专利名称：穿龙薯蓣内生真菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物内生真菌，尤其涉及来源于穿龙薯蓣类植物的内生真菌，本发明还涉及该穿龙薯蓣内生真菌在生物转化薯蓣皂苷类成分中的应用，属于植物内生真菌及其应用领域。
背景技术：
薯蓣皂苷(dioscin)属于甾体皂苷，水解后可以得到薯蓣皂苷元(diosgenin)， 不仅具有显著的抗肿瘤、抗炎、降血脂、免疫调节、抗艾滋病等作用，而且是目前世界上合成300多种留体激素和避孕药物的重要原料。薯蓣皂苷主要存在于薯蓣科植物中，目前中国以穿龙薯截(Dioscorea nipponica)、盾叶薯截(Dioscorea zingiberensis)禾口黄山药 (Dioscorea panthaica)等植物的根茎作为提取皂苷的主要原料，进行加工制剂。例如，生产临床常用的预防和治疗冠心病、心绞痛的药典药物“地奥心血康”等。但随着皂素工业的发展和国内、国际市场对薯蓣皂苷元需求量的增加，野生资源已渐趋衰竭，人工栽培面积有限，且薯蓣根茎类药材的栽培周期较长，从天然植物中提取薯蓣皂苷类原料难以满足市场日益增长的需求。所以寻求替代品或者加大已有资源的利用势在必行。内生真菌与宿主植物具有互惠共生的关系，有些内生菌具有促进宿主植物合成活性成分的能力，通过内生菌的作用增加药用植物活性成分的产量。如果能从穿龙薯蓣植物中分离得到一株内生真菌，将其制备成种子液添加到薯蓣类药材中进行发酵，能够促使药材中存在的物质合成薯蓣皂苷元，这将极大的提高对薯蓣类药材的利用度。
发明内容
本发明目的之一是提供一种穿龙薯蓣中分离得到的新的内生真菌；本发明目的之二是将所分离到的内生真菌应用于生物转化薯蓣皂苷类成分；本发明目的之三是将生物转化薯蓣皂苷类成分的转化条件进行优化筛选得到一种最佳的转化方法。本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的本发明从穿龙薯蓣叶片中分离得到一株内生真菌(Fusarium sp.)C39，其微生物保藏号是CGMCC NO. 4616 ；其分类命名是镰孢(Fusarium sp.)；保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2011年3月1日。本发明内生真菌(Fusarium sp. )C39的形态学特征将内生真菌(Fusarium sp.) C39菌接种到马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基上，25°C，暗培养4天，观察到整个菌落致密，直径4. Ocm,正面呈白色绒毛状，气生菌丝高2mm，背面菌落圆心处深红色，向外呈淡红色，最外周白色，边缘整齐。显微镜下显示，菌丝纤细，分枝，有隔，无色透明；分生孢子梗无色，细长，不分枝，孢子单生，无色，多细胞，圆筒形，端部渐尖，有的微弯曲。结合C39菌的形态特征与《半知菌属图解》进行相对比较，初步分析C39菌属于丛梗孢目，丛梗孢科，镰孢属真菌。本发明内生真菌(Fusarium sp.)C39的分子生物学鉴定结果提取C39菌的基因组DNA，序列测定结果为SEQ ID No. 1所示；将测序结果与GeneBank中已知序列进行比较分析，从Genebank数据库中获得相关种属的ITS序列信息，应用CLUSTAL X 1. 83软件进行多序列比对，将计算结果导入PHYLIP软件，构建系统进化树(图7)。结合形态学鉴定结果，C39 菌的特征描述符合镰孢属真菌。