专利名称：评价牛个体中与脂肪大理石纹相关的遗传能力的基因标记的制作方法
技术领域：
本发明涉及评价牛个体中与脂肪大理石纹相关的遗传能力的标记和使用该标记的评价与脂肪大理石纹相关的遗传能力的方法。
背景技术：
牛的肉质或带骨肉重量是直接关系价格的经济性状。尤其是，脂肪大理石纹被认为是脂肪蓄积在肌肉组织内的状态，认为脂肪呈霜状又细又浓密地存在于其中是好的，它对柔软度等肉质有大的影响。对于如何评价与这种肉质或带骨肉重量相关的遗传能力，是否有利于牛的改良，人们提出了根据育种值进行的方法等，并正在使用。人们认为肉质或带骨肉重量是与多个基因相关的量的性状。要是能够鉴定出对肉质或带骨肉重量有较大影响的基因或基因组区域WTL)，能够判断优良的基因型，就可以在牛改良中对其进行利用。到目前为止，已经报道了通过使用日本黑牛(黒毛和種)种雄牛的父方半亲同胞的家系的QTL分析，发现在牛4号染色体上存在对脂肪大理石纹有影响的基因组区域(参照非专利文献1)。此后，在其它的日本黑牛种雄牛中4号染色体上的相同区域发现了脂肪大理石纹QTL，通过单倍型比较和关联分析，弄清楚了该QTL存在于46cM附近的3. 7Mb的区域内(参照非专利文献2)。现有技术文献非专利文献非专利文献1Mizoguchi et al. (2006)Animal Genetics 37,51-非专利文献2Yokouchi et al. (2009) Animal Genetics 40,945-95
发明内容
发明要解决的问题但是，实际上，由于不清楚究竟哪个遗传信息承担着优良型遗传性状，因此在评价牛个体中与脂肪大理石纹相关的遗传能力时，无法使用基因型等遗传信息。因此，本发明的目的在于提供评价牛个体中与脂肪大理石纹相关的遗传能力的标记和使用该标记的评价与脂肪大理石纹相关的遗传能力的方法。用于解决问题的方法本发明人通过详细分析牛4号染色体上的影响脂肪大理石纹的基因组区域，发现位于牛pantophysin基因的5’上游域的SNP(单核苷酸多态)中，Sl部位(SNP27)中的 SNP对脂肪大理石纹有影响，因此，含有Sl部位且Sl部位中的碱基是A的DNA可用作使脂肪大理石纹增加的基因标记。此外，SNP29、SNP30、ARS-BFGL-NGS-20161、BTB-00183730、 BTA-70505-no-rs各SNP与Sl部位的SNP处于连锁不平衡，而且，在Sl部位的碱基为A的牛个体的肌肉间脂肪组织中，pantophysin基因的表达量相对变高，由此明了 Sl部位是QTL 的责任SNP，从而完成了本发明。
这里，本说明书中所谓Sl部位(SNP27)是对应于牛基因组序列(Btau4. 0)4号染色体的第49100585位的位置，是对应于序列号1中牛pantophysin基因外显子1的5，上游侧第718位的位置。此外，SNP^是对应于牛基因组序列(Btau4. 0)4号染色体的第49101189位的位置，是对应于序列号1中牛pantophysin基因外显子1的5’上游侧第1322位的位置。SNP30是对应于牛基因组序列(Btau4. 0) 4号染色体的第49101317位的位置，是对应于序列号1中，牛pantophysin基因外显子1的5’上游侧第1450位的位置。ARS-BFGL-NGS-20161 (NCBI AssayID :ss86290215)是对应于牛基因组序列 (Btau4. 0)4号染色体的第49036518位的位置，是对应于序列号2中，牛pantophysin基因外显子7的3’下游侧第27348位的位置。BTB-00183730 (NCBI Reference SNP :rs43398415)是对应于牛基因组序列 (Btau4. 0)4号染色体的第49109714位的位置，是对应于序列号3中，牛pantophysin基因的外显子1的5’上游侧第9847位的位置。BTA-70505-no-rs (NCBI Reference SNP :rs41602690)是对应于牛基因组序列 (Btau4. 