专利名称：芒果生长素极性输出载体MiPIN1基因及其克隆方法
技术领域：
本发明涉及一种基因及其克隆方法，具体涉及一种芒果生长素极性输出载体 MiPINl基因及其克隆方法，属于分子生物学和生物技术领域。
背景技术：
植物根具有吸收水分、养分及固定植株等多种功能，在植物组培生产过程中，不定根诱导是无性繁殖获得成功的一个关键步骤，但在木本植物的某些物种或某些营养器官内，由于本身生理特性导致不定根形成非常困难，直接影响这类植物的工厂化无性繁殖，因此探讨组培过程中不定根的形成机制对园艺植物工厂化生产有着重要意义。来源于合子胚的子叶切段的生根是一个研究不定根形成的良好系统，在这个体系中，不需要外源激素刺激就能很容易生根(Ermel et al. Planta, 2000，211(4) 563-574; Gutmann et al. Plant Cell Rep. , 1996，15(5):345-349; Jay-Allemand et al. CR. Acad. Sci. Paris. , 1991，312(7) : 369-375.)。然而，到目前为止，除了一些有关乙烯对子叶切段不定根形成的影响(Gonzalez et al. Physiol. Plant. , 1991，81(2) 227-233; Mensuali-Sodi et al. Plant Growth Regul.， 1995， 17(3) : 205-212.)外， 有关木本植物中子叶切段不定根形成的研究还很少，并且这些实验得出的结果也常相互矛盾。Li 等(Plant Growth Regul.，2008，54(2) 165-177.)发现，紫花芒(ife^i/era indica L. var Zihua)子叶切段在0. 7%的琼脂培养基上黑暗培养，不定根只在近轴端切面上形成，并研究了不同植物生长调节剂对其发育的影响，推测其可能与生长素极性运输有关，但并没有从分子水平上对芒果子叶的生长素极性运输进行研究。本发明首次从芒果中分离克隆了生长素极性输出载体基因r#i/^V/)，为从分子水平上研究芒果子叶切段不定根的形成机制奠定了基础。
发明内容
本发明的目的在于公开一种芒果生长素极性输出载体基因(MiPim)的核苷酸序列。生长素极性输出载体基因具有将生长素(如ΙΑΑ、NAA)运输出细胞的功能，对研究生长素极性运输功能十分重要。本发明的第二个目的是提供一种芒果生长素极性输出载体编码的蛋白质。同时，本发明还要提供该生长素极性输出载体基因的克隆方法。本发明所提供的芒果生长素极性输出载体基因，它来自芒果(ife/^i/fera indica L. var Zihua)，命名为ifoTYM基因，核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。上述一种芒果生长素极性输出载体基因编码的蛋白质，它来自芒果(Mmgifera indica L. var Zihua)，命名为MiPim蛋白质，氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。上述芒果生长素极性输出载体基因(ifoTYM)的克隆方法，包括如下步骤
(1)将芒果子叶切段在只含0. 7%的琼脂培养基上黑暗培养5天，采用丙酮一 SDS方法提取近轴端子叶的总RNA，用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量； (2)利用已知的木本植物及拟南芥/ΥΛ/基因序列，通过比较设计出简并引物
CD-U :5’ -CCMAACACKTTKGTYATGGGAAT-3，， CD-R :5’ -GTCATRACRCTWGYHGGAGGCAT-3‘；
通过PCR技术，利用培养5天的芒果子叶切段近轴端为材料提取RNA，以反转录后的得到cDNA为模板，以CD-U，CD-R为引物扩增获得1148bp的核苷酸片段，TA克隆，测序；
(3)根据简并引物PCR获得的DNA测序结果，分别设计3’和5’末端快速扩增(RACE) 引物
5’ -RACE 引物5’ - ATTGGAGCCTCTCGGAGTCTGGTTTCT-3，， 3’ -RACE 引物5’ - GCTTTGCTGGAAGAGTACACGAAGAA-3’ ；
以获得的总RNA为模板，经反转录合成5，-RACE-Ready cDNA和3，-RACE-Ready
cDNA,
利用 Clotech 公司的 SMARTer RACE cDNA Amplification Kit，经过 3，和 5，末端快速扩增，取2 ml PCR产物连接到PMD18-T载体，转化DH5a感受态细胞，涂平板，经蓝白斑筛选，挑取白色菌落进行培养；经EcoRI和HindIII双酶切后，电泳检测，鉴定获得重组质粒，之后对所获得的阳性重组质粒进行序列测定；根据测定的序列，再设计全长cDNA扩增引物
