专利名称：汉赛巴尔通体的pcr鉴定方法
技术领域：
本发明涉及生物检测技术，具体地说涉及汉赛巴尔通体的PCR鉴定方法。
背景技术：
汉赛巴尔通体(Bartonellahenselae)是引起猫抓病(Cat-Scratch Disease, CSD)的主要病原菌。此病常见(主要临床表现是淋巴结炎)于儿童，发病平均年龄为14 岁，高发年龄在10岁以内。多数患者表现为被猫抓(或咬)伤后，在伤口处出现红斑丘疹或脓疱。局部淋巴结红肿、发热，可触动、较硬，30%自发性化脓，以头面部、上肢和腹股沟淋巴结居多。病人还可伴有全身不适、发热、咳嗽等症状。汉赛巴尔通体还会引起人心内膜炎、 帕里诺眼-腺综合征(Parinaud，s oculoglandular syndrome, POGS)、脑炎、脊髓炎、周围神经病、单侧或双侧视网膜炎、肝脾肉芽肿、骨髓炎和胸膜炎等疾病。猫、狗是此菌的主要宿主，可以通过抓、咬等密切接触将汉赛巴尔通体传播给人类。汉赛巴尔通体的检测鉴定方法有核酸分析、探针杂交、荧光定量PCR和特异性抗体检测鉴定。目前，主要依靠PCR方法扩增目标基因后测序进行核酸序列分析。探针杂交方法以往有些研究者应用，但是由于操作繁琐及方法的特异性低等问题，已较少有人应用。 特异性抗体检测鉴定的方法虽然有人报道应用，但是与其他细菌及巴尔通体交叉反应问题仍然存在。核酸序列分析方法虽然能够提供确切的鉴定结果区分巴尔通体的种别，但是此方法需要将目标基因的扩增产物测序、然后进行序列比对以及构建进化树，分析过程繁琐， 不仅仪器化程度要求较高，对操作人员的专业要求也较高，而且耗时、费用较高，仅能在专业实验室进行，不利于推广应用。在少数专业实验室应用的荧光定量PCR方法也存在上述同样的问题，而且检测的准确性仍需要大量的实验研究证实。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供汉赛巴尔通体的鉴定方法及其鉴定用引物。本发明首先提供一种汉赛巴尔通体的PCR鉴定方法，其根据汉赛巴尔通体外膜蛋白基因BH13010的序列高变区设计特异性引物，以待测样品DNA或细菌培养物为模板进行特异性扩增，若能扩增到特异性条带，即鉴定为汉赛巴尔通体。本发明通过RAPD-PCR的方法，从汉赛巴尔通体的基因组中筛选出dnaG (引发酶基因)、BHl 1550(膜整合蛋白基因)、ppdK (丙酮酸磷酸双激酶基因)、BH13010 (外膜蛋白基因)、nrdl (核糖核苷酸还原酶基因)、rpsK (核糖体蛋白基因)、IpxD (酰基转移酶基因)。 再对这些基因片段进行特异性筛选，发现BH13010特异性地仅存在汉赛巴尔通体和五日热巴尔通体基因组中，利用序列高变区可特异性的鉴定汉赛巴尔通体，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1 所示。根据上述结果，本领域技术人员应当理解，所述的序列高变区是指与五日热巴尔通体相比，汉赛巴尔通体序列特异性较强的区域。其中，引物序列为
Cpf GTGACAGCTTATGGCGGTTT,Cpr :CGTCCATTGACCAATTTCC。本发明还提供一种汉赛巴尔通体的多重PCR鉴定方法，以待测样品DNA或细菌培养物为模板，特异性地扩增汉赛巴尔通体的dnaG基因、膜整合蛋白基因BH11550、外膜蛋白基因BH13010和IxpD基因，扩增到目的条带即为汉赛巴尔通体，其中，外膜蛋白基因 BH13010的引物是根据汉赛巴尔通体外膜蛋白基因BH13010的序列高变区设计的。