专利名称：：一种藻类细胞快速高密度培养方法
技术领域：
：本发明涉及藻类高密度培养，具体说是一种藻类细胞快速高密度培养方法，可用于培养藻类、生产相关产品或提供水产养殖饵料等。技术背景藻类可利用气体中的二氧化碳进行光自养，富含蛋白质、脂肪和维生素等营养物质，具有繁殖快、环境适应性强等优点，常作为水产养殖用的饵料。同时，藻类遗传及生化组成特殊性及代谢途径的复杂性，决定其潜在的营养与药学价值，人类可从中开发出大量结构特异的高附加值的生物活性成分。亚心形扁藻规模化培养存在的主要问题是藻细胞生长缓慢，倍增时间长制约了亚心形扁藻在各领域的广泛应用。藻类规模化人工培养目前主要有开放式培养和封闭式光生物反应器二类方式。开放式培养相对简单、投资低；但该方式培养微藻的产率低，存在严重的生物污染，限制藻类培养和资源开发。复杂的封闭式光生物反应器培养藻类易于控制生物污染，产率相对高，但成本相对也高。因此，开发高密度培养基及构建低廉高效的光生物反应器装置成为开发藻类资源的关键核心技术。
发明内容本发明的目的在于提供的一种藻类细胞快速高密度培养方法，本发明将优化培养基与光生物反应器联用，可达到藻类高密度培养的目的，培养所需时间短，可大幅度地减少投资，达到藻类资源开发经济可行的。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为-一种藻类细胞快速高密度培养方法，于光生物反应器中添加高密度培养基，将微藻细胞接种于光生物反应器中，接种密度为0.1xl06lxl()6cells/mL，平均光强为4000~6000lx，采用左右两个方向采光，温度控制在15~30°C，光暗时间比为10-24h:14-0h，每升培养基通气量为0.05-1L/min;所述高密度培养基是由经砂滤的天然海水灭菌冷却后添加不同营养盐制成，营养盐的添加量为NaN0341360mg/L,NaH2P04'2H2012100mg/L，Tris0~1000mg/L,CH3COOH0~2ml，EDTA-Na20~60mg/L,H3B0325~50mg/L，FeCl3.6H2015mg/L,MnCl2.4H200~0.5mg/L，ZnCl20~0.05mg/L,CoCl2.6H20(M).05mg/L,CuS04.5H2000.05mg/L。通入的气体为空气或空气与二氧化碳(包括大气中的C02及工厂排放气中的C02)的混合气，二氧化碳与空气的体积比例为0.05~10%;微藻包括来自淡水或海水的藻类，最好为绿藻或金藻。所述高密度培养基是由经砂滤的天然海水灭菌冷却后添加不同营养盐制成，营养盐的添加量最好为NaN03807mg/L，NaH2PCV2H2055mg/L，Tris830mg/L，CH3COOH0.6ml,EDTA-Na45mg/L,H3B0333.6mg/L，FeCl3'6H201.3mg/L，MnCl2.4H200.36mg/L，ZnCl20.021mg/L，CoCl2.6H200.02mg/L，CuS04.5H200.02mg/L，(NH4)6M07024.4H200，mg/L。所述光生物反应器由气源经主管路与培养单元相连接构成；其中培养单元为1个或1个以上的多个并联；培养单元由透明材质(透明材质为玻璃管和塑料袋包括聚丙烯、聚氯乙烯或聚丙烯等)制成，培养单元的左右两侧均设置有光源(光源为太阳光和人工光源)；培养单元的底部设置有由多孔材料构成的布气器，布气器下端设置有与外管路相通的进气Ch所述气源为相互并联的气瓶与压縮泵，它们分别通过气体控制阀和气体流量计与主管路相连通。所述多孔材料可为玻璃泡、筛板、珊瑚礁或气石等，最好为筛板。本发明与现有技术相比具有如下优点-本发明通过合理配置氮磷营养盐浓度、碳源、光强、有效接收转化光能、藻液的搅动程度，实现藻类短期内快速增殖，縮短培养时间。本发明的光生物反应器能充分利用转化光能，有效保障体系内部的藻液营养分布均匀一致，避免光反应器内存在的死角问题，气体交换(补偿二氧化碳)充分，降低了细胞贴壁生长，极大提高微藻培养效率。本发明适于微藻高密度规模生产，为微藻资源综合开发利用提供经济效益。