fPIN5 TTCGTCTCTCTTCATAAGCAGGAACC fPIN3 CTTCCTTGTTCTTGCTTTGTTCCACT PCR体系
IngredientAmount ( μ 1)PCR-GradeWater4010XAdvantage2PCRBuffer5cDNATemplate(100ng/u 1)1PrimerfPIN51PrimerfPIN3150XdNTPMix(10mMea.)150XAdvantage2PolymeraseMix1Totalvolume50
PCR程序如下
94°C条件下保持5min，94°C条件下保持30sec，循环30次，60°C条件下保持30sec，循环 30次，72°C条件下保持3min，72°C条件下再保持lOmin。
最终将PCR产物进行克隆、测序得到了芒果生长素极性输出载体基因的全长cDNA序列。获得的全长cDNA*^43bp，包括起始密码子前的上游序列和多聚A尾巴。开放阅读框部分为193^ρ，由此推得具644个氨基酸的一段序列，将此氨基酸序列在国际基因库中进行比较，表明与已发表的杨树、黄瓜、番茄、苜蓿的生长素输出载体蛋白的氨基酸同源性分别为84^^81^^79%和77%，表明通过上述克隆步骤得到编码生长素极性输出载体的基因。本发明的有益效果是该基因的克隆扩大了植物生长素极性运输载体研究的基因资源，也为植物尤其是木本植物不定根形成的分子机制研究奠定了理论基础。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例只用来说明本发明，但不限制本发明的范围。实施例1
简并引物PCR扩增芒果生长素极性输出载体基因片段 1.简并引物的设计
搜索GeneBank公布的部分木本植物及拟南芥生长素极性输出载体基因的序列，通过氨基酸序列的比对分析，找到两个保守区域对应的氨基酸序列为PNTLVMGIP和 MPPASVMT，根据这两个保守区域设计一对简并引物 CD-U :5’ -CCMAACACKTTKGTYATGGGAAT-3，， CD-R :5’ -GTCATRACRCTWGYHGGAGGCAT-3‘；
其中M指A或C ;K指G或T ;Y指C或T ;R指A或G 指A或T ;H指A、C或T。2.芒果子叶总RNA的提取
将芒果子叶切段在只含0. 7%的琼脂培养基上黑暗培养5天，采用丙酮一 SDS方法提取近轴端子叶的总RNA，用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。
3、PCR扩增
以2中的总RNA反转录后的得到cDNA为模板，以⑶-U，⑶-R为引物，采用Takara的 Ex-Taq酶进行PCR扩增，扩增产物与PMD18-T (TAKARA)载体连接，连接产物转化五colim 5α感受态细胞，采用蓝白斑筛选阳性克隆。筛选的阳性克隆经PCR进一步验证后测序，获得一个1148bp的序列。将该序列及其编码的蛋白质序列用Blast程序在GeneBank (http://www. ncbi. nlm. nih. rov/)进行核苷酸和蛋白质同源性检索，发现它与杨树、拟南芥的生长素极性输出载体基因具有较高的同源性，证实了简并引物的正确性。实施例2
芒果生长素极性输出载体基因全长cDNA的获得根据简并引物PCR获得的DNA测序结果，分别设计3’和5’末端快速扩增(RACE)引
物
5’ -RACE 引物5’ - ATTGGAGCCTCTCGGAGTCTGGTTTCT-3’ 3’ -RACE 引物5’ - GCTTTGCTGGAAGAGTACACGAAGAA-3’
按上述方法提取的芒果子叶近轴端总RNA为模板，利用Clotech公司的SMARTer RACE cDNA Amplification Kit，经反转录合成 5，-RACE-Ready cDNA 和 3，-RACE-Ready cDNA,
经过3’和5’末端快速扩增，取2 ml PCR产物连接到PMD18-T载体，转化DH5 α感受态细胞，涂平板，经蓝白斑筛选，挑取白色菌落进行培养。经EcoRI和HindIII双酶切后，电泳检测，鉴定获得重组质粒，之后对所获得的阳性重组质粒进行序列测定； 根据测定的序列，再设计全长cDNA扩增引物
5fPIN5 TTCGTCTCTCTTCATAAGCAGGAACC fPIN3 CTTCCTTGTTCTTGCTTTGTTCCACT
