专利名称：粘质沙雷氏菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物领域中一株粘质沙雷氏菌。
背景技术：
神灵杆菌脂多糖，原名灵杆菌素(Prodigiosin prodigiozan"[又名灵杆菌多糖、 灵杆菌LPS (Iipopolysaccharide)曾用名灵杆菌素(prodigiosin, Hemarisin)]是从革兰氏阴性杆菌粘质沙雷氏菌又名神灵杆菌细胞壁中提取的一种脂多糖。神灵杆菌脂多糖研究之初中国的医药处于起步阶段，许多药品的质量标准还不完善，质量控制不严格。导致许多功效显著、疗效确切的药品不良反应显著，而神灵杆菌脂多糖是其中最典型的代表，由于生产手段和鉴别方法的基础研究进行的较少，还需要进行大量实验加以补充才能对该制剂的功能做出全面正确的评价。国产神灵杆菌脂多糖生产过程中设备简陋、生产技术陈旧，从原料到提取过程没有进行严格的质量控制，同时没有注意到各学科之间的交叉互补，药学和免疫学等相关学科的前沿的分析手段和理念没有更好的为灵杆菌素的提取及药理研究服务。同时，对其质量的稳定性控制没有严格的规定，严重打破了临床应用过程中药品使用的安全、有效和可靠性的标准，导致虽然功效独特，但副反应严重，例如热原和过敏现象。
发明内容
本发明的目的是提供一株高产神灵杆菌脂多糖粘质沙雷氏菌，可以提高神灵杆菌脂多糖质量稳定性的同时，完善了国家对神灵杆菌脂多糖注射剂的质量标准，为以后工业化提供理论基础和特异性的手段和方法。开创了微生物制药的新思想。上述目的通过以下技术方案实现粘质沙雷氏菌ZJH20098 (Serratia marcescens ZJH20098)，已于 2010 年 7 月 18 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址是中国北京市朝阳区北辰西路1号院(100101)，保藏号为=CGMCC No. 4010。所述的粘质沙雷氏菌ZJH20098 Gerratia marcescens)，由采集于临床感染病人体内，经分离、纯化、物理诱变、优选获得的高活性菌株，28°C固体培养基培养24h后菌落呈玫瑰红色，色素不断扩散到培养基中，菌落开始时出现半透明粘稠液滴，菌落呈圆形，光滑， 湿润，表面隆起呈玫瑰金属光泽，边缘整齐，有恶臭气味，在37°C培养菌落呈乳白色。所述的粘质沙雷氏菌ZJH20098 (Serratia marcescens ZJH20098)，能利用柠檬酸盐和醋酸盐作为碳源，不发酵阿拉伯糖，葡萄糖发酵实验产生少量气体；还可发酵纤维二糖、肌醇和甘油，不产气；M. R.测定为阴性，V.P.测定为阳性；经16S rDNA部分序列在线进行BLAST比对，结果具有krratia菌属marcescens菌种的主要遗传特性。有益效果1.灵杆菌素有明显抑瘤和升高白血球作用，能提高机体的非特异性免疫功能。具有对肌肉无刺激性，对机体毒副作用小。临床上应用特别是对某些久治不愈的急慢性盆腔炎和因放疗、化疗引起的白细胞减少症都取得良好疗效。由于当时的生产工艺灵杆菌素原料易得，用量少，疗效肯定，达到了国外同类药品的先进水平，为我国医药工业填补了一项空白，得到了药品生产主管部门的认可。本发明项目研究采用目前现代化的微生物鉴定手段详细地对经临床感染患者体内分离、诱导、优选出的粘质沙雷氏菌ZJH20098 (Serratia marcescensZJH20098) 进行了检测，从微生物生理形态、遗传、生化对其进行的鉴定，为确保粘质沙雷氏菌 ZJH20098 (Serratia marcescens ZJH20098)稳定奠定了理论基础。这在生物药品、生物制品研究和生产质量控制及管理具有开创性的意义。2.本发明项目研究过程中采用仪器分析、药物分析、微生物生理和生化等相关的先进的分析和检测手段(如TLC、HPLC、示差折光检测仪等)对神灵杆菌脂多糖的活性成分进行明晰化，并对神灵杆菌脂多糖制备生产的整个过程，从菌种保存管理、发酵、提取、纯化整个过程进行质量跟踪监控，从而为药品质量监管提供一些理论基础和创新性的手段、方法。同时，应用免疫学和病理、毒理学的方法来对神灵杆菌脂多糖的抗病毒、抗感染、抗肿瘤等方面的免疫作用进行验证。力图提高灵杆菌脂多糖质量稳定性的同时，完善包括对神灵杆菌脂多糖注射剂的国家质量标准，为以后微生物制药工业化生产和质量控制提供理论基础和特异性的手段。开创了生物制药制药的新思想和管理模式。自应用于临床研究以来，神灵杆菌脂多糖经临床应用表明其对急慢性盆腔炎，附件炎，口腔粘膜病，银屑病，传染性肝炎，放化疗造成的白细胞减少症以及急慢性感染性疾病等均具有一定的效果。并且神灵杆菌脂多糖是一种高效的免疫激活剂，可以刺激免疫抗体的产生从而增强体液免疫。