0)4号染色体的第49147499位的位置，是对应于序列号4中，牛pantophysin基因外显子1的5’上游侧第47632位的位置。这里，本说明书中，在pantophysin基因中，编码pantophysin蛋白质的DNA链作为有义DNA链。因此，Btau4.0中记载的牛基因组序列成为反义DNA链。本说明书中，只要没有特别说明，就用有义DNA链的碱基表示SNP的碱基。而且，本说明书中，外显子1的5’上游侧第N位表示在外显子1的外侧相邻的碱基中，以上游侧的碱基作为第1位，向上游方向计数的编号。而且，本说明书中，外显子7的3’下游侧第N位表示在外显子7的外侧相邻的碱基中，以下游侧的碱基作为第1位，向下游方向计数的编号。此外，各SNP用牛基因组序列(Btau4. 0)4号染色体上的位置、和从用序列号1_4 表示的pantophysin基因的外显子1开始向上游方向计数的碱基编号或从pantophysin基因的外显子7开始向下游方向计数的碱基编号来指出，但只要位于与这些位置对应的位置即可，在由于个体的不同导致含有这些SNP的基因组DNA上存在碱基缺失或插入时，不一定需要连表示位置的数字都一致。也就是说，本发明涉及的DNA是分离的DNA，其特征在于含有对应于序列号1中牛 pantophysin基因外显子1的5’上游域第718位碱基的碱基，且该所含碱基为A。此外，本发明中涉及的DNA是分离的DNA，其特征在于含有对应于序列号1中牛 pantophysin基因外显子1的5’上游域第1322位碱基的碱基，且该所含碱基是G。本发明中涉及的DNA是分离的DNA，其特征在于含有对应于序列号1中牛 pantophysin基因外显子1的5’上游域第1450位碱基的碱基，且该所含碱基是T。本发明中涉及的标记是评价使牛个体中脂肪大理石纹的程度增加的遗传能力的标记，其特征在于选自由含有对应于序列号1中牛pantophysin基因外显子1的5’上游域第718位、第1322位、第1450位、序列号3中牛pantophysin基因外显子1的5’上游域第 9847位、序列号4中牛pantophysin基因外显子1的5，上游域第47632位、或序列号2中牛pantophysin基因外显子7的3，下游域第27348位碱基的碱基的DNA构成的组。
本发明中涉及的评价方法是评价使牛个体中脂肪大理石纹的程度增加的遗传能力的评价方法，其包括以下步骤，即对于从牛个体中分离的DNA，判断至少一个等位基因中， 对应于序列号1中牛pantophysin基因外显子1的5’上游域第718位碱基的碱基是否是 A0本发明中涉及的评价方法是评价使牛个体中脂肪大理石纹的程度增加的遗传能力的评价方法，其包括以下步骤，即对于从牛个体中分离的DNA，判断至少一个等位基因中， 对应于序列号1中牛pantophysin基因外显子1的5’上游域第1322位碱基的碱基是否是 G0本发明涉及的评价方法是评价使牛个体中脂肪大理石纹的程度增加的遗传能力的评价方法，其包括以下步骤，即对于从牛个体中分离的DNA，判断至少一个等位基因中，对应于序列号1中牛pantophysin基因外显子1的5’上游域第1450位碱基的碱基是否是T。本发明涉及的评价方法是评价使牛个体中脂肪大理石纹的程度增加的遗传能力的评价方法，其包括以下步骤，即对于从牛个体中分离的DNA，判断至少一个等位基因中，对应于序列号2中牛pantophysin基因外显子7的3’下游域第27348位碱基的碱基是否是 A0本发明涉及的评价方法是评价使牛个体中脂肪大理石纹的程度增加的遗传能力的评价方法，其包括以下步骤，即对于从牛个体中分离的DNA，判断至少一个等位基因中，对应于序列号3中牛pantophysin基因外显子1的5’上游域第9847位碱基的碱基是否是C。本发明涉及的评价方法是评价使牛个体中脂肪大理石纹的程度增加的遗传能力的评价方法，其包括以下步骤，即对于从牛个体中分离的DNA，判断至少一个等位基因中，对应于序列号4中牛pantophysin基因外显子1的5’上游域第47632位碱基的碱基是否是 T。这里，本发明中涉及的任一评价方法都优选还包括以下步骤，即评价使牛个体中脂肪大理石纹的程度增加的遗传能力比对应于序列号1中牛pantophysin基因外显子1的 5’上游域第718位碱基的碱基为G的牛个体要高。本发明中涉及的选择方法是选择使脂肪大理石纹的程度增加的遗传能力高的牛个体的选择方法，其特征在于包括通过上述任一种评价方法，评价牛个体的这种遗传能力的评价步骤。优选还包括通过该评价步骤选择被评价为遗传能力高的牛个体的步骤。发明的效果通过本发明，可以提供评价牛个体中与脂肪大理石纹相关的遗传能力的标记和使用该标记的评价与脂肪大理石纹相关的遗传能力的方法。
