专利名称：一种乙酰胆碱酯酶基因及其突变体的核酸序列及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及一种乙酰胆碱酯酶基因及其突变体的核酸序列，本发明还涉及该序列的应用。
背景技术：
乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase，AChE, EC3. 1. 1. 7)是生物神经传导中的一种关键酶，主要存在于神经元和神经肌肉接头处，为膜结合蛋白，定位于细胞膜和突触前后膜，能快速水解神经递质乙酰胆碱(Acetylcholine，ACh)从而终止ACh对胆碱能受体的兴奋作用，保持神经冲动传导的灵敏性。乙酰胆碱酯酶是生物体内反应最快的酶之一，降解一个分子约80微秒。正因为乙酰胆碱酯酶的这一基本功能，它也是生物体内神经系统中的一个潜在弱点。有机磷杀虫剂即针对昆虫体内的胆碱脂酶，不可逆地抑制该酶的活性，达到杀灭害虫的目的。但若有机磷农药超标使用，农药在食品中的残留亦会导致人畜中毒。因此检测有机磷农药残留是食品安全检测一个重要的组成部分。农药残留物污染是我国食品污染的重要来源之一。国内标准化的有机磷农药残留的检测大多采用气相色谱法、高效液相色谱法、质谱法等，这些方法的灵敏度虽然很高， 但样品预处理繁琐；检测周期长；成本高。现在已有许多新的检测方法面世，用的最多的方法是酶抑制法，根据有机磷与氨基甲酸酯类农药使昆虫中毒致死的毒理学原理，将乙酰胆碱酯酶与样品反应，根据乙酰胆碱酯酶活性受到抑制的情况所产生的发光信号、电信号或者颜色变化，可判断出样品中是否含有超标的有机磷或氨基甲酸酯类农药。但目前所用的 AChE主要来自组织或血液提取，成本高，成分杂，影响了推广。采用基因工程的方法，获得高活性乙酰胆碱酯酶是检测有机磷农药残留的一个可行的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种乙酰胆碱酯酶基因及其突变体的核酸序列，解决了现有乙酰胆碱酯酶提取成本高、成分复杂的问题。本发明的另一目的是提供一种上述序列的应用。本发明所采用的技术方案是，一种乙酰胆碱酯酶基因及其突变体的核酸序列，该基因及其突变体的核酸序列为ttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattaga60actcggtacgcgcggatcttccagagattggtaccatgaggcctccctggtatcccctgc120atacaccttccctggcttttccactcctcttcctcctcctctccctcctgggaggagggg180caagggctgagggccgggaagacccgcagctgctggtgagggttcgagggggccagctga240ggggcatccgcctgaaggcccctggaggcccagtctcagcttttctgggcatcccctttg300cagagccacctgtgggctcacgtagatttatgccaccagagcccaagcggccctggtcag360gagtgttggatgctaccaccttccaaaatgtctgctaccagtacgtggacaccctgtacc420
ctgggtttgagggtactgagatgtggaaccccaaccgagagttgagtgaagactgcctgt480
atcttaatgtgtggacaccataccccagacctgcttctcccacacctgtcctcatctgga540
tctatgggggtggtttctacagcggagcggcctccttggatgtgtatgacggccgtttcc600
tggcccaggttgagggagctgtgttggtatctatgaactaccgagtgggaacctttggct660
tcttggccctaccaggaagcagagaagcccctggcaatgtaggtctgctggatcaacggc720
ttgccttgcaatgggtgcaagaaaatattgcagcctttgggggcgacccgatgtcagtga780
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gcaggagcctcttccacagggctgtcctccagagtggcacacccaatgggccctgggcca900
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cttggcccctctggatgggggtgccccatggctatgaaatcgagttcatctttgggctcc1560
ccctggatccctcgctgaactacaccacggaggagaggatctttgctcagcgacttatga1620
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cacagtggccaccgtacaccactgccgcgcagcaatatgtgagcctgaacctgaagccct1740
tagaggtgcggcggggactgcgcgcccagacctgcgccttctggaatcgctttctcccca1800
aattgctcagcgccaccgatactctggacgaggcggagcgccagtggaaggccgagttcc1860