但经比对，未发现目前GeneBank中存在与其基因序列和形态特征完全相同的已知菌种。初步确定C39菌为丛梗孢目，丛梗孢科镰孢属(Fusarium)真菌。C39菌多次传代后功能的稳定性验证将不同世代C39菌的种子液进行药材的固体发酵，经过七个世代的传递仍然保持固体发酵提高薯蓣类药材中薯蓣皂苷元含量的能力。本发明的另一个目的是将所分离得到的内生真菌(Fusarium sp. )C39应用于生物转化薯蓣皂苷元，包括(1)制备内生真菌(Fusarium sp.)C39的种子液；(2)将薯蓣类植物粉碎成粗粉，得到固体发酵培养基；(3)向固体发酵培养基中接入种子液，发酵培养，即得。其中，所述的薯蓣类植物包括穿龙薯蓣(Dioscorea nipponica)、盾叶薯蓣 (Dioscorea zingiberensis) 5 Jt ill M (Dioscorea panthaica) ^ -,^iXi^.^] WMMW. (Dioscorea nipponica)、盾叶薯截(Dioscorea zingiberensis)或黄山药(Dioscorea panthaica)它们各自的根茎或根。本发明通过大量的实验对上述发酵培养条件进行了优化和筛选，结果发现，采用以下条件能够有效的提高药材中薯蓣皂苷元的转化率本发明通过实验发现，将薯蓣类植物粉碎成粗粉所得到固体发酵基进行高温灭菌后再接入种子液进行发酵，能够显著提高发酵产物中薯蓣皂苷元的含量；其中，所述的发酵条件优选为发酵温度为25°C，发酵时间为8天。
图1薯蓣皂苷和薯蓣皂苷元的化学结构式。 图2 C39菌正面菌落形态特征。 图3 C39菌底面菌落形态特征。 图4 C39菌孢子形态特征。 图5 C39菌菌丝形态特征。
图6 C39菌扩增产物电泳图谱。M为Marker ；1. 2. 3. 4 :C39扩增产物平行样。 图7 C39菌的ITS序列系统进化树。 图8薯蓣皂苷元分光光度法含量测定的标准曲线。 图9薯蓣皂苷元标准品的紫外吸收光谱图。 图10薯蓣皂苷元HPLC法含量测定的标准曲线。 图11薯蓣皂苷元标准品的紫外吸收光谱图。 图12 C39菌固体发酵产物的紫外吸收光谱图。 图13 C39菌固体发酵产物、空白药材和薯蓣皂苷元标准品色谱图。
具体实施例方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1内生真菌C39的分离纯化及保存1.内生真菌的分离1. 1植物组织表面消毒处理在采集的样本中，挑选没有虫斑病斑的穿龙薯蓣叶片。样本先用自来水冲洗，洗去表面的泥土和灰尘，自然晾干。按以下方法进行表面消毒75%乙醇漂洗1-5分钟一3. 5%次氯酸钠水溶液浸泡3_7分钟一无菌水冲洗3次， 每次1分钟。根据叶片的薄厚对表面消毒的时间进行筛选，对每种植物样本，选出最佳的表面消毒时间。在次氯酸钠溶液中浸泡的时间分别设为:3. Omin, 4. Omin, 5. Omin, 6. Omin, 7. Omin。尽可能多地分离出植物的内生真菌，并且进行彻底的表面消毒。1.2内生真菌的分离内生真菌的分离采用组织块分离的方法。在无菌条件下，将消毒过的叶片剪去四周边缘，将中央部分剪成0. 5cm3方块，然后将叶片接种于PDA培养基平板上，每个平皿内接种6块组织块，同时做3个平行。接种好的平皿置于25°C恒温培养箱中培养3-7天，每天观察记录。为检查材料表面消毒是否彻底做以下对照实验(1)无菌水对照法将上述组织消毒的最后一次无菌水0. ImL涂于培养基表面，置于相同条件下培养，观察记录是否有真菌生长。(2)组织块对照法植物样本经过2. 1. 