活性重组d－乙内酰脲酶的制作方法

专利名称：活性重组d－乙内酰脲酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组(rec-)乙内酰脲酶(hydantoinase)，其可以通过特异方法以更活性的方式获得。本发明还涉及来自生物体成晶节杆菌(Arthrobacter crystallopoietes)DSM20117的重组乙内酰脲酶，编码这种蛋白质的核酸，和含有所述核酸的载体。
乙内酰脲酶是能任选地立体选择性地将5’取代的乙内酰脲转变为L-或D-N-氨甲酰氨基酸(方案1，图6)。
外消旋的5’取代的乙内酰脲可以通过化学合成优选地非常直接地获得(Kleinpeter，结构化学1997，8，161-173；Ogawa等，Tibtech1999，17，1039-43；Beller等，Angew.Chem.1999，111，1562-65)。因此，生产对映异构体富集的氨基酸的定向方法优选是以工业规模进行的(Drauz K，Kottenhahn M，Makryaleas K，Klenk H，Bemd M，Angew Chem，(1991)，D-ω-脲基氨基酸的化学酶促合成，103，704-706；方案2，图7)。
筛选利用乙内酰脲的微生物已经导致从5种不同系统发育组群中分离了革兰氏阳性和革兰氏阴性原核生物产碱菌(Alcaligenes)，节杆菌(Arthrobacter)，芽孢杆菌(Bacillus)，芽生杆菌(Blastobacter)，黄杆菌(Flavobacterium)，诺卡氏菌(Nocardia)，假单胞菌(Pseudomonas)，丛毛单胞菌(Comamonas)，栖热菌(Thermus)和土壤杆菌(Agrobacterium)。到目前为止，只对3种生物体阐述了编码参与降解的酶的基因的完整排列。这种酶的编码结构基因在基因组DNA上(节杆菌和土壤杆菌)或在质粒上(假单胞菌)，以“hyu基因簇”的形式彼此相邻排列(hyu是指“利用乙内酰脲”，Watabe等，细菌学杂志，1992，174，3461-66；同上，962-969)。在三个hyu基因簇中，土壤杆菌和假单胞菌含有用于D-选择性裂解的基因，节杆菌含有用于L-选择性裂解的基因(Hils，Stuttgart大学博士论文，1998；Watabe等，如前所述；Wiese，Stuttgart大学博士论文，2000，Verlag Ulrich Grauer)。
还已知生物体成晶节杆菌DSM20117具有D-乙内酰脲酶(Syldatk等，Jahrbuch生物技术学，第二卷，1988/1989，P.Prave编辑)。已经可以阐述这种酶N末端序列(A.Marin，Stuttgart大学博士论文，1997)。
然而，到目前为止还不能以重组和活性形式产生所述的乙内酰脲酶(M.Werner，Stuttgart大学博士论文，2001)。
本发明的目的以如下所述方式达到。本发明涉及一种通过发酵微生物生产活性重组乙内酰脲酶的方法，其在存在二价金属离子的情况下形成重组乙内酰脲酶，这种方法特征在于发酵肉汤包含引起活化的浓度的这些金属离子。本发明方法的优选实施方案中，所述金属离子特别是新离子的浓度为≥30μmol/l。在本发明方法的另一优选实施方案中，所述重组乙内酰脲酶为来自成晶节杆菌DSM20117的重组乙内酰脲酶。本发明还涉及以这种方式获得的重组乙内酰脲酶，编码这种酶的核酸，包含本发明核酸的载体，与本发明核酸杂交的核酸，以及经PCR方法生产本发明核酸的优选的引物。本发明还涉及一种起自本发明核酸的改良的乙内酰脲酶的生产方法，其特征在于将核酸进行诱变；将所得的核酸克隆入适当的载体中，并将载体移至适当的表达系统中，检测并分离所形成的具有改良活性和/或选择性的蛋白质。本发明还涉及具体的改良重组乙内酰脲酶，以及本发明的重组乙内酰脲酶和核酸的具体应用。
图2为载体pJOE4036的示意图。
图3为载体pJOE的示意图。
图4为载体pMWl0的示意图。
图5为方案1，其示出乙内酰脲酶能任选地立体选择性地将5’取代的乙内酰脲转变为L-或D-N-氨甲酰氨基酸。
图6为方案2，其示出生产对映异构体富集的氨基酸的定向方法。
