专利名称：TaqMan-COLD-PCR方法检测外周血中JAK2V617F突变率的制作方法
技术领域：
本发明专利涉及一种新型JAK2V617F突变率的检测方法，具体是采用TaqMan/MGB 探针技术，结合COLD-PCR基因扩增原理，通过Real-Time PCR分析系统定量测定外周血基因组DNA中JAK2V617F突变率的方法。
背景技术：
2005年多个研究组同时发现JAK2 (Janus Kinase2)基因第1849 (G> Τ)位点突变与骨髓增殖性疾病(MPDs)有关，该突变可明显导致真性红细胞增多症(PV)、特发性血小板增多症(ET)和骨髓纤维化(IMF)的发生和发展。JAK2属于Janus激酶家族，基因定位于9 号染色体短臂2区4带(9p23-24)。JAK2基因突变位于JAK2基因第1849位，由原来的鸟嘌呤(G)被胸腺嘧啶(T)所取代，使得JAK2的JH2结构域的617位的缬氨酸(V)错义编码为苯丙氨酸(F)。JAK2突变(JAK2 V617F)为获得性体细胞突变，起源于造血干细胞并可在其子代细胞中克隆性传递。JAK2 V617F突变发生空间构象改变，导致激酶活性增强，使得突变的造血干细胞对血细胞生长因子如血小板生成素(IPO)、红细胞生成素(EPO)、胰岛素样生长因子(IGFl)、干细胞生长因子(SCF)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)超敏感，导致三系骨髓细胞增殖。研究显示，JAK2 V617F突变在PV患者中接近100%，ET和IMF患者接近50%，小于10%的ET和IMF患者以及1/3的PV患者中可表现为纯合型突变。由于JAK2 V617F是获得性造血干细胞突变，造血干细胞的混合性克隆生长或杂合性突变，导致骨髓和外周血中含有野生型和突变型JAK2基因组DNA。Xu X等报道在37例非MDI3S诊断的JAK2 V617F 患者中，有25例JAK2 V617F突变率小于5%，因此，对于JAK2 V617F检测方法的敏感性，特别是少量突变克隆株的检测，显得尤为重要。2006年对超过700人的健康对照和继发性骨髓增殖疾病的研究中未发现JAK2 V617F突变，显示JAK2V617F突变对于MPDs具有100%的特异性。然而，2007年文献研究报道显示，在3935例缺乏MDI3S诊断的患者中有37例(1% ) JAK2 V617F突变，涉及的疾病包括肾功能衰竭、胃癌、血栓、冠心病、糖尿病、动脉粥样便化和脑血管病等；近期文献报道， 具有JAK2 V617F突变的腹腔血栓(包括肝、门静脉、肠系膜静脉血栓)患者为16-27%，脑血拴患者为20.0%，其中17-37%腹腔血栓患者和4. 8%脑血栓患者缺乏MDI3S的诊断，而 RemachaAF等报道在血栓患者中JAK2V617F突变阳性率非常少见(1/295例)。Colaizzo D 等对99例门脉和肠系膜静脉血栓患者的JAK2V617F研究显示，其中17例(17. 2% )具有 JAK2V617F杂合突变，经平均41个月的随访后，10例携带JAK2V617F突变患者中的3例被诊断为具有自发性骨髓纤维化(n = 2)和真性红细胞增多症(n = 1)。以上研究提示JAK2 V617F作为MDI^s的诊断是否具有100%的阴性预测值，JAK2V61F突变率为多少可以表现为 MPDs的临床症状，是否在其它血栓性疾病如急性冠脉综合症，脑血管病以及出血性疾病的患者中单独存在，其临床应用价值有待于进一步研究。
