专利名称：用于制定菌落总数定量曲线的标准样本的制备方法，该定量曲线的制作方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于制定定量曲线的标准样本的制备方法，该定量曲线的制作方法及其应用，特别适用于液体样本中菌落总数的定量检测。
背景技术：
常规的菌落总数计数方法主要包括菌落总数Petrifilm 测试片法、国标GB4789. 2-2010《中华人民共和国国家标准-食品安全国家标准_食品微生物学检验_菌落总数测定》中提到的平板计数法。这些检测方法耗时较长，工作量大，不利于菌落总数的快速检测。目前，开发出许多利用微生物生长过程中酸碱度变化快速检测菌落总数的检测方法。如实时光电微生物快速检测系统，通过向培养中的样本加入酸碱指示剂、并利用比色法监测其pH值的变化，当pH值达到某一阈值时记录检出时间，由检出时间对照定量曲线判断样品中菌落总数。实时光电微生物快速检测系统易操作且耗时较短，仅需6-10小时就可得出检测结果，其中，定量曲线的制作是准确定量的关键所在。定量曲线制作过程中用到标准样本，用目前的方法制备的标准样本都存在样本背景不一致的问题，影响定量曲线的准确性，在最终用于菌落总数的测定时造成不必要的误差。
发明内容
本发明的目的是提供用于制定菌落总数定量曲线的标准样本的制备方法，使得制备得到的标准样本之间的背景值一致。本发明的又一目的是提供制作菌落总数定量曲线的方法，其中标准样本的制备方法使得制备得到的标准样本的背景值一致，可提高菌落总数定量曲线的准确性。本发明的另一个目的是提供菌落总数定量曲线在检测液体样本中菌落总数中的应用，提高液体样本中菌落总数检测的准确性。本发明提供了用于制定菌落总数定量曲线的标准样本的制备方法，包括以下步骤取不含菌的样本，调节pH至6. 7±0. 2，制成无菌样本；向每毫升无菌样本中加入彡IO4CFU且彡IO9CFU的活化的标准菌株，并调节pH至6. 7±0. 2，获得富菌样本；将富菌样本用无菌样本进行十倍递减稀释，待稀释后的富菌样本的理论菌浓度值< 200CFU/毫升时，停止稀释，制成富菌样本的十倍递减系列稀释液，即为标准样本。本发明还提供了菌落总数定量曲线的制作方法，包括以下步骤根据上述的标准样本的制备方法制备标准样本，标准样本的样本总数> 50个；分别将标准样本按相同的每毫升培养基接种量接种到基础培养基中进行培养，并监测接种了标准样本的基础培养基的PH值的变化，待pH值达到设定阈值时，记录标准样本的检出时间；分别利用菌落总数平板计数法对标准样本中的菌落总数进行计数，得出每毫升标准样本中菌落总数；根据标准样本的检出时间和每毫升标准样本中菌落总数的常用对数值绘制菌落总数定量曲线。
本发明又提供了如上所述的菌落总数定量曲线在检测液体样本中菌落总数中的应用，包括以下步骤取与无菌样本为同种产品的液体样本，调节PH至6. 7±0. 2，制成液体样本的待检测液；将待检测液按上述每毫升培养基接种量接种到基础培养基中进行培养，并监测接种了待检测液的基础培养基的PH值的变化，待pH值达到上述设定阈值时，记录待检测液的检出时间；用待检测液的检出时间对照菌落总数定量曲线，得出每毫升待检测液中菌落总数的常用对数值，并计算每毫升液体样本中的菌落总数。在菌落总数定量曲线在检测液体样本中菌落总数中的应用的一种示意性实施方式中，接种时的每毫升培养基接种量为O. 2毫升。在菌落总数定量曲线在检测液体样本中菌落总数中的应用的一种示意性实施方式中，培养的温度为35°c。在菌落总数定量曲线在检测液体样本中菌落总数中的应用的一种示意性实施方式中，通过比色法监测pH值的变化。 在菌落总数定量曲线在检测液体样本中菌落总数中的应用的一种示意性实施方式中，pH值的设定阈值为5.8。本发明的标准样本制备方法中，通过制备具有相同背景的无菌样本和富菌样本，并将富菌样本用无菌样本进行稀释，制成富菌样本的十倍递减系列稀释液，制成标准样本，使得标准样本的背景值一致。本发明的制作菌落总数定量曲线的方法中，利用前述标准样本制备方法制备的标准样本，使得制作的菌落总数定量曲线能更准确地反映检出时间与实际菌落量之间的线性关系，提高了菌落总数定量检测时的准确性。本发明的菌落总数定量曲线在检测液体样本中菌落总数中的应用，使用与液体样本为同种产品的无菌样本、通过特定的方法制定菌落总数定量曲线，用于液体样本中菌落总数的检测，使得检测结果更为准确。