因此发酵肉汤优选包含使活性提高的Zn2+浓度。加入到发酵肉汤中的金属离子尤其是Zn2+的最佳浓度，可以由本领域技术人员通过常规实验确定。一方面，选择的浓度应足够高以根据本发明达到活化/提高活性，但另一方面，所述浓度不应高到使微生物的生长被过度抑制而不能产生活性的进一步提高。在发酵期间金属离子如Zn2+的浓度，优选提高至≥30μmol/l，尤其优选≥50μmol/l，特别优选≥80μmol/l。重组乙内酰脲酶特别优选包括来自成晶节杆菌DSM20117的乙内酰脲酶。
进一步地，本发明涉及通过本发明方法获得的重组乙内酰脲酶。据信，尽管活化的和非活化的酶在其一级结构上是匹配的，但是发酵过程中锌离子浓度的增加可能对酶的二级结构甚至三级结构有影响，由此实现该蛋白质的比活性的改善。
本发明涉及编码来自成晶节杆菌DSM20117的D-乙内酰脲酶的核酸。
通过提供编码来自成晶节杆菌DSM20117的D-乙内酰脲酶的核酸，可以方便地获得可以提供足够量的工业酶促生产D-氨基酸所需的酶的物质。通过使用重组方法，可以用核酸从快速生长的宿主生物体中获得高产量的酶。
另外，本发明的基因序列用于生产改良的乙内酰脲酶变异体。
在第一个实施方案中，本发明涉及包含一或多种本发明核酸的质粒或载体。
值得考虑的质粒或载体原则上可以是本领域技术人员为此目的可获得的任何类型。这种质粒可见于Studier等，酶学方法1990，185，61-69所述，或见于Novagen，Promega，新英格兰生物实验室，Clontech或Gibco BRL公司的使用手册所述。优选的质粒和载体可以见于DNA克隆实用方法，第I-III卷，D.M.Glover编辑，IRL出版公司，牛津，华盛顿DC，1985，1987；Denhardt，D.T.和Colasanti，J.在大肠杆菌中调节克隆的DNA表达的载体的概况，Rodriguez，R.L.和Denhardt，D.T.(编辑)，载体，Butterworth，Stoneham，MA，1987，pp179-204；基因表达技术，Goeddel，D.V.(编辑)，酶学方法，第185卷，科学出版社，San Diego，1990；Sambrook，J.，Fhtsch，E.F.和Maniatis，T.1989；分子克隆实验手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY。
使用其可以非常优选地将包含本发明核酸的基因构建体克隆入宿主生物体中的质粒是pKK-177-3H(Roche生物化学公司)，pBTac(Roche生物化学公司)，pKK-233(Stratagene公司)或pET(Novagen)。除了具有完整卡那霉素抗性的TOPO系列之外，所有其它质粒应含有氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶。以下是特别优选的质粒

本发明还涉及包含本发明核酸的微生物。
将核酸克隆入微生物的目的是增加及获得足量的重组酶。用于此目的的方法是本领域技术人员所熟知的(Sambrook等，1989，分子克隆实验手册，第二版，冷泉港实验室出版社，Balbas P&BolivarF.1990，在大肠杆菌中设计和构建表达质粒载体，酶学方法185，14-37)。可以使用的微生物原则上可以是本领域技术人员所公认的任何生物体。为此目的应优选大肠杆菌菌株。以下是特别优选的菌株大肠杆菌NM522，JM109，JM105，RR1，DH5α，TOP 10或HB101。将包含本发明核酸的基因构建体优选克隆入宿主生物体中的质粒如上述。
本发明还涉及在严格条件下，与本发明单链核酸或其互补单链核酸杂交的核酸。术语“在严格杂交条件下”见于Sambrook等所述(分子克隆实验手册，冷泉港实验室出版社(1989)，1.101-1.104)。当阳性的杂交信号在用1×SSC和0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)在50℃，优选在55℃，更优选在62℃，最优选在68℃洗1小时后仍然能观测到，及更优选地用0.2×SSC和0.1％SDS在50℃，优选在55℃，更优选在62℃，最优选在68℃洗1小时后仍然能观测到时，优选地获得本发明的严格杂交条件。