图1是在本发明的一个实施方案中，使用日本黑牛阉割牛19112头中的脂肪大理石纹等级上等组406头(脂肪大理石纹等级(BMS) 9以上)和下等组412头(BMS 4以下)， 对牛4号染色体上沈个位置的SNP标记中由相邻的标记对构成的Q单倍型与脂肪大理石纹等级的关联性(A)、和各SNP间的连锁不平衡(B)进行分析的图。图2是表示本发明的一个实施方案中，存在于包括牛4号染色体上的SNP20和 SNP21的约0. 7Mb的连锁不平衡区域中的4个基因，和在均勻保有优良型单倍型(Q)或非优良型单倍型(q)的牛个体中的肌肉间脂肪组织中的各基因表达量的图(N表示个体数)。图3是表示本发明的一个实施方案中，存在于pantophysin基因外显子1的5’ 上游域2kb中的6个SNP(SNP27-3》的配置、和含有6个SNP的1. 8kb或只含有SNP27的 0. 91Λ的优良型单倍型(Q)和非优良型单倍型(q)中的转录活性(A)、6个SNP中只有SNP27 被替代为q型时(-l.m^Q)_S27q/pGL3)的转录活性(B)的图。图4是表示本发明的一个实施方案中日本黑牛组中SNP27-32各SNP间的连锁不平衡度的图。图5是表示本发明的一个实施方案中日本黑牛组中SNP27与已知的各SNP间的连锁不平衡度的图。
具体实施例方式以下，列举实施例，并详细说明基于上述认识完成的本发明的实施方案。实施方案和实施例中没有特别说明时，使用J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual(3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York(2001) ；F.Μ. Ausubel, R. Brent, R. Ε. Kingston, D. D. Moore, J. G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等标准的实验方案集中记载的方法、或其经修饰、改变后的方法。而且，在使用市售的试剂盒或测定装置时，没有特别说明时，就使用它们附带的实验方案。而且，本发明的目的、特征、优势和观点，通过本说明书的记载，对于本领域技术人员来说是清楚的，根据本说明书的记载，如果是本领域技术人员，就可以容易地再现本发明。以下记载的发明实施方案和具体的实施例等是表示本发明的优选实施方案，是用于示例或说明，本发明并不限于此。本领域技术人员清楚的是，在本说明书公开的本发明的意图和范围内，基于本说明书的记载，可以进行各种改变和修饰。牛pantophysin 基因周边的 SNP牛基因组序列(Btau4. 0)中，对应于有义DNA链的Sl部位的部位的碱基为C，因此有义DNA链上的pantophysin基因外显子1的5’上游域的Sl部位中的碱基为G，但如实施例所示，Sl部位中的碱基为A时，pantophysin基因高度表达，脂肪大理石纹的程度增加。 因此，在牛pantophysin基因外显子1的5’上游域的SNP中，如果确定Sl部位上的碱基， 可以评价、预测与脂肪大理石纹相关的遗传能力。而且，所谓牛pantophysin基因外显子1 的5’上游域，是指作为牛pantophysin基因转录区域的外显子1的外侧的上游侧区域。作为与Sl部位的SNP处于连锁不平衡、存在于pantophysin基因外显子1的5’上游域的 SNP，可以列举例如、SNP29、SNP30、BTB-00183730、BTA-70505-no-rs。