2008年世界卫生组织(WHO)以将JAK2V617F突变纳入到上述疾病的诊断标准中。 由于JAK2 V617F是获得性造血干细胞突变，造血干细胞的混合性克隆生长，导致骨髓和外周血中JAK2V617F呈不同程度的突变率。有研究等报道在37例非MDI3S诊断的JAK2 V617F 患者中，有25例JAK2 V617F突变率小于5%。因此，对于JAK2 V617F检测方法的敏感性， 特别是少量突变克隆株的检测，对疾病的诊断和治疗监测显得尤为重要。文献报道，DNA直接测序方法检测突变率的下限为20%左右；等位基因特异PCR方法敏感性为1-3% ；荧光定量PCR-ARMS原理和溶解曲线方法的敏感性为和-10%, 限制性片段长度多态性(RFLP)的敏感性为20%左右。目前未见JAK2V617F突变率检测下限达到0.1%的文献报道。
发明内容
本发明专利需要解决的技术问题是，克服背景技术的不足，提供一种高敏感性的在外周血基因组DNA中检测JAK2V617F的突变率的方法。本发明专利主要采用了 TaqMan/ MGB探针技术，结合COLD-PCR基因扩增原理，通过Real-Time PCR分析系统定量测定外周血基因组DNA中JAK2V617F突变率的方法(TaqMan-COLD-PCR方法)。
具体实施例方式1.设计探针及引物。2.构建野生、突变质粒标准品。3.确定TaqMan-COLD-PCR最佳变性温度。4. PCR反应体系中各种试剂的浓度配制。5.基因组DNA浓度定量，野生及突变标准品的配制。6.建立TaqMan-COLD-PCR检测突变率的标准曲线，确定检测线性范围。7.患者外周血中JAK2V617F突变率检测，评价突变率检测下限和变异率。
权利要求
1.本发明是一种高敏感性的在外周血基因组DNA中检测JAK2V617F突变率的方法， 以TaqMan/MGB探针技术结合荧光定量cold-PCR技术的双探针单反应体系的新检测方法， 包括JAK2V617F野生型、突变型质粒标准品的构建、校准，PCR测定体系中引物和探针的设计，PCR扩增变性温度的选择，突变率标准曲线的建立，其特征在于可对JAK2V617F突变百分率进行定量检测，突变率检测下限0. 1 %，标本易留取，具有操作简单、重复性好、高通量检测标本、检测报告时间短等特点。
2.根据权利要求1所述本发明是检测JAK2V617F突变率的新方法，其特征在于引物及探针的自主设计，并以TaqMan/MGB作为突变碱基的检测信号。
3.根据权利要求2所述，其特征在于该方法中变性温度的设定，引物和探针的合理设计，PCR反应体系中各种试剂的浓度配比。
4.根据权利要求1所述的方法，对JAK2V617F突变百分率进行定量检测，突变率检测下限0. 1%，其特征在于结合荧光定量cold-PCR的技术原理提高突变率的检测下线。
5.根据权利要求1所述的方法，具有简便、易操作的特点，其特征在于采用外周血基因组DNA进行检测，标本易留取，且在一个反应体系内完成检测。
全文摘要
TaqMan-COLD-PCR方法检测外周血中JAK2V617F突变率以外周血基因组DNA作为检测标本，在一个反应体系内完成检测，对JAK2V617F突变百分率进行定量检测，检测下限为0.1％，具有操作简单、重复性好、高通量检测标本、报告时间短等特点，尤其适用于少量突变克隆株的检测。本发明解决的技术问题是，克服背景技术的不足，提供一种高敏感性的外周血基因组DNA中检测JAK2V617F的突变率的方法。由于JAK2V617F突变作为骨髓增殖性疾病唯一分子诊断标志物，已纳入骨髓增殖性疾病诊断标准中，该发明将明显提高上述疾病的诊断率。同时也可用于上述疾病治疗过程中疗效监测。
文档编号C12Q1/68GK102321741SQ20111022164
公开日2012年1月18日 申请日期2011年8月4日 优先权日2011年8月4日
发明者梁国威 申请人:航天中心医院