本发明以下的另一方面涉及通过所有类型PCR产生本发明基因序列的引物。这些引物包括编码相应氨基酸序列的有义和反义引物。
适当的引物原则上可以是用本领域技术人员已知的方法获得的。本发明的引物通过与已知DNA序列相对比，或通过将所述氨基酸序列翻译成所述生物体的密码子而加以鉴别(例如对于链霉菌属见Wright等，基因1992，113,55-65)。来自“超家族”的蛋白质的氨基酸序列的共同特征也可以用于此目的(Firestine等，化学与生物1996，3，779-783)。相关的进一步信息可见于寡核苷酸合成实用方法，M.J.Gait编辑，IRL出版公司，牛津，华盛顿DC，1984；PCR方法和应用指导，M.A.Innis编辑，D.H.Gelfound，J.J.Sninsky和T.J.White，科学出版社，San Diego，1990。以下引物是特别优选的IPCR的引物

克隆结构基因的引物

在鼠李糖表达载体中测序DNA的引物

在进一步的方案中，本发明涉及一种生产改良的重组乙内酰脲酶的方法，及以此方式获得的重组乙内酰脲酶或编码重组乙内酰脲酶的核酸，其中从编码重组乙内酰脲酶的本发明的核酸开始，(a)将核酸进行诱变，(b)将得自(a)的核酸克隆入适当的载体中，并将后者移至适当的表达系统中，及(c)检测并分离所形成的具有改良的活性和/或选择性的蛋白质。
根据本发明通过诱变方法改良酶的步骤，本领域技术人员已经熟知。值得考虑的诱变方法是本领域技术人员为此目的所能利用的任何方法。这些方法尤其是饱和诱变，随机诱变，改组方法和定点诱变(见下述文献)。将所得新的核酸序列使用上述方法克隆入宿主生物体中(见上述文献)，并用适当的筛选方法检测表达的酶(RobertsJ.，Stella V.J.和Decedue C.J.(1985)胰脂肪酶的一种比色分析通过凝胶过滤快速检测脂肪酶和辅脂肪酶，脂质20(1)42-45；PrattR.F.，Faraci W.S.和Govardhan C.P.(1985)，直接分光光度分析D-丙氨酸羧肽酶和β-内酰胺酶的酯酶活性，分析生物化学144(1)204-206；Bruckner，H.，R.Wittner，和H.Godel(1991)，全自动高效液相层析分离用o-邻苯二醛与N-异丙基半胱氨酸一起产生的DL-氨基酸，食物样品应用)。
本发明还涉及本发明的任选经过突变改良的重组乙内酰脲酶生产N-氨甲酰氨基酸或氨基酸的用途。
本发明的编码重组乙内酰脲酶的核酸及另外进一步改良的核酸，还优选适于生产全细胞催化剂(DE10037115.9和在此所引用的文献)。
本发明的核酸因此优选用于生产重组乙内酰脲酶。通过本领域技术人员熟知的重组方法，可获得能提供足量的进行工业生产的所述酶的生物体。本发明的重组酶是用本领域技术人员已知的基因工程方法生产的(Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T(1989)，分子克隆，冷泉港实验室出版社；载体分子克隆载体及其使用概观，R.L.Rodriguez & D.T.Denhardt编辑，205-225)。对于通用方法(PCR和融合PCR，反向PCR，克隆，表达等)，参见下述文献及其引用的参考文献Riley J，Butler R，Finniear R，Jenner D，Powell S，AnandR，Smith JC，Markham AF(1990)。一种从酵母人工染色体(YAC)克隆中快速分离末端序列的新方法，核酸研究18，8186；Triglia T，Peterson MG，Kemp DJ(1988)。一种在体外扩增位于已知序列边界之外的DNA节段的方法，核酸研究16，8186；Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T(1989)，分子克隆冷泉港实验室出版社；载体分子克隆载体及其使用概观，R.L.Rodriguez&D.T.Denhardt，II。