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agcgctgctcagacctgtgatctagaatcgtcgaacggcaggcgtgcaaacttggcgtaa1980tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgtt 2014。本发明所采用的另一技术方案是，一种乙酰胆碱酯酶基因及其突变体的核酸序列的应用，通过相应的酶切位点插入原核表达载体，转入大肠杆菌细胞，在大肠杆菌细胞中表达出乙酰胆碱酯酶。本发明所采用的第三种技术方案是，一种乙酰胆碱酯酶基因及其突变体的核酸序列的应用，通过相应的酶切位点插入真和表达载体，转入酵母，在酵母细胞中表达出乙酰胆碱酯酶。本发明的特点还在于，其中乙酰胆碱酯酶基因及其突变体的RT-PCR引物设计为F 5' -TCATGCCAGGCTGCACTTG-3’R 5' -TCTCCCTCAGGTTCCATCTT-3’Fl :5’ -GGTACCATGAGGATATTTGCTGGCATT-3’
Rl :5’ -TCTAGATTACGTCTCCTCGAATTGTGT-3’Pl :5’ -TGTCCTCCAGAGTGGCACA-3’P2 :5’ -TGAGGAAGTCCCCGTCTAC-3’反转录PCR反应使用Ta KaRa 公司 High Fidelity PrimeScript RT-PCR Kit 进行反转录实验； 取新鲜小鼠脑组织置于研钵中，加液氮迅速研成粉末，加Trizol入勻浆管中，充分勻浆后， 抽提总RNA ；上述的PCR反应液 ABIul5XPrimeSTAR PCR BufferIOuldNTP Mixture/2. 5mM each4ulF Primer/20uM FlPlIulR Primer/20uM P2 RlIulPrimeSTAR HS DNA Polymerase/2. 5U/ul0. 5uldH2032. 5ul总体积50ul反应条件94V 3min ；98 V，IOsec ；55 °C，15sec ；72 °C，lmin, 30cycles ；72 °C， IOmin0全长PCR 扩增使用 Ta Kafci 公司 Prime STAR HS DNA Polymerase，进行全长
PCR扩增；反应体系上述的二次ΙΛ-PCR反应液各Iul5XPrimeSTAR PCR BufferIOuldNTP Mixture/2. 5mM each4ulFlPrimer/20uMIulRlPrimer/20uMIulPrimeSTAR HS DNA Polymerase/2. 5U/ul0. 5uldH2031. 5ul总体积50ul反应条件94"C, 3min ；98 "C, IOsec ；50 "C, 15sec ；72 "C, 2min, 30cycles ；72 V， IOmin ；基因克隆、测序PCR产物纯化，Kpnl/Xbal酶切克隆至pMD19_T Simple载体，测序，获得该核酸序列。
本发明的有益效果是，(1)本发明采用基因工程的方法，克隆表达乙酰胆碱酯酶基因，可获得大量的乙酰胆碱酯酶，与现有的从血液中提取胆碱酯酶的方法相比较，提高了产量，缩短了工作时间， 节约了成本；(2)本发明从小鼠RT-PCR获取乙酰胆碱酯酶基因，原材料容易获取，引物中引入 KpnUXbal酶切位点，方便插入表达载体；(3)本发明经过测序和分析结果表明，获得的乙酰胆碱酯酶基因序列与现有序列不同，是一种新的核酸序列，通过基因表达可获得高活性的乙酰胆碱酯酶。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明进行详细说明。一、基因序列通过RT-PCR的方法，获得的小鼠乙酰胆碱酯酶基因序列，如下
ttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattaga60
actcggtacgcgcggatcttccagagattggtaccatgaggcctccctggtatcccctgc120
atacaccttccctggcttttccactcctcttcctcctcctctccctcctgggaggagggg180
caagggctgagggccgggaagacccgcagctgctggtgagggttcgagggggccagctga240
ggggcatccgcctgaaggcccctggaggcccagtctcagcttttctgggcatcccctttg300
cagagccacctgtgggctcacgtagatttatgccaccagagcccaagcggccctggtcag360
gagtgttggatgctaccaccttccaaaatgtctgctaccagtacgtggacaccctgtacc420
ctgggtttgagggtactgagatgtggaaccccaaccgagagttgagtgaagactgcctgt480
atcttaatgtgtggacaccataccccagacctgcttctcccacacctgtcctcatctgga540
tctatgggggtggtttctacagcggagcggcctccttggatgtgtatgacggccgtttcc600
