专利名称：一种交叉保护疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及疫苗学领域，具体的说是一种针对迟缓爱德华氏菌和哈氏弧菌的交叉保护疫苗。
背景技术：
迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)和哈氏弧菌(Vibrio harveyi)为革兰氏阴性菌，广泛分布于各种水环境。这两种菌是重要的水产养殖病原菌，能够感染多种海水和淡水鱼类。在我国，迟缓爱德华氏菌和哈氏弧菌感染是造成多种养殖鱼类经济损失的主要原因之一。除了鱼类外，迟缓爱德华氏菌还可感染人类，而哈氏弧菌则是养殖虾类的重要病原，能够引起高死亡率的发光性弧菌病。目前，针对迟缓爱德华氏菌和哈氏弧菌尚无商业化的疫苗。尽管一些在实验室条件下有效的疫苗已被报道，但这些疫苗主要是单一性疫苗，即只对一种病原菌(迟缓爱德华氏菌或哈氏弧菌)起作用。能够同时针对迟缓爱德华氏菌和哈氏弧菌的疫苗，即交叉保护疫苗，尚未见报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种交叉保护疫苗。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种交叉保护疫苗，其特征在于交叉保护疫苗为质粒PAQl重组转化入迟缓爱德华氏菌ATCC15947的重组菌株。所述交叉保护疫苗为迟缓爱德华氏菌和哈氏弧菌的交叉免疫保护疫苗。将所述质粒pAQl重组转化入迟缓爱德华氏菌ATCC15947得重组菌株经LB培养基培养至0D_为 0. 8-1后溶于PBS，作为交叉保护疫苗。本发明具有如下优点1.制备简单。本发明的疫苗只需简单的常规细菌培养，无需任何提取、纯化过程。2.高效交叉保护效应。本发明疫苗能够同时保护鱼类抵抗迟缓爱德华氏菌和哈氏弧菌感染的能力，且保护效应达90%以上。。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。实施例1疫苗的构建将质粒pAQl(其构建过程参见 Zhang W, Sun K, Cheng S, Sun L. Characterization of DegQvh, a serine protease and a protective immunogen from a pathogenic Vibrio harveyi strain. Appl Environ Microbiol 2008 ;74 :625462.)按照 Hanahan 方夕去(Sambrook and Russell :Molecular Cloning :A Laboratory Mannual. Cold SpringHarbor Laboratory Press 2001)转化入迟缓爱德华氏菌ATCC15947 (购于美国ATCC公司)，得菌株Etl5VhD，即为对迟缓爱德华氏菌和哈氏弧菌有交叉保护作用的疫苗菌株。实施例2疫苗的应用步骤1)疫苗制备液的制备。将上述所得疫苗菌株Etl5VhD在LB液体培养基中培养至OD6tltl为0. 8-1，而后将培养液离心(5000g，4°C，IOmin)，收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为2xl08cfU/ml，即为疫苗制备液。所述LB组成成分按重量百分比计1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化钠， 97. 5%蒸馏水；所述PBS组成成分按重量百分比计0. 8% NaCl,0. 02% KCl,0. 358 % Na2HPO4. 12Η20，0· 024% NaH2PO4,98. 798%蒸溜水。步骤2)疫苗的接种。将120条牙鲆(每条重约12g)随机分为4组，每组30条。 将这4组分别命名为A、B、C和D。将A和C组的每条鱼分别腹腔注射IOOul上述步骤1) 的疫苗制备液，将B和D组(对照组)的每条鱼分别腹腔注射IOOul PBS。步骤3)迟缓爱德华氏菌和哈氏弧菌悬液的制备。在LB培养基中分别培养迟缓爱德华氏菌TXl和哈氏弧菌T4至0D_为0.9，然后离心(5000g，4°C，10min)，收集菌体。将迟缓爱德华氏菌菌体悬浮于PBS中至终浓度为lxl07cfU/ml，即为迟缓爱德华氏菌悬液；将哈氏弧菌菌体悬浮于PBS中至终浓度为6xl07cfu/ml，即为哈氏弧菌悬液。所述菌株TXl保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为=CGMCC No. 2330 ；所述菌株T4保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC No. 1985。步骤4)疫苗的免疫保护效应检测。在步骤2)免疫注射后的第30天，用上述步骤 3)的迟缓爱德华氏菌悬液腹腔注射步骤2)的A和B组鱼，用上述步骤3)的哈氏弧菌悬液腹腔注射步骤2)的C和D组鱼，每条鱼的注射量为lOOul。在以后的20天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼的总死亡数目A组，3条；B组，29条；C组，2 条；D组，26条。利用下列公式计算相对免疫保护效率(RPS)RPS = 100x(l-免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比)故Et 15VhD 针对迟缓爱德华氏菌和哈氏弧菌的免疫保护效率分别为90%和92%。由此得出Etl5VhD对迟缓爱德华氏菌和哈氏弧菌具有高效的交叉免疫保护效应。
权利要求
1.一种交叉保护疫苗，其特征在于交叉保护疫苗为质粒PAQl重组转化入迟缓爱德华氏菌ATCC15947的重组菌株。
2.按权利要求1所述的交叉保护疫苗，其特征在于所述交叉保护疫苗为迟缓爱德华氏菌和哈氏弧菌的交叉免疫保护疫苗。
3.按权利要求1所述的交叉保护疫苗，其特征在于将所述质粒PAQl重组转化入迟缓爱德华氏菌ATCC15947得重组菌株经LB培养基培养至0D_为0. 8-1后溶于PBS，作为交叉保护疫苗。
全文摘要
本发明涉及疫苗学领域，具体的说是一种针对迟缓爱德华氏菌和哈氏弧菌的交叉保护疫苗。交叉保护疫苗为质粒pAQ1重组转化入迟缓爱德华氏菌ATCC15947的重组菌株。所述交叉保护疫苗为迟缓爱德华氏菌和哈氏弧菌的交叉免疫保护疫苗。本发明所得疫苗对迟缓爱德华氏菌和哈氏弧菌感染皆有90％以上的保护效应。
文档编号C12N1/21GK102178943SQ20111009318
公开日2011年9月14日 申请日期2011年4月2日 优先权日2011年4月2日
发明者孙黎, 胡永华 申请人:中国科学院海洋研究所