如上所述，本发明的核酸也可用于生产本发明乙内酰脲酶的新突变体。这种突变体可以通过已知的各种类型诱变而得自本发明的DNA。使用的诱变类型优选是以下参考文献中所提及的(Eigen M.和Gardinger W.(1984)，基于RNA复制的进化的分子工程，纯化及应用化学56(8)，967-978；Chen&Arnold(1991)非水溶剂的酶学工程随机诱变以增强极性有机培养基中枯草蛋白酶E的活性，生物/技术9，1073-1077；Horwitz，M.和L.Loeb(1986)，“选自随机DNA序列的启动子”，美国科学院院报83(19)7405-7409；Dube，D.和L.Loeb(1989)，“通过将随机寡核苷酸插入β-内酰胺酶基因的活性位点中而产生的突变体”，生物化学28(14)5703-5707；Stemmer PC(1994)。通过DNA穿梭蛋白质在体外的快速进化，自然370，389-391；和Stemmer PC(1994)通过随机片段化和重装配的DNA穿梭体外重组以使分子进化，美国科学院院报91，10747-10751)。
本发明乙内酰脲酶的基因与来自Streptomyces coelicolor(T28685)的一假设蛋白呈现最高同源性，为43％氨基酸相同性，然而该蛋白目前还未知其功能。与来自嗜热脂肪芽孢杆菌(JC2310Mukohara等，1994)，放射形土壤杆菌NRRLB11291(Q44184Grifantini等，1996)和假单胞菌(Stover等，2000，La Pointe等，1998)的二氢嘧啶酶的相同性分别为40％，42％和39％。
除了与真核二氢嘧啶酶(来自Mus musculus，Homo sapiens和Rattus norvegicus)和脑衰蛋白应答介质蛋白3(CRMP-3)同源之外，与各种尿囊素酶和二氢乳清酸酶也具有同源性。
与来自金黄节杆菌DSM3745(May等，生物化学1998，379，743-747)和DSM3747(Wiese，Stuttgart大学博士论文，2000)的L-乙内酰脲酶的相同性为29％。
根据本发明，光学富集的(对映异构体富集的，enantiomer-enriched)化合物，意味着混合物中存在一个光学对映体的数量＞50mol％。
乙内酰脲也指产生自2，4-二氧咪唑烷(dioxoimidazolidines)的化合物，这种化合物5’位置由产生自氨基酸的α残基的残基取代。
氨基酸的α残基是指位于α-氨基酸的α-C原子上的残基。所述残基可以衍生自天然氨基酸，如Beyer-Walter，Lehrbuch derorganischen Chemie，S.Hirzel Verlag Stuttgart，第22版，1991，pp822所述。然而，也包括非天然α-氨基酸的相应α-残基，如DE19903268所示。
生物体成晶节杆菌DSM20117已经以所述的保藏号保藏在德意志微生物保藏中心，并是公众可以获得的。
本文中，术语“活化的”或“活化”是指本发明的重组酶与相同的OD600下的非活性重组酶相比，在细胞提取物中(15000psi，60秒，4℃、10000rpm离心10分钟后的上清)，活性提高至少1.5倍，优选2倍，更优选5倍(测定条件如实施例VI)。
术语核酸是指所有单链或双链DNA和RNA或其混合物的总称。
本文中，改良的重组乙内酰脲酶尤其是指在所用反应条件下，呈现改变的底物范围、更具活性和/或选择性或更稳定的酶。
根据本发明，所述的蛋白质序列和核酸序列还包括这样的序列，其与这些序列之一具有高于80％，优选高于90％，91％，92％，93％或94％，更优选具有高于95％或96％，尤其优选高于97％，98％或99％的同源性(排除天然简并)，条件是这种序列的作用模式或用途仍保留。文中术语“同源性”(或相同性)可以通过等式H(％)＝〔1-V/X〕×100加以阐述，其中H表示同源性，X是对比序列的核苷酸碱基/氨基酸总数，V是相对于对比序列，参比序列中不同的核苷酸碱基/氨基酸数目。
表11L营养溶液的相关数值

