羊、猪、鸡和鱼等动物，植物转基因发展更快，现在已有产品进入了产业化，开发出了许多特殊的转基因产品。
转基因动物的生产主要利用显微注射法，但该方法存在着以下几个缺陷1、外源基因整合效率低，一般只为3-5％；2、外源基因在基因组内的整合是随机的，有时整合在重要基因内部造成早期死亡；3、多拷贝的串联重复，常常产生异染色质区；4、插入位点的不确定性和位置效应使基因的表达水平很难控制，表达量往往很低。因此使得转基因动物的生产成本较高，规模化生产也非常困难。目前，虽然又开发出了病毒载体法、单精注射法等转基因方法，但效果均不为人所满意。
1997年第一只克隆羊的诞生开辟了体细胞脱程分化的篇章，掀起了动物克隆的研究浪潮。利用体细胞克隆可以1、保存稀有动物物种，维护物种的多样性；2、迅速扩繁优良家畜个体，建立优良的种群；3、进行转基因动物研究，生产转基因个体。开发动物乳腺生产人类所需的药用和营养蛋白，改造动物的遗传组成，提高生产性能。
利用体细胞克隆结合转基因技术可做到定点整合、使外源基因为单拷贝、防止串联重复、提高表达水平、整合效率可以达到100％，降低了生产成本，加大了推广的可能性。但利用体细胞克隆进行转基因时重要的是选择良好的外源基因整合位点、即使转基因造成异常后也不会影响动物的生长发育繁殖等生存性状、位于常染色质区、有利于外源基因的表达、容易获得高效表达。
抑肌素(Myostatin)基因是生长发育的负调控因子，将该基因剔除后所产生的突变型纯合子表现出了骨骼肌明显增加和增生，达到了正常个体骨骼肌重量的2-3倍，而且可以进行正常的生长和繁殖，产生纯合与杂合的后代。
作为转基因载体，要有明显的标记、易于体外筛选、容易克隆、没有毒副作用，并可产生转基因克隆个体。目前进行同源重组的标记基因主要利用新霉素抗性基因、绿色荧光蛋白基因和胸苷激酶基因，并已经形成了商品化产品。
细胞或组织培养是从1912年开始的，通过培养可以了解细胞组成和形态变化及各种理化性质，研究化学和生物制剂对细胞的作用，比较正常和异常细胞的形态，染色体异常以便确定适用的药物。细胞培养是一个重要的过程和手段。所用培养液一般为TCM199等合成液。小鼠细胞可体外培养稳定传代50-100代，家畜一般为30代，以后由于生长控制因子缺陷和染色体的突变或缺失，使细胞癌化，不能继续传代。
发明内容
本发明的目的是提供一种在真核细胞中定点插入和/或敲除基因的方法。
一种在真核细胞中定点插入和/或敲除基因的方法，是以抑肌素(Myostatin)基因的DNA全序列或片断为目标，与欲插入的基因形成同源重组载体的两个侧臂，并与标记基因连接后，转染真核细胞，筛选得到同源重组的转基因阳性细胞。
所述目标基因可以是抑肌素5’调控区和3’非翻译区的全部基因组序列，也可以是抑肌素基因DNA序列的片断，例如序列表中序列1、序列2、序列3或序列4，其中，序列1为绵羊外显子I和II的部分序列，以及内含子I的全部序列，共计2055个碱基；序列2为绵羊外显子II和III的部分序列，以及内含子II的全部序列，共计2603个碱基；序列3为山羊外显子I和II的部分序列，以及内含子I的全部序列，共计2041个碱基；序列4为山羊外显子II和III的部分序列，以及内含子II的全部序列，共计2584个碱基。
所述标记基因为绿色荧光蛋白(GFP)、新霉素抗性基因(noer)和胸苷激酶基因(tk)中的一种或几种。
所述转染细胞的方法为磷酸氢钙法、电转染法、脂质体法或显微注射法。
本发明的第二个目的是提供用于定点插入和/或敲除基因的位点的专用载体。
一种用于在真核细胞中定点插入和/或敲除基因的载体，它基本上由抑肌素基因的DNA全序列或片断及标记基因组成。
利用本发明的方法得到的转基因真核细胞，可以是动物体细胞或生殖细胞。这些细胞可用于进行细胞学、细胞治疗、基因功能、转基因等方面的研究与开发。
本发明巧妙地选择了抑肌素(Myostatin)基因作为新基因插入的位点，进行定点重组转基因，使外源基因整合的效率大大提高，新基因的插入位点得到了有效控制，避免了异染色质区的出现，操作简单，可用于规模化生产。
在体细胞转基因过程中，采用磷酸氢钙法、电转染法和脂质体包埋法进行转染，定点重组的效率达到了5×10-4。转基因体细胞的传代达到了13代且没有出现细胞形态和染色体的异常，可满足细胞治疗、细胞学研究和动物克隆的要求。
下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步说明。
图1为本发明转基因同源重组载体结构示意图。
具体实施例方式
实施例1、Myostatin基因的序列测定用常规方法提取基因组DNA，PCR扩增绵羊和山羊Myostatin基因的内含子及外显子序列，利用ABI 377 DNA序列测定仪进行序列测定，获得绵羊外显子I和II的部分序列，以及内含子I的全部序列(序列表中的序列1)，共计2055个碱基；绵羊外显子II和III的部分序列，以及内含子II的全部序列(序列表中的序列2)，共计2603个碱基；山羊外显子I和II的部分序列，以及内含子I的全部序列(序列表中的序列3)，共计2041个碱基；山羊外显子II和III的部分序列，以及内含子II的全部序列(序列表中的序列4)，共计2584个碱基。