此外，作为与 Sl部位的SNP处于连锁不平衡、且存在于pantophysin基因外显子7的3’下游域的SNP， 可以列举ARS-BreL-NGS-20161。而且，所谓牛pantophysin基因外显子7的3，下游域，是指作为牛pantophysin基因转录区域的外显子7的外侧的下游侧区域。具体而言，当Sl部位中的碱基是G时，SNP29中的碱基为C，SNP30中的碱基是 A, ARS-BFGL-NGS-20161 中的碱基为 G，BTB-00183730 中的碱基为 T，BTA-70505-no-rs 中的碱基为C。另一方面，当Sl部位中的碱基为A时，SNP29中的碱基为G，SNP30中的碱基为 T，ARS-BFGL-NGS-20161 中的碱基为 A，BTB-00183730 中的碱基为 C，BTA-70505-no-rs 中的碱基为T。因此，通过测定在牛pantophysin基因外显子1的5’上游域的SNP中的 SNP29, SNP30、BTB-00183730、BTA-70505-no-rs中的碱基，研究是否存在变异，或通过测定牛pantophysin基因外显子7的3，下游域的ARS-BreL-NGS-20161中的碱基，研究是否存在变异，可以与Sl部位一样，评价、预测与脂肪大理石纹相关的遗传能力。标记本发明中，用于评价牛个体的脂肪大理石纹的程度的标记可以是包括牛基因组序列(Btau4.0)中的Sl部位的分离的牛基因组DNA。此外，Sl部位的碱基发生变异时，在与 Sl部位的SNP处于连锁不平衡的SNP中也高概率地发生碱基变异，因此标记也可以是含有与Sl部位的SNP处于连锁不平衡的SNP的分离的牛基因组DNA，作为这种牛基因组DNA，可以列举例如，含有 SNP^、SNP30、ARS-BFGL-NGS-20161、BTB-00183730、和 BTA-70505-no-rs 等的基因组DNA。标记为DNA时，为了检测上述SNP，可以测定具有SNP的碱基。具体是，可以直接测定碱基序列，也可以利用PCR，也可以利用RFLP，对检测方法没有特别限定。直接检测SNP 时，测序的基因组DNA中不必含有例如整个pantophysin基因，如果含有具有要测序的SNP 的碱基，能够测定该碱基，就足矣。与脂肪大理石纹相关的遗传能力的评价方法对于从牛个体分离的DNA，可以通过测定Sl部位的碱基其本身来研究至少一个等位基因中，Sl部位中的碱基是否是A，例如，可以从牛细胞中提取基因组DNA，用常规方法测定Sl部位的碱基。Sl部位的碱基如果是G/A杂合或A纯合，其提高牛的脂肪大理石纹程度的遗传能力可以评价为比G纯合的个体要高。此外，如果是A纯合，其提高牛的脂肪大理石纹程度的遗传能力可以评价为比G/A杂合的个体还要高。这里，尽管通过测定Sl部位的碱基其本身来研究Sl部位的碱基是最正确的， 但还可以研究与Sl部位处于连锁不平衡的SNP，根据其结果，推定Sl部位的碱基。作为与Sl部位处于连锁不平衡的SNP，可以列举，例如SNP29、SNP30、ARS-BFGL-NGS-20161、 BTB-OO183730、和BTA-70505-no-rs等。具体而言，对于从牛个体分离的DNA，可以研究至少一个等位基因中，SNP29、SNP30、ARS-BFGL-NGS-20161、BTB-00183730、和 BTA-70505-no-rs 中的碱基是否分别是G、T、A、C和T。不需要研究所有的SNP，可以研究最低1个SNP， 但为了更正确地推定Sl部位的碱基，优选研究SNP29、SNP30、ARS-BFGL-NGS-2016U BTB-OO183730、和BTA-70505-no-rs中的任意两个以上的SNP，更优选研究任意3个SNP，进一步优选研究任意四个SNP，最优选研究所有五个SNP。也就是说，SNP29的碱基如果是C/G杂合或G纯合，则可以推定其Sl部位的碱基分别是G/A杂合或A纯合，其提高牛的脂肪大理石纹程度的遗传能力可以评价为高于SNP^ 碱基为C纯合的个体、或Sl部位的碱基为G纯合的个体。如果SNP^的碱基为G纯合，则其提高牛的脂肪大理石纹程度的遗传能力可以评价为比SNP^的碱基为C/G杂合的个体、 或Sl部位的碱基为G/A杂合的个体要更高。如果SNP30的碱基为A/T杂合或T纯合，则可以推定Sl部位的碱基分别为G/A杂合或A纯合，其提高牛的脂肪大理石纹程度的遗传能力可以评价为高于SNP30的碱基为A