将第一个预培养物(V＝20ml)在30℃和110rpm温育过夜。然后将全部预培养物用于接种第二个预培养物(V＝2L)。在温育2天后，将1.5L第二个预培养物用作发酵接种物(V＝20L)。由于诱导剂乙内酰脲在生长期间被消耗，用计量泵持续供应，以使培养基内乙内酰脲的浓度保持在0.2g/l的恒定水平。一旦收获细胞，将205g湿生物量(WB)等分并贮存于-20℃。实施例II.从成晶节杆菌中获得D-乙内酰脲酶从成晶节杆菌中获得D-乙内酰脲酶的方法，是基于Marin所述的获得D-乙内酰脲酶的蛋白质的方法加以修改而进行的(博士论文，Stuttgart大学，1997)。如果可能，纯化阶段在4℃进行，各级分中乙内酰脲酶的活性通过Ehrlich光量检测法迅速初步确定。然后将阳性样品的等分用标准底物D，L-苄基乙内酰脲温育，并通过HPLC确定提取物活性。
将得自培养(见实施例I所述)的成晶节杆菌DSM 20117的生物量形成30％细胞悬浮液，用玻珠在搅拌球磨中破碎。在记录破碎动力学后，在破碎20分钟后蛋白质浓度可以达到接近16.5g/l。将细胞碎片和不溶的成分通过离心除去，并将澄清的上清用于随后的硫酸鱼精蛋白沉淀。通过这种方法，在进行层流DEAE柱层析之前，可降低溶液的粘度。
层析柱中结合的蛋白质通过通用盐梯度洗脱。将活性的集合的层流级分与相同体积的2M(NH4)2SO4溶液组合，以进行随后的疏水作用层析(HIC)进一步分离。然后组合具有最高乙内酰脲活性的级分，并在MonoQ层析柱上通过离子交换层析从其它的蛋白质中分离。
乙内酰脲酶纯化数据概括于表2所示；纯化的D-乙内酰脲酶的SDS-PAGE表明这种酶的分子量为50+/-5kDa〔在浓缩MonoQ级分后纯化的D-乙内酰脲酶进行10％SDS-PAGE，ProSieve分子量标记和来自A.aurescens DSM 3745的L-乙内酰脲酶作为49.7kDa内部标准(May，论文，Stuttgart大学，1998)〕。
表2D-乙内酰脲酶的纯化数据

实施例III.胰酶消化D-乙内酰脲酶N末端测序提供的可靠测序结果只是针对前30个氨基酸。然而，Marin的研究中阐述的序列不能衍生引物。结果，必须将蛋白质经蛋白酶消化为肽，以获得进一步的序列信息。酶促片段化是用胰蛋白酶进行的，这是一种特异性针对赖氨酸和精氨酸的内肽酶。然而，必须预料到在存在酸性氨基酸的情况下，其活性降低，甚至在存在脯氨酸残基的情况下不发生水解。在赖氨酸和精氨酸在蛋白质中平均发生率分别为5.7％和5.4％的情况下，预期完全消化产生的肽的长度平均为大约9个氨基酸。然后将肽混合物通过定量HPLC分离。
为用胰蛋白酶消化来自成晶节杆菌DSM20117的乙内酰脲酶，如上所述从MonoQ级分中获得乙内酰脲酶，然后用Amicon滤膜浓缩(截断值30kDa)，并通过SDS-PAGE分离。为确定蛋白质确实是D-乙内酰脲酶，将一部分凝胶通过Western印迹移至膜上，切割，并确定N末端的前8个氨基酸。除了第2位之外，确定的所有氨基酸与Marin确定的N末端匹配(论文，Stuttgart大学，1997)，这样可假定在这种情况中分离的蛋白质与已经由Marin阐述并定性的酶是相同的。
因此，将乙内酰脲酶条带直接从分离的MonoQ级分的聚丙烯酰胺凝胶中切下，并在原位根据生产者的指导进行胰蛋白酶消化(Sigma，Steinheim)。将肽从凝胶中用乙腈提取，并通过制备HPLC彼此分离。将级分在SpeedVac仪器中干燥，然后通过Edman降解进行N末端测序。
总之，除了N末端之外，明确证实可以对9个肽精确测序。这种肽级分之一包含环酰胺酶共有的GXXDXHXH基序，其参与结合活性中心中的Zn原子(Abendroth等，Acta Cryst.2000，D56，1166-1169)。在不是以赖氨酸(K)或精氨酸(R)结尾的那些肽序列中，因为技术问题或样品的数量和质量不充分，测序结果不准确。实施例IV.克隆hyu基因簇1.从成晶节杆菌DSM20117中分离染色体DNA将通过在乳酸培养基中培养成晶节杆菌DSM20117获得的湿生物量(见实施例I所述)，也用于分离染色体DNA。在细胞裂解并通过氯化铯密度梯度离心纯化后可以分离高纯度的基因组DNA。通过记录吸收光谱而核实质量，以便能排除酚污染。经分光光度法确定的DNA浓度为60μg DNA/ml。2.用简并引物进行PCR通过对得白胰酶消化的肽进行测序(见实施例III所述)，证实除了D-乙内酰脲酶的N末端序列，还可以获得进一步序列信息。将这种肽与已知的Agrobacterium sp.IP I-671的蛋白质序列使用ClustalX软件进行对比(Thompson等，1997，ClustalX Windows界面通过质量分析工具帮助的多重序列对比的灵活策略，核酸研究24，4876-4882)。