以上面得到的5，-RACE-Ready cDNA为模板，采用PCR扩增的方法进行cDNA克隆。 PCR反应程序为94°C变性5min，94°C变性30s, 60°C复性30s, 72°C延伸3min，30个循环后，72°C延伸lOmin，最终将PCR产物进行克隆、测序获得了芒果生长素极性输出载体基因 MiPINl全长cDNA序列。实施例3
MiPINl的序列信息及特征分析本发明的i/Z/^W全长^43bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，其第一个开放阅读框位于145 - 2079处。DNAssist软件分析表明ifoTYM共编码644个氨基酸，其氨基酸序列如 SEQ ID NO :2。通过 Expasy 网站(http//www, expasy. ch/tools/pi tool, html)预测， 该开放读码框编码一个644个氨基酸的蛋白质，分子量为70. 35 kD，理论等电点为8. 58。SEQUENCE LISTING <110>南亚热带作物研究所
<120>芒果生长素极性输出载体基因及其克隆方法
<160> 2
<210> 1
<211> 2643
<212> DNA
<213> 茫菜(Mangifera indica L.) <221> CDS
<222> (145)…(2079) <400> 1
1 acatgggggc agaatcatta caaattgccc ttcaagttcg ttatctaacg gtttcttttt
61 (^acttcccat tttgcccttc gtctctcttc ataagcagga accacttaga tcttctctca121tcttcaacaaaatcctgtaaaaaaatgatcacctggcacgatctctacaccgttttgacg181gcggtgattcctctgtatgtcgccatgatcttggcctacggctccgtccggtggtggaag241attttctctcccgatcagtgctcaggaatcaaccgtttcgtcgccatcttcgccgtccct301cttttgtccttccatttcatttctactaacaatccttacgccatgaacttccgtttcata361gccgcggacactctgcagaaaattatcatgctctttgcgctagcgatttggaccaacttc421acaaaaaatggcagccttgaatggatgattacgattttttctctttcaactttgccaaac481actctggttatggggattcctctgcttatcgccatgtacggcaagtactccgggagtcta541atggtgcagattgtggttttacagtgtataatttggtacactttactgttatttctcttc601gagtaccgtggcgcgaggatgttgattatggagcagttcccggagaccgccgcgtcgata661gtttcgttcaaagttggctccgatgtggtgtcgcttgacggcagagacttcctggagact721gatgcagaaattggtgacggtggaaagcttcatgttacagtgaggaaatctaatgcttcg781agaaggtctttaggaccctgttcgcttccggcattaactcCgCggCCgtCcaatctcacc841ggcgccgaaatttacagcttgagctcgtcgagaaaccagaccccgagaggctccaatttc901aaccactctgatttttacaacatgatgggcgtccagggatttccaggcggaagactttca961 aatttcggtc ctgccgattt gtactctgtg caatcctcca gagggcctac tccaaggcca
1021tcaaattttgaagagaattgcggacaaataatttcttctcctagattcggattttatccg1081gctcaaactgtaaccgcttcgtacccagctccggatcccgagttctctagctcaatttct1141aaagctacaaaaactattcagaaccagaaccagaatcagaatccgaatcagcaacaacag1201caaatgaatttgagcaataa3.3. C 3.3.3. C C 