7纯合的个体、或Sl部位的碱基为G纯合的个体。SNP30的碱基如果是T纯合，则其提高牛的脂肪大理石纹程度的遗传能力可以评价为比SNP30的碱基为A/T杂合的个体、或Sl部位的碱基为G/A杂合的个体要更高。ARS-BFGL-NGS-20161的碱基如果是G/A杂合或A纯合，则可以推定Sl部位的碱基分别为G/A杂合或A纯合，其提高牛的脂肪大理石纹程度的遗传能力可以评价为高于ARS-BreL-NGS-20161的碱基为G纯合的个体、或Sl部位的碱基为G纯合的个体。如果 ARS-BFGL-NGS-20161的碱基为A纯合，则可以评价其提高牛的脂肪大理石纹程度的遗传能力比ARS-BreL-NGS-20161的碱基为G/A杂合的个体、或Sl部位的碱基为G/A杂合的个体要更高。如果BTB-OO183730的碱基为T/C杂合或C纯合，则可以推定Sl部位的碱基分别为G/A杂合或A纯合，其提高牛的脂肪大理石纹程度的遗传能力可以评价为高于BTB-00183730的碱基为T纯合的个体、或Sl部位的碱基为G纯合的个体。如果 BTB-00183730的碱基为C纯合，则其提高牛的脂肪大理石纹程度的遗传能力可以评价为比 BTB-00183730的碱基为T/C杂合的个体、或Sl部位的碱基为G/A杂合的个体要更高。
如果BTA-70505-no-rs的碱基为C/T杂合或T纯合，可以推定Sl部位的碱基分别为G/A杂合或A纯合，其提高牛的脂肪大理石纹程度的遗传能力可以评价为高于BTA-70505-no-rs的碱基为C纯合的个体、或Sl部位的碱基为G纯合的个体。如果 BTA-70505-no-rs的碱基是T纯合，则其提高牛的脂肪大理石纹程度的遗传能力可以评价为比BTA-70505-no-rs的碱基为C/T杂合的个体、或Sl部位的碱基为G/A杂合的个体要更尚ο此外，使用以上评价方法，可以从多头牛中，选择出提高脂肪大理石纹程度的遗传能力高的牛个体。也就是说，可以测定各牛个体中pantophysin基因外显子1的5’上游域的 Sl部位中的碱基，选择在一个或两个等位基因中，该Sl部位的碱基为A的个体。或者，可以在各牛个体中，测定 SNP29、SNP30、ARS-BFGL-NGS-20161、BTB-00183730、BTA-70505-no-rs 任一者的SNP的碱基，选择在一个或两个等位基因中，SNP^的碱基为G、SNP30的碱基为T、 ARS-BFGL-NGS-20161 的碱基为 A、BTB_00183730 的碱基为 C、或 BTA-70505-no-rs 的碱基为 T的个体。这里，由于pantophysin基因、pantophysin基因外显子1的5，上游域、和 pantophysin基因外显子7的3’下游域在牛中高度保守，因此作为实施本发明的对象的牛的种类不特别限制于日本黑牛、日本褐牛、荷兰乳牛(Holstein)种等。实施例以下，用实施例和图更详细地说明。[1]DNA的提取以及微卫星和SNP分型法基因组DNA通过常规方法，从精液、肾周围脂肪或血液中提取。使用能够特异性扩增目的基因组片段的引物，通过PCR法，扩增该基因组区域。就微卫星而言，荧光标识反向引物，用ABI 3730 DNA分析仪(Applied Biosystem公司)对PCR扩增产物进行电泳，之后通过用GENESCAN和GeneMapper软件(Applied Biosystem公司)进行分析来分型。就SNP 而言，通过用 Big Dye Terminator v. 3. 1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystem 公司)进行PCR扩增产物的直接测序，来确定序列，进行SNP的检测和分型。各SNP所使用的引物(序列号5-66)示于表1。表1