图1为本发明光生物反应器正面观示意图；图2为本发明光生物反应器侧面观示意图；注l.气瓶；2.压縮泵；3.气体控制阔；4.气体流量计；5.光生物反应器;6.光源；7为布气器；(箭头表示气流方向)图3为不同培养基及培养方式扁藻细胞的生长动力学图谱。具体实施方式下面通过具体实施例对本发明的方法与结果进行说明，本发明细胞培养参照申请人已申报的专利(申请号03110981.0，发明名称一种海洋绿藻两步法生物光解水制氢方法)进行，其他试剂均为商业化的试剂。所述光生物反应器由气源经主管路与培养单元5相连接构成；所述培养单元5为多个并联；培养单元5由透明材质制成，培养单元的左右两侧均设置有光源6;培养单元5的底部设置有由筛板制成的布气器7，布气器下端设置有与外管路相通的进气口；所述气源为相互并联的气瓶1与压縮泵2，它们分别通过气体控制阀3和气体流量计4与主管路相连通。实施例1亚心形扁藻由辽宁省大连水产研究所提供，并经过本实验室平板纯化。用经砂滤的天然海水ll(TC高压蒸汽灭菌15min，冷却后添加不同营养盐，配制康维方培养基(NaN03100mg/L，NaH2P04'H2020mg/L，EDTA—Na45mg/L，H3B0333.6mg/L，FeCl3-6H201.3mg/L，MnCl2.4H200.36mg/L，ZnCl20.021mg/L，CoCl2.6H200.02mg/L，CuS04.5H200.02mg/L，(NH4)6M07024.4H200.009mg/L)。从琼脂平板挑取的单细胞藻落，经逐级放大培养，获得种子细胞。细胞接种密度为0.6xl06cells/mL，平均光强为5000lx，采用左右两个方向采光，温度控制在25'C，光暗时间比为14h:10h。依照均匀实验设计要求将氮、磷、Tris-HAc按不同比例配制成10培养基，其中氮摩尔浓度为0.0516mM，磷摩尔浓度为0.01lmM，Tris-HAc浓度从1.6540mM(以Tris计，Tris:HAc=10mM:lml)，各培养基中微量元素含量均同康维方培养基。对培养10天的结果进行藻细胞计数，并取200ml匀匀的藻A菱离心、精'洗、烘干、称重。结J艮如下<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>由上表可知7~10号培养基培养效果均明显优于其它培养基，即氮源浓度在4~16mM范围内能有效促进扁藻细胞快速增殖，其获得藻细胞数量均为在康维方培养条件下的1.98倍以上，最高达2.3倍。利用10种培养基获得扁藻细胞干重对其培养基成分进行优化，在不计微量元素的情况下，由Matlab统计软件计算得到优化培养基为N03—-N9.50mM，P043—_P0.34mM，Tris-HAc6.7mM。实施例2亚心形扁藻由辽宁省大连水产研究所提供，并经过本实验室平板纯化。5用经砂滤的天然海水ll(TC高压蒸汽灭菌15min，冷却后添加营养盐，配制康维方培养基(NaN03100mg/L，NaH2P04'H2020mg/L，EDTA—Na45mg/L，H3B0333.6mg/L，FeCl3.6H201.3mg/L，MnCl2.4H200.36mg/L，ZnCl20.021mg/L，CoCl2.6H200.02mg/L，CuS04.5H200.02mg/L，(NH4)6M07024.4H200.009mg/L)和优化培养基(NaN03807mg/L,NaH2P04.2H2055mg/L,Tris830mg/L,CH3COOH0.6ml，EDTA-Na45mg/L，H3B0333.6mg/L，FeCl3.6H201.3mg/L,MnCl2.4H200.36mg/L，ZnCl20.021mg/L，CoCl2.6H200.02mg/L，CuS04'5H200.02mg/L,(NH4)6M07024.4H200.009mg/L))。。从琼脂平板挑取的单细胞藻落，经逐级放大培养，获得种子细胞。