1项下的表面消毒后，将整片叶片不剪切，直接放在PDA培养基上，相同条件下培养，观察记录。(3)空白培养基对照将未种植植物组织片的空白培养基，置于25°C恒温培养箱中培养3-7天，每天观察记录。1.3内生真菌的纯化待样品切割边缘长出新菌丝，及时转入新配制的PDA固体培养基上培养，待菌落出现后，根据长出菌落的形态、大小、颜色的不同，分别挑取各菌落边缘的菌丝，接于新的平板上进行培养，继续观察。采用三点法逐步纯化，培养数日后，观察菌落的形态及颜色是否均勻，边缘是否整齐，确定是否纯化。1.4内生真菌菌种保存将多次纯化的菌种，移至试管PDA斜面培养基上，25°C下培养5天，待观察没有污染后，加入无菌液体石蜡，液面高于培养基Icm左右，对菌株编号后，放于室温及4°C的冰箱中保存。从穿龙薯蓣新鲜植物中，共分离出内生真菌52株。
1. 5对照实验穿龙薯蓣内生真菌最佳分离条件下的对照试验结果如下(1)当无菌水的培养基表面无菌落长出，表明穿龙薯蓣组织表面消毒彻底，在实验培养基中自组织边缘分离出的真菌是植物的内生真菌而不是空气中或组织块表面附生的微生物。(2)经过7天观察，未做分割叶片组织周围无菌长出，叶片枯萎。(3)经过7天观察，未种植组织片的空白培养基表面微干，水分蒸发所致，但无菌生长，表明培养基配置及消毒合格，可用于内生真菌的培养。实施例2穿龙薯蓣内生真菌C39的鉴定1、C39菌的形态学鉴定主要根据分离得到的内生真菌菌落特征，观察个体形态特征及其他一些生物学特征进行经典分类鉴定。1. 1载片培养取直径7cm左右圆形滤纸一张，铺放于一个直径9cm的平皿底部，上放一 U形玻棒，其上再平放一张干净的载玻片与一张盖玻片，盖好平皿盖进行灭菌。挑取真菌孢子接入盛有灭菌水的试管中，摇振试管制成孢子悬液备用。用灭菌滴管吸取灭菌后融化的真菌固体培养基少许，滴于上述灭菌平皿内的载玻片中央，并以接种环将孢子悬液接种在培养基四周，加上盖玻片，并轻轻压贴一下。为防止培养过程中培养基干燥，可在滤纸上滴加灭菌后的20%甘油液3 細1，然后盖上平皿盖，即成所谓湿室载片培养。放在25°C的培养箱内培养，定期取出在低倍镜下观察。1. 2挑片观察在载玻片上加一滴乳酸苯酚液棉兰染色液，用接种针从生长有真菌的平板中挑取带有孢子的真菌菌丝，放入载玻片上的液滴中，并且用针尖将其分散开，盖好盖玻片即得载片标本。1. 3插片培养插片法将内生真菌接种在琼脂平板上，将灭菌的盖玻片45度角插于固体培养基中，使内生真菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻片上。观察时，轻轻取出盖玻片，置于载玻片上直接镜检。乳酚棉蓝染色插片用苯胺蓝染色15min后，加入几滴乳酚油为浮载剂，在显微镜下观察。乳酸苯酚液加苯胺蓝(棉蓝)是真菌标准的浮载剂。(碱性染料苯胺蓝可使真菌的原生质着色，而不染色细胞壁。)2、C39菌的分子生物学鉴定2. 1 C39菌基因组DNA的提取(1)取C39菌斜面培养的菌种，接种于200mLPD液体培养基中，25°C，130r/min振荡培养3d。2层无菌纱布过滤出菌丝，用无菌水洗2次，再用灭菌生理盐水洗2次，无菌滤纸吸去菌体表面水分，获得菌丝体。(2)将收集的菌丝加液氮研磨，置于含有700μ 1 DNA提取缓冲液[200mM Tris-HCl (PH = 8. 0), 25mM EDTA(PH = 8. 0), 250mM NaCl，0· 5% SDS (PH = 7. 5)]的 1. 5ml 离心管中，用微量移液枪混勻，37 °C水浴30min。
