专利名称：一种藻类内生真菌胞外多糖的制备方法
技术领域：
本发明的技术方案涉及使用生物方法合成多糖，具体地说是一种藻类内生真菌胞外多糖的制备方法。
背景技术：
植物内生真菌一般能够合成多种特殊的天然胞外产物，不同的内生真菌所产生的胞外产物的结构和性质也不同。CN1594587公开了一种真菌胞外多糖复合物的制备及其应用，是从一种虫草真菌-中国弯颈霉的培养液中提取胞外多糖复合物，该发明的原料来源不广泛，生产成本高；CN1974753披露了可大量获得真菌胞外多糖的发酵和分离方法，该发明方法的缺点是生产周期长和产量低。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种藻类内生真菌胞外多糖的制备方法，所用内生真菌DT06是从蓝藻中分离出来的，克服了现有技术的原料来源不广泛，不易于分离和生产成本高的缺点。本发明解决该技术问题所采用的技术方案是一种藻类内生真菌胞外多糖的制备方法，是以蓝藻内生真菌DT06为生产菌，通过摇床或液态深层培养发酵分离纯化的多糖，其具体步骤是生产菌为蓝藻内生真菌DT06，该菌株已在中国普通微生物菌种保藏中心专利保藏，保藏单位的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101，保藏日期为2010年12月20日，保藏编号为CGMCCN0. 4460，该菌株的核苷酸序列见序列表；该菌株的名称为Simplicillium lanosoniveum。斜面培养基配方葡萄糖0.5 lg、酵母提取物0.05 0. lg、蛋白胨0. 1 0. 2g、琼脂1 1. 5g和水100ml，制成试管斜面，挑取菌丝接入斜面；第一步，蓝藻内生真菌TD06液体发酵发酵培养基配方为蔗糖30 60g/L，硝酸钠2 3g/L，磷酸二氢钾0. 5 lg/L，氯化钾0. 1 lg/L,七水硫酸镁0. 1 0. 5g/L，硫酸铁0. 01 0. lg/L ；将蓝藻内生真菌DT06进行液体发酵，选用以下两种方法的任意一种A.蓝藻内生真菌TD06的摇床发酵控制参数为发酵温度25 27 °C，摇床转数为130 150rpm，装料系数为30 50% (ν/ν)，接种量为1 10% (ν/ν)，ρΗ控制在5. 5 6. 5，发酵周期为6 8天，B.蓝藻内生真菌TD06的深层发酵控制参数为装料系数为75 90% (ν/ν)，接种量为1 20% (ν/ν)，pH = 5. 5 7. 0，温度25 30°C，罐压0. 01 0. 5Mpa，搅拌速度60 150rpm，空气流量0. 4 1. Ovvm ；第二步，胞外多糖分离
将第二步得到的蓝藻内生真菌TD06液体发酵物进行离心或过滤，除去菌体，将发酵液加热浓缩至原体积的1/2 1/4，用95% (ν/ν)的乙醇来沉淀提取粗多糖，将该留取的粗多糖沉淀，乙醇的用量是体积比为上述浓缩的发酵液95%乙醇=1 1，再加入为上述粗多糖沉淀2 4倍体积的水，煮沸10 15分钟，然后加入质量百分比为0. 2 2%的活性炭，搅拌除去色素，离心后取上清，将该上清再浓缩至原体积的1/2 1/4后加入与其体积比为1 1的95% (ν/ν)的乙醇进行沉淀，将得到的沉淀在15 和-50°C条件下进行真空干燥Mh，得到多糖粗品；第三步，多糖纯化将第三步得到的多糖粗品经过kvag法除蛋白、透析和kphadex G-200凝胶过
滤，最后制得有如下结构式所示的纯真菌胞外多糖产品
权利要求
1. 一种藻类内生真菌胞外多糖的制备方法，其特征在于是以蓝藻内生真菌DT06为生产菌，通过摇床或液态深层培养发酵分离纯化的多糖，其具体步骤是生产菌为蓝藻内生真菌DT06，该菌株已在中国普通微生物菌种保藏中心专利保藏，保藏日期为2010年12月20日，保藏编号为CGMCC4460，该菌株的核苷酸序列见序列表；该菌株的名禾尔为 Simplicillium lanosoniveum(J. F. H. Beyma)Zare & W. Gams var.tianjinienss Q· L Dong0斜面培养基配方葡萄糖0. 5 lg、酵母提取物0. 05 0. lg、蛋白胨0. 1 0. 2g、琼脂1 1. 5g和水100ml，制成试管斜面，挑取菌丝接入斜面；第一步，蓝藻内生真菌TD06液体发酵发酵培养基配方为蔗糖30 60g/L，硝酸钠2 3g/L，磷酸二氢钾0. 5 lg/L，氯化钾0. 1 lg/L,七水硫酸镁0. 1 0. 5g/L，硫酸铁0. 01 0. lg/L ；将蓝藻内生真菌DT06进行液体发酵，选用以下两种方法的任意一种A.蓝藻内生真菌TD06的摇床发酵控制参数为发酵温度25 27°C，摇床转数为130 150rpm，装料系数为30 50%(ν/ν)，接种量为1 10% (ν/ν)，ρΗ控制在5. 5 6. 5，发酵周期为6 8天，B.蓝藻内生真菌TD06的深层发酵控制参数为装料系数为75 90% (ν/ν)，接种量为1 20% (ν/ν)，ρΗ = 5. 5 7.0，温度25 30°C，罐压0. 01 0. 5Mpa，搅拌速度60 150rpm，空气流量0. 4 1. Ovvm ；第二步，胞外多糖分离将第二步得到的蓝藻内生真菌TD06液体发酵物进行离心或过滤，除去菌体，将发酵液加热浓缩至原体积的1/2 1/4，用95% (ν/ν)的乙醇来沉淀提取粗多糖，将该留取的粗多糖沉淀，乙醇的用量是体积比为上述浓缩的发酵液95%乙醇=1 1，再加入为上述粗多糖沉淀2 4倍体积的水，煮沸10 15分钟，然后加入质量百分比为0. 2 2%的活性炭，搅拌除去色素，离心后取上清，将该上清再浓缩至原体积的1/2 1/4后加入与其体积比为1 1的95% (ν/ν)的乙醇进行沉淀，将得到的沉淀在15 和-50°C条件下进行真空干燥Mh，得到多糖粗品；
全文摘要
本发明一种藻类内生真菌胞外多糖的制备方法，涉及使用生物方法合成多糖，是以蓝藻内生真菌DT06为生产菌，通过摇床或液态深层培养发酵分离纯化的多糖，生产菌为蓝藻内生真菌DT06，该菌株的保藏日期为2010年12月20日，保藏编号为CGMCC4460；具体步骤是第一步，蓝藻内生真菌TD06液体发酵；第二步，胞外多糖分离；第三步，多糖纯化，最后制得有如下结构式所示的纯真菌胞外多糖产品本发明方法所用内生真菌DT06是从蓝藻中分离出来的，克服了现有技术的原料来源不广泛，不易于分离和生产成本高的缺点。
文档编号C12P19/04GK102559799SQ20111002916
公开日2012年7月11日 申请日期2011年1月27日 优先权日2011年1月27日
发明者董庆霖, 邢向英, 陈博 申请人:河北工业大学