免疫学和血液学实验证明神灵杆菌脂多糖对B淋巴细胞、T细胞有促分裂效应，能激活NK细胞，提高T淋巴细胞转化率，并促进吞噬细胞的产生，加强机体的抗感染能力。可以强烈刺激机体产生多种内源性集落刺激因子，增加外周血白细胞数量和增强白细胞功能，激活机体非特异性免疫防御系统，加强巨噬细胞活性，提高机体特异性免疫功能。通过神灵杆菌脂多糖对恶性肿瘤化疗后白细胞减少症的治疗，也证实升白细胞的确切效果，能大幅度地缓解肿瘤患者因放、化疗所致的白细胞减少这一现象，平均总有效率达86. 7%，比较适用于骨髓造血功能异常的白细胞减少症患者。神灵杆菌脂多糖可以使骨髓造血功能得以恢复或提早恢复，有效地预防了出血和感染的发生，有利于持续化疗。 神灵杆菌脂多糖可作为解决因化疗骨髓造血功能减低下的有效的手段之一。神灵杆菌脂多糖研究和临床应用方面的还处于进一步深入应用推广阶段，例如神灵杆菌脂多糖与抗生素联合应用发现其疗效更加，其作用机理还有待于进一步研究。通过神灵杆菌脂多糖联合肝速康治疗慢性乙肝疗效观察得出能有效抑制乙肝病毒的复制。通过同位素标记灵杆菌多糖动物实验表明灵杆菌多糖对肝组织的选择性比较强。进一步研究证明，灵杆菌多糖对提高肝组织细胞免疫能力在于独特的作用机理。研究结果表明灵杆菌素中所含有的脂多糖通过对细胞的无氧酵解的抑制，直接影响组织蛋白的合成，延迟病毒蛋白质体内的运转，抑制其在细胞内的增殖，诱导细胞产生高尔基线粒体，加速细胞能量物质的ATP的产生和运转，对提高其机体生理功能具有极其重要意义。通过动物实验还证明神灵杆菌脂多糖能有效地刺激单核巨噬细胞系统，增强巨噬细胞的活性，提高肝脏的器官组织的蛋白合成能力，对肝组织的细胞增殖和修复有促进作用。神灵杆菌脂多糖是一种多细胞因子诱生剂，对治疗化疗后的白细胞减少症疗效确切，可直接用于肿瘤化疗过程。
具体实施例方式实施例1 粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens ZJH20098) ZJH20098，已于 2010 年 7 月 18 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址是中国北京市朝阳区北辰西路1号院(100101)电话=64807355保藏号为=CGMCC No. 4010。所述的粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens ZJH20098)ZJH20098，由采集于临床感染病人体内，经分离、纯化、物理诱变、优选获得的高活性菌株，28°C固体培养基培养24h 后菌落呈玫瑰红色，色素不断扩散到培养基中，菌落开始时出现半透明粘稠液滴，菌落呈圆形，光滑，湿润，表面隆起呈玫瑰金属光泽，边缘整齐，有恶臭气味，在37°C培养菌落呈乳白色。实施例2:所述的粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens ZJH20098)ZJH20098，能利用柠檬酸盐和醋酸盐作为碳源，不发酵阿拉伯糖，葡萄糖发酵实验产生少量气体；还可发酵纤维二糖、肌醇和甘油，不产气；M.R.测定为阴性，V.P.测定为阳性；经16S rDNA部分序列在线进行BLAST比对，结果具有krratia菌属marcescens菌种的主要遗传特性。采用美国全自动BD生理生化鉴定仪对粘质沙雷氏菌ZJH20098进行鉴定，具有下表的生理生化特征。生理生化鉴定结果
权利要求
1.一种粘质沙雷氏菌，其特征是保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 4010，描述为粘质沙雷氏菌ZJH20098 (Serratia marcescens ZJH20098)。
2.根据权利要求1所述的粘质沙雷氏菌ZJH20098(Serratiamarcescens ZJH20098), 其特征是由采集于临床感染病人体内，经分离、纯化、物理诱变、优选获得的高活性菌株，固体培养基培养24h后菌落呈玫瑰红色，色素不断扩散到培养基中，菌落开始时出现半透明粘稠液滴，菌落呈圆形，光滑，湿润，表面隆起呈玫瑰金属光泽，边缘整齐，有恶臭气味，在37°C培养菌落呈乳白色。