细胞接种密度为0.6xl06CellS/mL，将藻液分为两组，一组进行康维方培养基摇瓶静置培养，每天定时摇46次，另一组放入12个培养单元装置，透明材料为玻璃管，底部通气装置多孔材料为筛板，均匀设计得到的优化培养基，通入空气培养，流速为200ml/min，平均光强为5000lx，采用左右两个方向采光，温度控制在25t:，光暗时间比为14h:10h。从图3可以看出，培养到第15天，采用摇瓶静置培养的方式，细胞密度达2X10^dls/mL，而采用光生物反应器优化培养基通空气培养，细胞密度达8X10^ells/mL。利用光生物反应器，光自屏蔽现象得以改善，光能利用率提高，气体交换通畅，縮短生产周期，降低生产成本。权利要求1.一种藻类细胞快速高密度培养方法，其特征在于于光生物反应器中添加高密度培养基，将微藻细胞接种于光生物反应器中，接种密度为0.1×106～1×106cells/mL，平均光强为4000～6000lx，采用左右两个方向采光，温度控制在15～30℃，光暗时间比为10-24h∶14-0h，每升培养基通气量为0.05～1L/min；所述高密度培养基是由经砂滤的天然海水灭菌冷却后添加不同营养盐制成，营养盐的添加量为NaNO34～1360mg/L，NaH2PO4·2H2O12～100mg/L，Tris0～1000mg/L，CH3COOH0～2ml，EDTA-Na20～60mg/L，H3BO325～50mg/L，FeCl3·6H2O1～5mg/L，MnCl2·4H2O0～0.5mg/L，ZnCl20～0.05mg/L，CoCl2·6H2O0～0.05mg/L，CuSO4·5H2O0～0.05mg/L。2.按照权利要求1所述藻类细胞快速高密度培养方法，其特征在于所述通入的气体为空气或空气与二氧化碳的混合气，二氧化碳与空气的体积比例为0.05~10%。3.按照权利要求1所述藻类细胞快速高密度培养方法，其特征在于所述微藻为绿藻或金藻。4.按照权利要求1所述藻类细胞快速高密度培养方法，其特征在于所述高密度培养基是由经砂滤的天然海水灭菌冷却后添加不同营养盐制成，营养盐的添加量为NaN03807mg/L，NaH2P(V2H20:55mg/L,Tris830mg/L,CH3COOH0.6ml,EDTA-Na45mg/L,H3B0333.6mg/L，FeCl3.6H201.3mg/L，MnCl2.4H200.36mg/L,ZnCl20.021mg/L,CoCl2-6H200.02mg/L,CuS04.5H200.02mg/L，(NH4)6M07024.4H200.009mg/L。5.按照权利要求1所述藻类细胞快速高密度培养方法，其特征在于所述光生物反应器由气源经主管路与培养单元(5)相连接构成；其中培养单元(5)可为1个或1个以上的多个并联；培养单元(5)由透明材质制成，培养单元的左右两侧均设置有光源(6);培养单元(5)的底部设置有由多孔材料构成的布气器(7)，布气器下端设置有与外管路相通的进气口；所述气源为相互并联的气瓶(1)与压縮泵(2)，它们分别通过气体控制阀(3)和气体流量计(4)与主管路相连通。6.按照权利要求5所述藻类细胞快速高密度培养方法，其特征在于所述多孔材料为玻璃泡、筛板、珊瑚礁或气石。7.按照权利要求5所述藻类细胞快速高密度培养方法，其特征在于所述多孔材料为筛板。全文摘要本发明涉及藻类高密度培养，具体说是一种藻类细胞快速高密度培养方法，于光生物反应器中添加高密度培养基，将微藻细胞接种于光生物反应器中，采用左右两个方向采光。本发明通过合理配置氮磷营养盐浓度、碳源、光强、有效接收转化光能、藻液的搅动程度，实现藻类短期内快速增殖，缩短培养时间。本发明的光生物反应器能充分利用转化光能，有效保障体系内部的藻液营养分布均匀一致，避免光反应器内存在的死角问题，气体交换充分，降低了细胞贴壁生长，极大提高微藻培养效率。本发明适于微藻高密度规模生产，为微藻资源综合开发利用提供经济效益。文档编号C12N1/12GK101265449SQ20071001059公开日2008年9月17日申请日期2007年3月14日优先权日2007年3月14日发明者远刘,卫张,虞星炬,祯郭,金美芳,陆洪斌,陈兆安申请人:中国科学院大连化学物理研究所