实施例2、基因克隆载体的选择及转基因结构的建立如图1所示，选择具有表达新霉素抗性基因(noer)、胸苷激酶基因(tk)和绿色荧光蛋白(GFP)基因、复制原点、氨苄青霉素抗性基因(Amp)的结构为同源重组的基本框架载体。在新霉素抗性基因(noer)的5’和3’端为不同的多克隆位点，用以插入同源重组的两个侧臂。图1中，1为复制原点；2为5’臂；3为noerror GFP；4为3’臂；5为tk基因。
重建结构的扩增、鉴定与纯化过程是同源重组两个侧臂的扩增与连接利用5’同源臂上游ATGCGGCCGCTATAAAAGATTCACTGGTGTGG (13BP)下游TAACTCGAGTGGTGGCTAAATATGTCTGATG (4358BP)3’同源臂上游TACTCTAGAAAGATATAAGGCCAATTACTGC (4929BP)下游TAATCGATAGCCATCATGAATCCATAAGTG(6303BP)分别扩增山羊、绵羊和奶牛的基因组，获得含有Myostatin基因的外显子I、内含子I、外显子II、内含子II和部分外显子III的近4.5kb的5’同源臂；包括外显子III部分序列和3’非翻译区大约1.5kp的3’同源臂。采用常规的方法进行结构的组装。
利用该方法已经制备成功敲除抑肌素基因的同时插入α抗胰蛋白酶基因(mAAT)的转基因结构。经检测序列正确。
实施例3、真核细胞系的建立和转染利用磷酸氢钙法、电激转染法或脂质体包埋法将带有外源DNA(含绿色荧光蛋白、敲除抑肌素基因的转基因结构、α抗胰蛋白酶基因)的转基因载体转入真核细胞内，借助G418和GANC以及荧光显微镜筛选同源重组的阳性细胞，建立转基因细胞系，所建立的细胞系具有分泌α抗胰蛋白酶的功能。所得到的细胞系可以进行克隆或细胞分化的研究与应用。
实施例4、转基因真核细胞的筛选与鉴定提取扩增的转基因细胞的基因组DNA，通过Southern和PCR方法鉴定转基因阳性细胞。PGR检测的具体引物为上游 5’-CAG GAG GAG GAT TAG CAA ATT GT-3’共同的引物(5’臂上)。
下游15’-TCC CAT CCA AAA GCT TCA AAA TC-3’抑肌素基因内部引物。
下游25’-CCA GAC TGC CTT GGG AAA AGC-3’新霉素基因内部引物。
实施例5、转基因细胞的保存、克隆动物制备、细胞分化与检测对同源重组基因敲除并插入新基因的细胞系进行液氮深度冷冻保存，或直接做体细胞克隆及细胞分化研究。体细胞克隆的方法主要是对体外成熟的卵母细胞去核，利用显微注射法将转基因细胞注入去核卵母细胞内，经过融合和激活过程形成两细胞或囊胚，然后冷冻或直接进行胚胎移植获得克隆转基因个体，得到特定转入基因产物，生产出药品或营养品。
实施例6、定点敲除基因利用抑肌素基因的蛋白结构，设计相应的同源臂，使其羧基端成熟区段形成移码突变，造成抑肌素基因功能的缺失，产生敲除效果。在所设计的两个同源臂中间加入新霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因，转染细胞系，经过药物筛选和荧光检测、DNA分析，确定为同源重组敲除的转基因细胞系。
序列表<160>4<210>1<211>2055<212>DNA<213>绵羊属绵羊种(Ovis Ovis aries)<400>1aaacaatcat taccatgccc acggagtgtg agtagttctg ctagtgcaga gcaacgactc 60tgctgactgc tgttctagtg ttcatgagaa accgatctat tttcaggctc ttttaacaag 120ctgctggctt gtacgtaagg aggagggcaa agagcttttt gcaagacttc atgagaaata 180tgctaatgag actgaaagct gctacattat ctgtttcctt agagagctaa aaagctaaaa 240atcagaaatg aaatgcttgc atagcatcca tgttatatag tttagtatga caactataac 300atgtttatgt tttcacagct taatgctacc aaggtgaagg attgggagac agtagcagcc 360atgtgaaaaa tttacatgaa atttcctaat tgcatttggt tgcctgaaat atgcatttat 420aataacaggg tttttttcac taataaaaga gaaaggaaga nctctctaga tgttgaagcc 480tatttgggca tttgctgaac acttagaatg acttctgtta ttcaaaacta tttctcatag 540ggtttttatg ttcttcatag agtatctgat tttgaaagca attacagtga aaaggataaa 600aaaatgttct taataaactt aatgtattag taagagcaat aaggaagtaa acacagcata 660atgataaatc atgagccaat gagcagaaaa tgctaagaaa taaacatttt aattgagtag 720gttatggctt acaaagtccc acttataccc tgaccatggt actattgttg agagtacctg 780gtctgcacat atctaggagg cacatgctta ataaccttct aaaatattat ttgattcctc 840ataggaggga