为从已知的肽序列中产生简并引物，应从两种肽中选择在其氨基酸组成中具有低度简并性的序列部分。为此选择肽61.61和73.31。引物61.61a偶联于DNA的正链，引物73.31b偶联于负链。
表3构建简并引物

为进一步降低引物61.61a的简并度，基于CUTG数据库考虑来自Arthrobacter sp.的密码子的分布频率(Nakamura等，核酸研究1999，27，292)。结果，在构建引物时可以忽略此寡核苷酸的第3位中的三联碱基“GTA”，因为此密码子在缬氨酸中出现的概率较低，为10.4％。
为估计PCR扩增子的长度，将两个引物与来自Agrobacterium sp.IP I-671的D-乙内酰脲酶进行序列对比。根据序列对比，两个寡核苷酸之间的缺口为69个氨基酸，这样使用简并引物61.61a和73.31b的PCR，应产生长度大约为207bp的PCR产物。
根据标准批次的温度分布图，在42℃的退火温度进行PCR，并优化Mg含量为2mM浓度。然后将PCR产物在3％琼脂糖凝胶中分离，并用Imagemaster显影分析软件确定条带的大小(来自Novex的分子量标记D-15)。将经计算为218bp大小的条带从凝胶中洗脱，并连接于pCRTOPOBluntII载体(

图1)中。所得质粒称为pJW1。对该载体接着进行的测序表明与已知的二氢嘧啶酶同源，这样第一个DNA部分已经克隆入D-乙内酰脲酶的结构基因中。3.通过反向PCR测序hyu基因簇使用反向PCR(IPCR)以获得两侧的DNA区域的进一步的序列信息。
使用限制酶BamHI，EcoRI，SacI，PstI，BglII，HindIII，SalI，MunI和MluI，消化来自成晶节杆菌DSM 20117的基因组DNA。将消化产物用1％琼脂糖凝胶分离，并通过Southern印迹固定于尼龙膜上。
适当的探针是通过用32P-α-ATP进行切口平移(RocheDiagnostics的切口平移试剂盒)产生放射性标记的MunI线性化的质粒pJW1而产生的，并与印迹一起使用进行杂交(分子量标记MWMVII)。
基于得自Southern印迹的杂交信号的大小，将基因组PstI消化产物(大约2000bp)在以下的IPCR中用作模板。为此，将消化产物在琼脂糖凝胶上分离，从凝胶中洗脱1500-2800bp范围(分子量标记MWM VII)，然后再连接并用MunI线性化。引物IPCR1+(Seq.3)和IPCR-(Seq.4)可以得自乙内酰脲酶基因的已知序列，以进行IPCR。60℃的退火温度得自寡核苷酸的熔解温度。
可以产生一个单一条带作为扩增子，将其随后洗脱并克隆入TOPO系统中(图1)。所得质粒称为pJW2。基于对pJW2测序而重建的hyu基因簇含有D-乙内酰脲酶hyuH的开放读框，和D-氨甲酰酶hyuCD的部分开放读框。实施例V.表达D-乙内酰脲酶将D-乙内酰脲酶结构基因克隆入鼠李糖表达载体pJOE4036(图2)的质粒衍生物中。将两种氨甲酰酶用来自成晶节杆菌基因组DNA的相应引物扩增。在此，引物在N末端具有NdeI限制位点的附加序列，和/或在C末端具有BamHI限制位点的附加序列。在具有His标签的酶的情况中，在C末端引物上省略终止密码子。
由于乙内酰脲酶基因含有两个内部NdeI限制位点，不可以使用针对氨甲酰酶所用的克隆入pJOE4036中的方案。改为使用一种引物，其除了N末端DNA序列之外，在5’末端编码Shine-Dalgarno序列和一个BamHI限制位点。C末端引物包含一个HindIII限制位点，其具有终止密码子或具有Strep标签序列。然后将以此方式从基因组DNA中扩增的DNA克隆入pJOE3078中。所得构建物称为pMW10(图4)。