3.根据权利要求1或2所述的粘质沙雷氏菌ZJH20098(Serratia marcescens ZJH20098)，其特征是所述的菌种能利用柠檬酸盐和醋酸盐作为碳源，不发酵阿拉伯糖， 葡萄糖发酵实验产生少量气体；还可发酵纤维二糖、肌醇和甘油，不产气；M.R.测定为阴性，V. P.测定为阳性；经16SrDNA部分序列在线进行BLAST比对，结果具有krratia菌属 marcescens菌种的主要遗传特性；16S rDNA测序部分序列如下所示CAGGCTTACACATGCAAGTCGAGCGGTAGCACAGGGGAGCTTGCTCCCNG GGTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGA GGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGAC CAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGA TTAGCTAGTAGGTGGGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGG TCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCT ACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCA GCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGC GAGGAGGAAGGTGGTGANCTTAATACGNTCATCAATTGACGTTACTCGCA GAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGT GCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTTTGT TAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTGAAAC TGGCAAGCTAGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTG AAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGA CGAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGAT ACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTT GAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTAC GGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGT GGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTG ACATCCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAG ACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAA GTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTCGGCCGG GAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACG TCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGC ATATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTATGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCG CTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGT ACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGC TTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCATGACTGGGGTGAA GTCGTAACAAGo
全文摘要
一种粘质沙雷氏菌ZJH20098(Serratia marcescens ZJH20098)，目前生产的药用神灵杆菌脂多糖副反应严重，例如热原和过敏现象。除工艺不规范外，其主要原因是菌种没有明确规定和不稳定产生的变异，提取的造成功能组分改变。本发明的菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.4010，由采集于临床感染病人体内，经分离、纯化、物理诱变、优选获得的高活性菌株，本发明作为一种生产人用或兽用药品“神灵杆菌脂多糖”原料。
文档编号C12R1/43GK102181382SQ20111002923
公开日2011年9月14日 申请日期2011年1月27日 优先权日2011年1月27日
发明者刘红梅, 邹积宏 申请人:黑龙江大学