tggcccaggttgagggagctgtgttggtatctatgaactaccgagtgggaacctttggct660
tcttggccctaccaggaagcagagaagcccctggcaatgtaggtctgctggatcaacggc720
ttgccttgcaatgggtgcaagaaaatattgcagcctttgggggcgacccgatgtcagtga780
0127]ctctgtttggggagagtgcgggtgcagcctccgtgggcatgcacatactgtccctgccca8400128]gcaggagcctcttccacagggctgtcctccagagtggcacacccaatgggccctgggcca9000129]ctgtgagtgctggagaggccaggcgcagggccacactgctggcccgccttgtgggctgtc9600130]ccccaggtggCgCtggtggCaatgacaccgagctgatagcctgcttgaggacaaggcccg10200131]ctcaggacctggtggaccacgagtggcacgtcctgcctcaagaaagtatcttccgatttt10800132]ccttcgtgcctgtggtagacggggacttcctcagtgacacaccggaggctctcatcaata11400133]ctggagattttcaagacctgcaggtgctggtgggtgtggtgaaggacgagggctcctact12000134]ttctggtttacggggtcctaggcttcagcaaagacaatgaatctctcatcagccgggccc12600135]agttcctggctggggtgcggatcggtgtaccccaagcaagtgacctggcagccgaggctg13200136]tggtcctgcattacacagactggctgcaccctgaggaccctactcacctgagagatgcca13800137]tgagtgcagtggtaggcgaccacaacgttgtgtgccctgtggcccagctggctgggcgac14400138]tggctgcccaaggggcccgggtctatgcctacatctttgaacaccgtgcctccacactga15000139]cttggcccctctggatgggggtgccccatggctatgaaatcgagttcatctttgggctcc15600140]ccctggatccctcgctgaactacaccacggaggagaggatctttgctcagcgacttatga16200141]aatactggaccaattttgcccgcacaggggaccccaatgaccctcgagactccaaatctc16800142]cacagtggccaccgtacaccactgccgcgcagcaatatgtgagcctgaacctgaagccct17400143]tagaggtgcggcggggactgcgcgcccagacctgcgccttctggaatcgctttctcccca18000144]aattgctcagcgccaccgatactctggacgaggcggagcgccagtggaaggccgagttcc18600145]accgctggagctcctacatggtgcactggaagaaccagttcgaccactatagcaagcagg19200146]agcgctgctcagacctgtgatctagaatcgtcgaacggcaggcgtgcaaacttggcgtaa19800147]tcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgtt2014 ο本发明RT-PCR弓丨物设计F 5' -TCATGCCAGGCTGCACTTG-3，R 5，-TCTCCCTCAGGTTCCATCTT-3，Fl :5，-GGTACCATGAGGATATTTGCTGGCATT-3，Rl :5，-TCTAGATTACGTCTCCTCGAATTGTGT-3，
Pl :5，-TGTCCTCCAGAGTGGCACA-3，P2 :5， -TGAGGAAGTCCCCGTCTAC-3，反转录PCR反应使用Ta KaRa 公司 High Fidelity Prime Script RT-PCR Kit (CodeNo. DR027A) 进行反转录实验。取新鲜小鼠脑组织置于研钵中，加液氮迅速研成粉末，加iTrizol入匀浆
管中，充分勻浆后，抽提总RNA。反应体系总RNAIulPrimer (20uM) P2R IuldNTP Mixture(10uM each)IulRandom 6mers(20uM)IulRNase Free dH206ul反应条件65°C，5min ；立即冰上放置2分钟；然后加入下列组分总RNAIulPrimer (20uM) P2R IuldNTP Mixture(10uM each)IulRandom 6mers (20uM)IulRNase Free dH206ul总体积20ul反应条件30°C,IOmin ；42°C，30min ；95°C，5min ；PCR 扩增一次 PCR 使用 Ta KaRa 公司 PrimeSTAR HS DNA Polymerase (CodeNo.