以下附图仅对本发明做示意性说明和解释，并不限定本发明的范围。图I是本发明实施例3生成的用于检测冰淇淋中菌落总数的菌落总数定量曲线。图2是本发明实施例4生成的用于检测液体奶中菌落总数的菌落总数定量曲线。
具体实施例方式为了对发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现对照
本发明的具体实施方式
。实施例I :一种标准样本的制备方法。I、溶液试剂。活化的标准菌株取弗氏柠檬酸杆菌(ATCC43864)，接种于灭菌的营养肉汤中，于36. 5°C恒温振荡培养箱中培养18-24小时，计数后备用。2、操作步骤。I)取不含菌的融化冰淇淋，调节pH至6. 7±0. 2，制成无菌样本。为了检测的方便，可根据样本的浓稠度，用灭菌的生理盐水对不含菌的融化冰淇淋进行一定比例的稀释，再调节pH至6. 7 ± O. 2，制成无菌样本。2)取9份无菌样本分别加入如下表所示一定量的标准菌株，并调节pH至6. 7 ±0.2，获得9份富菌样本。
权利要求
1.用于制定菌落总数定量曲线的标准样本的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 取不含菌的样本，调节pH至6. 7±0. 2，制成无菌样本； 向每毫升所述无菌样本中加入> IO4CFU且彡IO9CFU的活化的标准菌株，并调节pH至6. 7±0. 2，获得富菌样本；和 将所述富菌样本用所述无菌样本进行十倍递减稀释，待稀释后的所述富菌样本的理论菌浓度值< 200CFU/毫升时，停止所述稀释，制成所述富菌样本的十倍递减系列稀释液，即为标准样本。
2.菌落总数定量曲线的制作方法，其特征在于，包括以下步骤 根据权利要求I所述的标准样本制备方法制备所述标准样本，所述标准样本的样本总数彡50个； 分别将所述标准样本按相同的每毫升培养基接种量接种到基础培养基中进行培养，并监测接种了所述标准样本的所述基础培养基的PH值的变化，待所述pH值达到设定阈值时，记录所述标准样本的检出时间； 分别利用菌落总数平板计数法对所述标准样本中的菌落总数进行计数，得出每毫升所述标准样本中菌落总数；和 根据所述标准样本的所述检出时间和所述每毫升所述标准样本中菌落总数的常用对数值绘制菌落总数定量曲线。
3.如权利要求2所述的菌落总数定量曲线在检测液体样本中菌落总数中的应用，包括以下步骤 取与所述无菌样本为同种产品的液体样本，调节PH至6. 7±0. 2，制成所述液体样本的待检测液； 将所述待检测液按所述每毫升培养基接种量接种到所述基础培养基中进行培养，并监测接种了所述待检测液的所述基础培养基的PH值的变化，待pH值达到所述设定阈值时，记录所述待检测液的检出时间； 用所述待检测液的所述检出时间对照所述菌落总数定量曲线，得出每毫升所述待检测液中菌落总数的常用对数值，并计算每毫升所述液体样本中的菌落总数。
4.如权利要求3所述菌落总数定量曲线在检测液体样本中菌落总数中的应用，其中，所述接种时的所述每晕升培养基接种量为O. 2晕升。
5.如权利要求3所述菌落总数定量曲线在检测液体样本中菌落总数中的应用，其中，所述培养的温度为35°C。
6.如权利要求3所述菌落总数定量曲线在检测液体样本中菌落总数中的应用，其中，通过比色法监测所述pH值的变化。
7.如权利要求3所述菌落总数定量曲线在检测液体样本中菌落总数中的应用，其中，所述PH值的所述设定阈值为5. 8。
全文摘要
本发明涉及用于制定菌落总数定量曲线的标准样本的制备方法，该定量曲线的制作方法及其应用。首先取与待测的液体样本为同种产品的不含菌的样本，并调节pH值，制成无菌样本；再向无菌样本中加入标准菌株，并调节pH值，制得富菌样本，用无菌样本将富菌样本进行十倍递减稀释，制得标准样本。将标准样本进行培养，检测其pH值达到某一阈值时的检出时间。同时用平板法检测标准样本中的菌落总数。根据检出时间和平板法检测结果绘制菌落总数定量曲线。取液体样本并调节pH值，制成待检测液，并用上述方法得到检出时间，再对照菌落总数定量曲线得到液体样本的菌落总数。由于本方法平衡了样本之间的背景值，因此提高了检测的准确性。
文档编号C12R1/07GK102952843SQ20111024363
公开日2013年3月6日 申请日期2011年8月24日 优先权日2011年8月24日
发明者薛志清, 喻东威, 李梅, 赵源, 刘晓川, 刘志楠, 杜丽, 李海礁, 刘卫星 申请人:内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司