权利要求
1.分离的DNA，其特征在于，含有对应于序列号1中牛pantophysin基因外显子1的5’ 上游域第718位碱基的碱基，且该所含碱基是A。
2.分离的DNA，其特征在于，含有对应于序列号1中牛pantophysin基因外显子1的5’ 上游域第1322位碱基的碱基，且该所含碱基是G。
3.分离的DNA，其特征在于，含有对应于序列号1中牛pantophysin基因外显子1的5’ 上游域第1450位碱基的碱基，且该所含碱基是T。
4.评价使牛个体中脂肪大理石纹的程度增加的遗传能力的标记，其特征在于，选自由含有对应于序列号1中牛pantophysin基因的外显子1的5’上游域第718位、第1322位、 第1450位、序列号3中牛pantophysin基因外显子1的5’上游域第9847位、序列号4中牛pantophysin基因外显子1的5，上游域第47632位、或序列号2中牛pantophysin基因外显子7的3，下游域第27348位碱基的碱基的DNA组成的组。
5.评价使牛个体中脂肪大理石纹的程度增加的遗传能力的评价方法，其包括以下步骤，即对于从前述牛个体中分离的DNA，判断至少一个等位基因中，对应于序列号1中牛 pantophysin基因外显子1的5’上游域第718位碱基的碱基是否是A。
6.评价使牛个体中脂肪大理石纹的程度增加的遗传能力的评价方法，其包括以下步骤，即对于从前述牛个体中分离的DNA，判断至少一个等位基因中，对应于序列号1中牛 pantophysin基因外显子1的5’上游域第1322位碱基的碱基是否是G。
7.评价使牛个体中脂肪大理石纹的程度增加的遗传能力的评价方法，其包括以下步骤，即对于从前述牛个体中分离的DNA，判断至少一个等位基因中，对应于序列号1中牛 pantophysin基因外显子1的5’上游域第1450位碱基的碱基是否是T。
8.评价使牛个体中脂肪大理石纹的程度增加的遗传能力的评价方法，其包括以下步骤，即对于从前述牛个体中分离的DNA，判断至少一个等位基因中，对应于序列号2中牛 pantophysin基因外显子7的3’下游域第27348位碱基的碱基是否是A。
9.评价使牛个体中脂肪大理石纹的程度增加的遗传能力的评价方法，其包括以下步骤，即对于从前述牛个体中分离的DNA，判断至少一个等位基因中，对应于序列号3中牛 pantophysin基因外显子1的5’上游域第9847位碱基的碱基是否是C。
10.评价使牛个体中脂肪大理石纹的程度增加的遗传能力的评价方法，其包括以下步骤，即对于从前述牛个体中分离的DNA，判断至少一个等位基因中，对应于序列号4中牛 pantophysin基因外显子1的5’上游域第47632位碱基的碱基是否是T。
11.根据权利要求5-10任一项所述的评价方法，其特征在于，还包括以下步骤，即评价前述使牛个体中脂肪大理石纹的程度增加的遗传能力比对应于序列号1中牛pantophysin 基因外显子1的5’上游域第718位碱基的碱基为G的牛个体更高。
12.选择使牛个体中脂肪大理石纹的程度增加的遗传能力高的牛个体的选择方法，其中包括通过权利要求5-10任一项所述的评价方法评价牛个体的这种遗传能力的评价步马聚ο
13.根据权利要求12所述的选择方法，其中还包括通过所述评价步骤选择被评价为遗传能力高的牛个体的步骤。
全文摘要
本发明提供评价牛个体中与脂肪大理石纹相关的遗传能力的标记和使用该标记的评价与脂肪大理石纹相关的遗传能力的方法。判断牛pantophysin基因外显子1的5’上游域第718位的碱基在至少一个等位基因中是否变异为A，碱基变异为A时，评价使该个体的脂肪大理石纹增加的遗传能力比前述碱基是G的牛个体要高。
文档编号C12N15/11GK102465124SQ20111006351
公开日2012年5月23日 申请日期2011年3月16日 优先权日2010年11月15日
发明者横内耕, 渡边敏夫, 高须贺晶子, 龙田健 申请人:社团法人畜产技术协会