DROl0A)，进行PCR扩增；反应体系A B上述的反转录反应液2ul5XPrimeSTAR PCR BufferIOuldNTP Mixture(2. 5mM each)4ulF Primer (20uM) FPlIulR Primer (20uM) P2 RIulPrimeSTAR HS DNA Polymerase(2. 5U/ul) 0. 5uldH2031. 5ul总体积50ul反应条件94"C, 3min ；98 "C, IOsec ；55 °C，15sec ；72 °C，lmin，30cycles ；72 "C, IOmin ；二次 PCR 使用 Ta KaRa 公司 PrimeSTAR HS DNA Polymerase (CodeNo. DROl0A)，进行PCR扩增。反应体系
100187]12
0188]上述的PCR反应液A BIul
0189]5XPrimeSTAR PCRBufferIOul
0190]dNTP Mixture(2. 5mM each)4ul
0191]F Primer(20uM)Fl PlIul
0192]R Primer(20uM)P2 RlIul
0193]PrimeSTAR HS DNAPolymerase(2. 5U/ul) 0. 5ul
0194]dH2032. 5ul
0195]总体积50ul
0196]反应条件94V 3min ；98 "C, IOsec ；55 °C，15sec ；72 "C, lmin, 30cycles ；72 V， Omin0
0197]全长PCR 扩增使用 Ta KaRa 公司 PrimeSTAR HS DNA Polymerase (Code
No. DROlOA)，进行全长PCR扩增；反应体系上述的二次1/2-PCR反应液各Iul5XPrimeSTAR PCR BufferIOuldNTP Mixture(2. 5mM each)4ulFlPrimer (20uM)IulRlPrimer (20uM)IulPrimeSTAR HS DNA Polymerase(2. 5U/ul) 0. 5uldH2031. 5ul总体积50ul反应条件94V，3min ；98 V，IOsec ；50 V，15sec ；72 °C，2min, 30cycles ；72 °C， IOmin ；基因克隆、测序PCR产物纯化，Kpnl/Xbal酶切克隆至pMD19_T Simple载体，测序，获得该核酸序列。二、应用方法上述乙酰胆碱酯酶基因及其突变体的核酸序列，可通过以下途径应用1)上述核酸序列通过相应的酶切位点插入原核表达载体，通过本领域人员公知的方法转入大肠杆菌细胞，即可在大肠杆菌细胞中表达出乙酰胆碱酯酶；2)上述核酸序列通过相应的酶切位点插入真和表达载体(如pcDNA3. 1 (+))，通过本领域人员公知的方法转入酵母，即可在酵母细胞中表达出乙酰胆碱酯酶。将本发明核酸序列在原核(如大肠杆菌)或真核(如酵母)细胞表达的蛋白质产物(乙酰胆碱酯酶)，用于有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的检测。有机磷和氨基甲酸酯类化合物是乙酰胆碱酯酶的抑制剂，选择合适的底物(如碘化硫代乙酰胆碱)，根据有机磷对该酶的抑制程度不同而影响产物的量，通过比色法可测定有机磷农药残留量。蔬菜样品擦去表面泥水，取代表性食部，剪碎，取2g置于IOmL烧杯中，加5mL丙酮浸泡5min，不时振摇，加0.2g碳酸钙(对于番茄等酸性较强的样品可加0. 3 0. 4g)。若颜色较深，可加0. 2g活性炭，摇勻，过滤。取0. 5mL丙酮滤液于5mL烧杯中，吹干丙酮后，加0. 3mL缓冲液溶解。加入氧化剂 0. lmL，摇勻后放置IOmin。再加入还原剂0. 3mL，摇勻。加入酶液0. 2mL，摇勻，放置lOmin，再加入底物溶液0. 2mL，显色剂0. lmL，放置 5min后测定。分光光度计波长调至600nm，其他按常规操作，读取测定值。当测定值在0.7以下时，为未检出。当测定值在0. 7 0. 9之间时，为可能检出，但残留量较低。当测定值为0.9以上时，为检出。测定值与农药残留量正相关，测定值越高时，说明农药残留量越高。
权利要求
1. 一种乙酰胆碱酯酶基因及其突变体的核酸序列，其特征在于，该基因及其突变体的核酸序列为