(3) 12000r/min离心5min，将上清液移入新的离心管中。(4)加入等体积苯酚-氯仿(1 1)溶液，混勻5min, 12000r/min离心5min,将上清液移入新的离心管。(5)加入等体积氯仿，混勻，12000r/min离心2min，将上层溶液移入新的离心管中。(6)加入2倍体积冰乙醇，-20 V放置2小时。(7)取放置后的DNA提取液，12000r/min离心5min，去上清液，加入70%乙醇，清洗沉淀2次，12000r/min离心2min。(8)去上清液，挥干溶剂，加入75 μ 1 IXTE溶解沉淀即为DNA模板。(9) DNA模板置于_20°C保存备用。2. 2 C39菌基因组DNA的检测取少量DNA模板，采用分光光度法测定A26Q/A28Q比值，检测DNA模板纯度，并计算 DNA浓度。采用IX TAE作为电泳缓冲液，0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测真菌基因组DNA模板。加样量为6 μ 1，电场强度为5V/cm，电泳时间1. 5小时。紫外分析仪下检测真菌基因组DNA提
取结果。2. 3 C39菌基因组DNA的PCR扩增反应在超净工作台内配制PCR扩增试剂扩增的反应体系见表1。表 权利要求
1.一株从穿龙薯蓣(Dioscorea nipponica)中分离到的内生真菌(Fusarium sp.) C39，其特征在于，其微生物保藏号CGMCC NO. 4616。
2.权利要求1所述的内生真菌(Fusariumsp.)C39在制备薯蓣皂苷元中的用途。
3.按照权利要求2所述的用途，其特征在于，包括(1)制备权利要求1所述内生真菌 (Fusarium sp.)C 39的种子液；(2)将薯蓣类植物粉碎成粗粉，得到固体发酵基；(3)向固体发酵基中接入内生真菌(Fusarium sp.)C39的种子液，发酵培养，即得。
4.按照权利要求3所述的用途，其特征在于所述的薯蓣类植物包括穿龙薯蓣 (Dioscorea nipponica)、盾叶薯蔬(Dioscorea zingiberensis)或黄山药(Dioscorea panthaica)0
5.按照权利要求4所述的用途，其特征在于所述的穿龙薯蓣(Dioscorea nipponica)、)§"卩十—(Dioscorea zingiberensis) $胃山胃(Dioscorea panthaica) ^ 它们各自的根茎或根。
6.按照权利要求3所述的用途，其特征在于将所述固体发酵基进行高温灭菌后再接入种子液进行发酵培养。
7.按照权利要求3所述的用途，其特征在于所述的发酵培养条件为发酵温度为 25°C，发酵时间为8天。
全文摘要
本发明公开了一株穿龙薯蓣内生真菌及其应用。本发明从穿龙薯蓣叶片中分离得到一株内生真菌(Fusarium sp.)C39，其微生物保藏号是CGMCC NO.4616；结合基因组DNA测序和形态学鉴定结果，本发明所分离的C39菌为丛梗孢目，丛梗孢科镰孢属(Fusarium)真菌。将本发明内生真菌C39的种子液接入到由穿龙薯蓣等植物所制备得到的固体发酵培养基中进行发酵培养，可以有效地提高药材中薯蓣皂苷元的含量。稳定性验证实验表明，内生真菌(Fusarium sp.)C39的稳定性良好，不同世代的C39菌经多世代的传递仍然保持固体发酵提高穿山龙等薯蓣类植物药材中薯蓣皂苷元含量的能力。
文档编号C12N1/14GK102154123SQ201110063388
公开日2011年8月17日 申请日期2011年3月16日 优先权日2011年3月16日
发明者孟凡佳, 牟晋超, 都晓伟 申请人:都晓伟