3. gacgccaaagagcttcacatgtttgtgtgg1261agctccagcgcctcccccgtctcggaagttgccggtggacttcatgtttttggtggggcg1321gatttcggagcttccgagcaatctggacggtctgatcaaggagctaaagagatcaggatg1381ttggtcactgatcatcctcaaaatggggaaaacaaagatttcagctttgctggaagagta1441cacgaagaagaagaagaagaagataaggagaaagaaggacccactggattcaataaactt1501gggtctagttcaaccgcggagttgcacccaaaagctgccgccggagtcccggatgccggt1561gctggaaaaatgatgcctccggcgagcgttatgacacgtctgatcttgatcatggtgtgg1621cgaaaactaatccgcaatccC 3.3. C 3. C 3. 3. Ctctagtctcattggagtggtttggtctctt1681atcgctttcaggtggcatgtggcaatgcct3.3.3.3. 3.3. 3. Cagcagtcaatctcaattctg1741tcggatgcgggtctcggaatggctatgttcagcttaggtttgtttatggctctccaaccc1801aaaatcatagcttgtggcaactcagttgcaacattcgccatggccattagattcctcacc1861ggccccgccgtaatggccgctgcttccattgccgtcggcctccgtggtaacctccttcgc1921gttgcaatcgtccaggccgcactgccacaaggaattgtcccgtttgtatttgcgaaagag1981tacaatgtacatccagccattcttagtactgcggtcatatttggaatgttgatagcatta2041ccaattactctggtctgctacatcctactgggattgtgagataaaaccttctgaatgcaa2101gagaggacttagaagggaatattcatggcttgggttgggaagcaatgattgggtagctag21613.3.3.3. C 3.3. C Cgggattttgttgaaatcacatgaagattttccgggaaagtagaagagtga2221agaattaagctaagctccaaaataattggagctttagaagaattaaagccttgatatgag2281gatcatgcccccactagaagccaaagttgtcaccaatttcaggagtctatattttttagt2341ggaacaaagcaagaacaaggaagaagaaggagacatttaagagggaaaaaaggaagctgg2401tggttagtga 3. 3.3. 3.3.ttaagaagaggatgaatgagattaagaaga2461ggaatgggaagaaggttttttcttttttttttttggttttatttttgttgttttttatgc2521ttttgttgttagtgttggcatttgattgtactaagatccagcaattatttgcctttgtcg2581tttttgctttgataaactttgaggcaaaga3.3. C 3.3.3.3.3.3.aaattaaagg^3.3.3.3.3.3.3.3.3.2641
<210>2 <211> 644 <212> PRT
<213> 茫菜(Mangifera indica L.) <400> 2
1 MITWHDLYTVLTAVIPLYVAMILAYGSVRWWKIFSPDQCSGINRFVAIFAVPLLSFHFIS 61 TNNPYAMNFRFIAADTLQKIIMLFALAIWTNFTKNGSLEWMITIFSLSTLPNTLVMGIPL 121LIAMYGKYSGSLMVQIVVLQCIIWYTLLLFLFEYRGARMLIMEQFPETAASIVSFKVGSD 181 VVSLDGRDFLETDAEI⑶GGKLHVTVRKSNASRRSLGPCSLPALTPRPSNLTGAEIYSLS 241SSRNQTPRGSNFNHSDFYNMMGVQGFPGGRLSNFGPADLYSVQSSRGPTPRPSNFEENCG301 QIISSPRFGFYPAQTVTASYPAPDPEFSSSISKATKTIQNQNQNQNPNQQQQQMNLSNKT 361NHDAKELHMFVWSSSASPVSEVAGGLHVFGGADFGASEQSGRSDQGAKEIRMLVTDHPQN 421GENKDFSFAGRVHEEEEEEDKEKEGPTGFNKLGSSSTAELHPKAAAGVPDAGAGKMMPPA 481 SVMTRLILIMVWRKLIRNPNTYSSLIGVVffSLIAFRWHVAMPKIIQQSISILSDAGLGMA 541 MFSLGLFMALQPKIIACGNSVATFAMAIRFLTGPAVMAAASIAVGLRGNLLRVAIVQAAL 601 PQGIVPFVFAKEYNVHPAILSTAVIFGMLIALPITLVCYILLGL