2.根据权利要求1所述的乙酰胆碱酯酶基因及其突变体的核酸序列，其特征在于，所述的乙酰胆碱酯酶基因及其突变体的RT-PCR引物设计为 F :5’ -TCATGCCAGGCTGCACTTG-3’R :5’ -TCTCCCTCAGGTTCCATCTT-3’ Fl 5' -GGTACCATGAGGATATTTGCTGGCATT-3‘ Rl :5’ -TCTAGATTACGTCTCCTCGAATTGTGT-3’ Pl 5' -TGTCCTCCAGAGTGGCACA-3‘ P2 5' -TGAGGAAGTCCCCGTCTAC-3‘ 反转录PCR反应使用 Ta KaRa 公司 High Fidelity PrimeScript RT-PCR Kit 进行反转录实验；取新鲜小鼠脑组织置于研钵中，加液氮迅速研成粉末，加Trizol入勻浆管中，充分勻浆后，抽提总 RNA ；反应体系总 RNAIulPrimer/20uM P2 R IuldNTP Mixture/lOuM each IulRandom 6mers/20uMIulRNase Free dH206ul反应条件30°C, IOmin ；42°C，30min ；95°C，5min ； PCR扩增一次 PCR 使用 iTa KaRa 公司PrimeSTAR HS DNA Polymerase，进行 PCR 扩增； 反应体系 A B上述的反转录反应液2ul5XPrimeSTAR PCR BufferIOuldNTP Mixture/2. 5mM each4ulF Primer/20uMF PlIulR Primer/20uMP2 RIulPrimeSTAR HS DNA Polymerase/2. 5U/ul 0. 5ul dH2031. 5ul总体积50ul反应条件94°C，3min ；98°C，IOsec ；55°C，15sec ；72°C，lmin, 30cycles ；72°C，IOmin ； 二次 PCR 使用 iTa KaRa 公司PrimeSTAR HS DNA Polymerase，进行 PCR 扩增； 反应体系反应条件65°C，5min ；立即冰上放置2分钟然后加入下列组分 总RNAPrimer/20uM P2 R dNTP Mixture/lOuM each Random 6mers/20uM RNase Free dH20Iul Iul Iul Iul 6ul 20ul总体积上述的PCR反应液 AB Iul5XPrimeSTAR PCR Buffer10uldNTP Mixture/2. 5mM each4ulF Primer/20uM FlPl IulR Primer/20uM P2Rl Iul PrimeSTAR HS DNA Polymerase/2. 5U/ul 0. 5uldH2032. 5ul总体积50ul反应条件94°C 3min ；98°C，IOsec ；55°C，15sec ；72°C，lmin, 30cycles ；72°C，IOmin ； 全长 PCR 扩增使用 Ta Kafci 公司PrimeSTAR HS DNA Polymerase，进行全长 PCR扩增；反应体系上述的二次1/2-PCR反应液各1ul5XPrimeSTAR PCR Buffer10uldNTP Mixture/2. 5mM each4ulFlPrimer/20uMIulRl Primer/20uMIul PrimeSTAR HS DNA Polymerase/2. 5U/ul 0. 5uldH2031. 5ul总体积50ul反应条件94°C，3min ；98°C，IOsec ；50°C，15sec ；72°C，2min, 30cycles ；72°C，IOmin ； 基因克隆、测序PCR产物纯化，Kpnl/Xbal酶切克隆至pMD19_T Simple载体，测序，获得该核酸序列。
3.—种乙酰胆碱酯酶基因及其突变体的核酸序列的应用，其特征在于，通过相应的酶切位点插入原核表达载体，转入大肠杆菌细胞，在大肠杆菌细胞中表达出乙酰胆碱酯酶。
4.一种乙酰胆碱酯酶基因及其突变体的核酸序列的应用，其特征在于，通过相应的酶切位点插入真和表达载体，转入酵母，在酵母细胞中表达出乙酰胆碱酯酶。
全文摘要
本发明公开的一种乙酰胆碱酯酶基因及其突变体的核酸序列及应用，采用基因工程的方法，克隆表达乙酰胆碱酯酶基因，可获得大量的乙酰胆碱酯酶，与现有的从血液中提取胆碱酯酶的方法相比较，提高了产量，缩短了工作时间，节约了成本；从小鼠RT-PCR获取乙酰胆碱酯酶基因，原材料容易获取，引物中引入Kpnl、Xbal酶切位点，方便插入表达载体；经过测序和分析结果表明，获得的乙酰胆碱酯酶基因序列与现有序列不同，是一种新的核酸序列，通过基因表达可获得高活性的乙酰胆碱酯酶。
文档编号C12N9/18GK102154342SQ20111002856
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月26日 优先权日2011年1月26日
发明者茹晓荣 申请人:西安医学院