专利名称：CSFV、PRRSV与PCV2多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR引物及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种病毒的检测方法，具体涉及PCV2、PRV与SIV H9亚型多重STORGreen I实时荧光PCR引物及其检测方法。
背景技术：
猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)都能够不同程度的导致妊娠引起种猪不育，即公猪睾丸肿胀，精液质量下降，失去种用能力；母猪表现为不发情，返情，不孕；妊娠母猪发生流产、早产、死胎、木乃伊、弱仔及新生仔猪发病且导致大量死亡等，给养猪业造成了巨大的经济损失。对这类传染病的有效控制是保证养猪业健康发展的关键因素之一。这几种病毒经常混合感染，靠分离病毒和抗体检测来确诊容易造成假阴性，而且操作繁琐，对仪器的操作要求较高，所需时间长，亟需一种操作简单、快速的检测、准确率高的鉴别诊断方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是CSFV、PRRSV与PCV2这几种病毒常常以混合感染的形式出现，靠分离病毒和抗体检测来确诊容易造成假阴性，而且操作繁琐，提供一种CSFV、PRRSV与PCV2多重STOR Green I实时荧光PCR引物及其检测方法。本发明的技术方案是CSFV、PRRSV与PCV2多重STOR Green I实时荧光PCR引物CSFV引物的序列如下上游引物P1 5 ‘ -AAACGGAGGGACTAGCCGT-3 ‘；下游引物P2 5 ‘ -TGCCATGTACAGCAGAGA-3 ‘；PRRSV引物的序列如下上游引物P3 5 ‘ -AAACCAGTCCAGAGGCAAG-3 ‘；下游引物P4:5' -CCACAGTGTAACTTATCCTC-3‘；PCV2引物的序列如下上游引物P5 5 ‘ -GGGCCAGAATTCAACCTTACCC-3 ‘；下游引物P6:5' -CGCACCTTCGGATATACTGTCA-3 ‘；所述引物检测CSFV、PRRSV与PCV2多重STOR Green I实时荧光PCR检测方法，包括提取病毒的DNA后，按如下STOR Green I实时荧光PCR反应体系和反应条件对病毒进行检测所述STOR Green I实时荧光PCR反应体系，在25 μ 1体系中加入以下成份
权利要求
1.CSFV, PRRSV与PCV2多重STOR Green I实时荧光PCR引物，其特征在于 CSFV引物的序列如下上游引物 P1 5 ‘ -AAACGGAGGGACTAGCCGT-3 ‘； 下游引物 P2 5 ‘ -TGCCATGTACAGCAGAGA-3 ‘； PRRSV引物的序列如下 上游引物 P3 5 ‘ -AAACCAGTCCAGAGGCAAG-3 ‘； 下游引物 P4 5 ‘ -CCACAGTGTAACTTATCCTC-3 ‘； PCV2引物的序列如下上游引物 P5 5 ‘ -GGGCCAGAATTCAACCTTACCC-3 ‘； 下游引物 P6 5 ‘ -CGCACCTTCGGATATACTGTCA-3 ‘。
2.利用权利要求1所述引物检测CSFV、PRRSV与PCV2多重STORGreen I实时荧光 PCR检测方法，包括提取病毒的DNA后，按如下STOR Green I实时荧光PCR反应体系和反应条件对病毒进行检测，其特征在于所述STOR Green I实时荧光PCR反应体系，在25 μ 1体系中加入以下成份 SYBR Premix Ex Taq II14.5 μLP1/P3/P50.5+0.5+0.5pLP2/P4/P60.5+0.5+0.5pLDNA1+1+1 μ ,ddH204.5pL25 pL所述反应条件为95°C预变性Imin ；进入循环，95 °C变性10s，56 °C退火15s，72°C延伸15s，40个循环，循环结束后先加热至95°C，然后再降至65°C，开始以0. 5°C /sec递增至 94°C检测荧光信号，进而得出扩增产物的熔解曲线。
全文摘要
本发明公开了一种CSFV、PRRSV与PCV2多重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR引物及其检测方法，CSFV引物的序列如下上游引物P15′-AAACGGAGGGACTAGCCGT-3′；下游引物P25′-TGCCATGTACAGCAGAGA-3′；PRRSV引物的序列如下上游引物P35′-AAACCAGTCCAGAGGCAAG-3′；下游引物P45′-CCACAGTGTAACTTATCCTC-3′；PCV2引物的序列如下上游引物P55′-GGGCCAGAATTCAACCTTACCC-3′；下游引物P65′-CGCACCTTCGGATATACTGTCA-3′；本发明分别设计扩增CSFV、PRRSV和PCV2的特异性引物，通过三重SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测方法能够同时检测CSFV、PRRSV和PCV2。CSFV、PRRSV和PCV2同时检出的极限拷贝数分别为177拷贝/μL，202拷贝/μL，181拷贝/μL。本发明的特异性试验结果良好，只出现三个特异性的峰值，重复性试验具有很好的稳定性并且本试验的最大优势在于能够同时检测CSFV、PRRSV和PCV2三种DNA病毒，有利于妊娠母猪繁殖障碍性病毒的鉴别。
文档编号C12N15/11GK102373297SQ20111022171
公开日2012年3月14日 申请日期2011年8月4日 优先权日2011年8月4日
发明者刘芳, 孟振北, 崔保安, 王亚宾, 韩志涛, 魏战勇 申请人:河南农业大学