权利要求
1.一种芒果生长素极性输出载体基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.一种芒果生长素极性输出载体基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所7J\ ο
3.—种芒果生长素极性输出载体基因的克隆方法，包括如下步骤(1)将芒果子叶切段在只含0. 7%的琼脂培养基上暗室培养5天，采用丙酮一 SDS方法提取近轴端子叶的总RNA，用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定 RNA含量；(2)利用已知的木本植物及拟南芥/ΥΛ/基因序列，通过比较设计出简并引物CD-U :5’ -CCMAACACKTTKGTYATGGGAAT-3，，CD-R :5’ -GTCATRACRCTWGYHGGAGGCAT-3‘；通过PCR技术，利用培养5天的芒果子叶切段近轴端为材料提取的RNA反转录后得到 cDNA为模板，以⑶-U，⑶-R为引物扩增获得1148bp的核苷酸片段，经过TA克隆，测序；(3)根据简并引物PCR获得的DNA测序结果，分别设计3’和5’末端快速扩增引物5’ -RACE 引物5’ - ATTGGAGCCTCTCGGAGTCTGGTTTCT-3，，3’ -RACE 引物5’ - GCTTTGCTGGAAGAGTACACGAAGAA-3’ ；以获得的总RNA为模板，经反转录合成5，-RACE-Ready cDNA和3，-RACE-Ready cDNA，利用 Clotech 公司的 SMARTer RACE cDNA Amplification Kit，经过 3，和 5，末端快速扩增，取aiil PCR产物连接到PMD18-T载体，转化DH5a感受态细胞，涂平板，经蓝白斑筛选， 挑取白色菌落进行培养；经EcoRI和HindIII双酶切后，电泳检测，鉴定获得重组质粒，之后对所获得的阳性重组质粒进行序列测定；根据测定的序列，再设计全长cDNA扩增引物fPIN5 TTCGTCTCTCTTCATAAGCAGGAACC，fPIN3 CTTCCTTGTTCTTGCTTTGTTCCACT ；最终将PCR产物进行克隆、测序获得了芒果生长素极性输出载体基因JfoTYM全长cDNA 序列。
4.根据权利要求3所述的一种生长素极性输出载体基因的克隆方法，其特征在于所述的 PCR体系为40 μ IPCR-Grade Water，5 μ 1 IOX Advantage 2 PCR Buffer, 1 μ 1 100 ng/mlcDNA Template ，1 μ Primer fPIN5,1 μ 1 Primer fPIN3,1 μ 1 50X dNTP Mix ，1 μ 1 50X Advantage 2 Polymerase Mix。
5.根据权利要求3或4所述的一种生长素极性输出载体基因的克隆方法，其特征在于 所述的PCR反应程序为94°C变性5min，94°C变性30s, 60°C复性30s, 72°C延伸3min，30 个循环后，72°C延伸lOmin，最终将PCR产物进行克隆、测序获得了芒果生长素极性输出载体基因MiPINl全长cDNA序列。
全文摘要
本发明公开了一种芒果生长素极性输出载体MiPIN1基因及其克隆方法，所述基因编码的核苷酸序列，cDNA全长序列如SEQIDNO1，氨基酸序列如SEQIDNO2；提取培养5天的芒果子叶RNA，以OligodT为引物反转录合成第一链cDNA，以此为模板，采用简并引物PCR的方法克隆得到MiPIN1基因的中间片段；之后采用cDNA末端快速扩增技术得到了芒果生长素极性输出载体的全长cDNA；该基因的克隆扩大了植物生长素极性运输载体研究的基因资源，也为植物尤其是木本植物不定根形成的分子机理研究奠定了基础。
文档编号C12N15/29GK102268442SQ20111002896
公开日2011年12月7日 申请日期2011年1月27日 优先权日2011年1月27日
发明者吴青松, 孙光明, 张智, 李运合 申请人:中国热带农业科学院南亚热带作物研究所