将一种含有质粒pMW10(图4)的大肠杆菌如下在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中培养——将10ml LB培养基中的一个单菌落移至100ml摇瓶中，并在37℃温育过夜；
——将含有所述数量氨苄青霉素的100ml LB培养基，与已经温育过夜的2ml培养物在500ml摇瓶中组合(批次1)；——将相同数量的过夜培养物，LB培养基和氨苄青霉素导入另一个摇瓶中(500ml)，并另外与1ml的100mM ZnSO4*7H2O溶液(培养物中Zn2+浓度为1mM)组合(批次2)；——将批次1在37°温育2小时，直至OD600为大约0.4。批次2温育3小时以达到相同OD值。
——将这两个批次均与L-鼠李糖组合以诱导表达，直至达到0.1g/L浓度。然后将这两个批次在30℃进一步培养6小时。
——然后将细胞在4℃以7000rpm离心10分钟。将所得沉淀贮存于-10℃。
比活性是以通过Bradford方法测定的每mg总蛋白质的单位数表示。1单位的D-乙内酰脲酶在pH7.5和50℃，每分钟从D-苄基乙内酰脲中催化1μmol氨甲酰氨基酸形成。图5示出两批的细胞提取物与不含有hyd的微生物相比的D-乙内酰脲酶的比活性结果。
可以看出在Zn2+浓度增加的情况下发酵的样品含有的乙内酰脲酶的活性提高12倍以上。
序列表<110>德古萨股份公司<120>活性重组D-乙内酰脲酶<130>010141 AM<140><141><160>25<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1314<212>DNA<213>Arthrobacter crystallopoietes<220><221>CDS<222>(1)..(1314)<400>1atg gat gcg aaa ctc ctt gtt ggc ggc act att gtt tcc tcg acc ggc 48Met Asp Ala Lys Leu Leu Val Gly Gly Thr Ile Val Ser Ser Thr Gly1 5 10 15aaa atc cga gcc gac gtg ctg att gaa aac ggc aaa gtc gcc gct gtc 96Lys Ile Arg Ala Asp Val Leu Ile Glu Asn Gly Lys Val Ala Ala Val20 25 30ggc atg ctg gac gcc gcg acg ccg gac aca gtt gag cgg gtt gac tgc 144Gly Met Leu Asp Ala Ala Thr Pro Asp Thr Val Glu Arg Val Asp Cys35 40 45gac ggc aaa tac gtc atg ccc ggc ggt atc gac gtt cac acc cac atc 192Asp Gly Lys Tyr Val Met Pro Gly Gly Ile Asp Val His Thr His Ile50 55 60gac tcc ccc ctc atg ggg acc acc acc gcc gat gat ttt gtc agc gga 240Asp Ser Pro Leu Met Gly Thr Thr Thr Ala Asp Asp Phe Val Ser Gly65 70 75 80acg att gca gcc gct acc ggc gga aca acg acc atc gtc gat ttc gga 288Thr Ile Ala Ala Ala Thr Gly Gly Thr Thr Thr Ile Val Asp Phe Gly85 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Ala Ala Asp Leu Tyr Ala Gln Gly Lys Thr Gly Pro Gly195 200 205Thr His Glu Ile Ala Arg