gaactattac ctgtatgtag tatctatatt gtttctgaaa gataatatgt 900ttcatatatt tctgttgcag tcagttcaaa catatactca aggaaaggga gacaggcacc 960tcaacagaga aagcatgacc aggaagattt ttgtgccgtg tgtctgcaaa ctggctttat1020gctacccact ttagactgga ctcagaacag tttcaaaata ctggttttct tattaagtaa1080ctaggttata aggcaacaaa caaatttcct ttaagactgt gctatcagat aatcctggaa1140tagatttgcc ttatttataa acaatcttga gaaaacaaaa aggcaagaaa ttgctaagtg1200cttctgctta caatgacagt ctgaccctaa agacagtgtt ttctaggttt tgaaacagct1260tgaatacaac atcgaaattt tggtgccaat tacctgctag tttttaaatt ttttttcctt1320taaaaggctg tcccagcgcc ctaacataac agatgcacta tattttctac taattcccga1380ggctcagtta gttgctcact gtgtcttgtc cccaggtaat tcaggcctgg gggaagggtt1440ccttcctcca gactgattgg tacagctgct cagtaagtgt aactactcag attcccaaag1500aattctaagt ggatgttctt ccacagtgtc tcttgttctc tctaatcatc atcattttaa1560aatttcatcc acttttcatt ccttaataga attttcctta gtccacagtt ctctggaaag1620gaagtaggct gctcataaac agctgaaaaa acatatacct aaaagatttt gacaagctgt1680aataattgtt atacttgata ttttgctgtt atgaatgaaa tgctacatat ttttccattt1740taaaagacta aatatgcaca cattattcca atttaaaaaa tgttcataga ttgacatgga1800ggcgttcgtt catttttcat aaaaatgatc ttagtaactt tttttcttat tcatttatag1860ctgatcttct agcagaagtg caagaaaaac ccaaatgttg cttctttaaa tttagctcta1920
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1.一种在真核细胞中定点插入和/或敲除基因的方法，是以抑肌素(Myostatin)基因的DNA全序列或片断为目标，构成同源重组载体的两个侧臂，并与标记基因和/或欲插入的基因连接后，转染真核细胞，筛选得到同源重组的转基因阳性细胞。
2.根据权利要求1所述的在真核细胞中定点插入和/或敲除基因的方法，其特征在于所述目标基因为包括抑肌素5’调控区和3’非翻译区的全部基因组序列。
3.根据权利要求1所述的在真核细胞中定点插入和/或敲除基因的方法，其特征在于所述目标基因为抑肌素基因。
4.根据权利要求3所述的在真核细胞中定点插入和/或敲除基因的方法，其特征在于所述目标基因包括序列表中序列1、序列2、序列3或序列4的核苷酸序列。
5.根据权利要求1所述的在真核细胞中定点插入和/或敲除基因的方法，其特征在于所述标记基因为绿色荧光蛋白(GFP)、新霉素抗性基因(noer)和胸苷激酶基因(tk)中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的在真核细胞中定点插入和/或敲除基因的方法，其特征在于所述转染细胞的方法为磷酸氢钙法、电转染法、脂质体法或显微注射法。
7.一种用于在真核细胞中定点插入和/或敲除基因的载体，它基本上由抑肌素基因的DNA全序列或片断及标记基因组成。
8.序列表中序列1、序列2、序列3、序列4的DNA序列。
9.利用权利要求1的方法得到的转基因真核细胞。
10.根据权利要求9所述的细胞，其特征在于所述细胞为动物体细胞或生殖细胞。
全文摘要
本发明公开了一种定点插入和/或敲除真核细胞基因的方法及其专用载体，涉及基因工程领域中插入和/或敲除基因的方法。本发明的目的是提供一种在真核细胞中定点插入和/或敲除基因的方法。一种在真核细胞中定点插入和/或敲除基因的方法，是以抑肌素(Myostatin)基因的DNA全序列或片断为目标，与欲插入的基因形成同源重组载体，并与标记基因连接后，转染真核细胞，筛选得到同源重组的转基因阳性细胞。利用本发明的方法得到的转基因真核细胞，可以是动物体细胞或生殖细胞。这些细胞可用于进行细胞学、细胞治疗、基因功能、转基因等方面的研究与开发。
文档编号C12N15/63GK1498967SQ0212365
公开日2004年5月26日 申请日期2002年11月5日 优先权日2002年11月5日
发明者连正兴, 李宁 申请人:连正兴, 李宁