Pro Pro Glu Ser Glu Val Glu Ala Val Ser210 215 220Arg Ala Ile Lys Ile Ser Arg Met Ala Glu Val Pro Leu Tyr Phe Val225 230 235 240His Leu Ser Thr Gln Gly Ala Val Glu Glu Val Ala Ala Ala Gln Met245 250 255Thr Gly Trp Pro Ile Ser Ala Glu Thr Cys Thr His Tyr Leu Ser Leu260 265 270Ser Arg Asp Ile Tyr Asp Gln Pro Gly Phe Glu Pro Ala Lys Ala Val275 280 285Leu Thr Pro Pro Leu Arg Thr Gln Glu His Gln Asp Ala Leu Trp Arg290 295 300Gly Ile Asn Thr Gly Ala Leu Ser Val Val Ser Ser Asp His Cys Pro305 310 315 320Phe Cys Phe Glu Glu Lys Gln Arg Met Gly Ala Asp Asp Phe Arg Gln325 330 335Ile Pro Asn Gly Gly Pro Gly Val Glu His Arg Met Leu Val Met Tyr340 345 350Glu Thr Gly Val Ala Glu Gly Lys Met Thr Ile Glu Lys Phe Val Glu355 360 365Val Thr Ala Glu Asn Pro Ala Lys Gln Phe Asp Met Tyr Pro Lys Lys370 375 380Gly Thr Ile Ala Pro Gly Ser Asp Ala Asp Ile Ile Val Val Asp Pro385 390 395 400Asn Gly Thr Thr Leu Ile Ser Ala Asp 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1.一种通过发酵微生物生产活性重组乙内酰脲酶的方法，所述微生物在存在二价金属离子的情况下形成重组乙内酰脲酶，这种方法特征在于发酵肉汤包含导致活化的浓度的这些金属离子。
2.权利要求1的方法，其特征在于金属离子尤其Zn2+的浓度≥30μmol/l。
3.权利要求1的方法，其特征在于所述重组乙内酰脲酶包括来自成晶节杆菌DSM20117的重组乙内酰脲酶。
4.通过权利要求1的方法获得的重组乙内酰脲酶。
5.编码来自成晶节杆菌DSM20117的D-乙内酰脲酶的核酸。
6.包含权利要求5的一或多种核酸的质粒，载体和微生物。
7.在严格杂交条件下与权利要求5的单链核酸或其互补单链核酸杂交的核酸。
8.通过PCR产生权利要求5的核酸的引物。
9.一种从编码权利要求4的重组乙内酰脲酶的核酸生产改良的重组乙内酰脲酶的方法，其特征在于a)将所述核酸进行诱变，b)将得自a)的核酸克隆入适当的载体中，并将载体移至适当的表达系统中，和c)检测并分离所形成的具有改良活性和/或选择性的蛋白质。
10.通过权利要求9的方法获得的重组乙内酰脲酶或编码重组乙内酰脲酶的核酸。
11.权利要求4或10的重组乙内酰脲酶生产N-氨甲酰氨基酸的用途。
12.权利要求5或10的核酸生产全细胞催化剂的用途。
全文摘要
本发明涉及可通过特异方法以更具活性的方式获得的重组乙内酰脲酶。本发明还涉及来自生物体成晶节杆菌DSM20117的重组乙内酰脲酶，编码这种蛋白质的核酸，和含有所述核酸的载体。
文档编号C12N5/10GK1393556SQ0212269
公开日2003年1月29日 申请日期2002年6月20日 优先权日2001年6月22日
发明者奥利弗·迈, 安德烈亚斯·博马留斯, 卡尔梅因茨·德拉奥茨, 梅尔廷·西曼－赫茨贝格, 克里斯托夫·西勒达克, 马库斯·维尔纳, 约瑟夫·阿尔滕比希纳 申请人:德古萨股份公司