其中，扩增引物分别为BhAF:CACGCGCATCAAGATAACGAC(SEQ ID No. 4)，BhAR :TTCAATCCAATCGCCGACA(SEQ ID No. 5)；Cpf GTGACAGCTTATGGCGGTTT(SEQ ID No. 6)，Cpr :CGTCCATTGACCAATTTCC(SEQ ID No. 7)；禾口6fl =ACAGCAGTAGTATGCAAtAA(SEQ ID No. 8),6f2 :ACGTCCACACCACAGCG(SEQ ID No. 9)。用上述引物进行多重PCR的判断标准为是否扩增出三条特异性条带，其中片段大小分别为约1171bp、293bp和215bp。其中，PCR反应液中，引物BhAF、BhAR, Cpf和Cpr的浓度分别为0. 2 μ Μ，引物6Π 和6f2的浓度为0. 3 μ M。其中多重PCR反应条件为94°C变性30sJ4 58°C退火30s，72°C延伸lmin，扩增 25个循环。本发明还提供如前所述的汉赛巴尔通体PCR鉴定用引物或多重PCR鉴定用引物以及含有该引物的鉴定用试剂盒。本发明还提供汉赛巴尔通体PCR鉴定用引物或多重PCR鉴定用引物还可用于制备鉴定汉赛巴尔通体的试剂。本发明以dnaG、BH11550 (膜整合蛋白基因)、BH13010 (膜蛋白基因)、IpxD基因为扩增目标，设计针对汉赛巴尔通体菌株的PCR引物，进行多重PCR扩增。通过优化反应体系、扩增参数，能够准确、灵敏地检测单个菌落鉴定出汉赛巴尔通体。上述基因中dnaG、 BH11550(膜整合蛋白基因)和IpxD基因的核苷酸序列具有巴尔通体属特异性，即可以在属水平区别巴尔通体与其他菌；BH13010(膜蛋白基因)是汉赛巴尔通体和五日热巴尔通体特有基因，在序列高变区设计引物可以在种水平上区别五日热巴尔通体和其他巴尔通体；上述基因联合应用时增加鉴定方法的特异性，保证了汉赛巴尔通体鉴定的准确性。
图 1RAPD-PCR 电泳图。图2单个菌落为模板的多重PCR反应电泳图。F, QIAGEN Fast Cycling PCR Kit 反应体系；T，TaKaRa Ex Taq反应体系；S，赛百盛Taq DNA聚合酶反应体系；M，IOObp DNA ladder marker ；N，空白对照；h，试剂盒提取汉赛巴尔通体DNA模板；Ch，汉赛巴尔通体单个菌落模板；Cg，格拉汉姆巴尔通体单个菌落模板。图3PCR反应的特异性检测电泳图。M，IOObp DNA ladder marker ;N，空白对照； h，汉赛巴尔通体；q，五日热巴尔通体；C，克氏巴尔通体；k，克勒巴尔通体；vb，文森巴尔通体博格霍夫亚种；va，文森巴尔通体阿鲁潘亚种；e，伊丽莎白巴尔通体；g，格拉汉姆巴尔通体；t，特利波契巴尔通体；d，道志巴尔通体；b，杆菌样巴尔通体。图4其他革兰阳性、阴性菌及动物模板为模板的PCR反应的特异性检测电泳图。 M, IOObp DNA ladder marker ;1，12，空白对照；2，13，汉赛巴尔通体；3，莫氏立克次体；4， 恙虫病东方体；5，嗜吞噬细胞无形体；6，日本立克次体；7，普氏立克次体；8，金黄色葡萄球菌；9，结核分枝杆菌；10，鼠疫耶尔森菌(疫苗株)；11，钩端螺旋体；14，伯氏疏螺旋体；15， 鲍曼不动杆菌；16，根癌土壤杆菌；17，猪种布鲁菌；18，羊种布鲁菌；19，大肠杆菌；20，志贺菌；21，幽门螺杆菌；22，空肠弯曲菌；23，霍乱弧菌；24，伤寒杆菌；25，鼠伤寒沙门菌；26， 副流感嗜血杆菌；27，军团菌；28，脑膜炎奈瑟菌C群；29，脑膜炎奈瑟菌A群；30，肺炎链球菌；31，肺炎克雷伯菌；32，人 DNA ；33 JgDNA ；34，犬 DNA ；35，鼠 DNA。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中所涉及的菌不限于具体的菌株，均可市售获得，如可购自中国药品生物制品检定所、美国ATCC等微生物菌种保藏机构。实施例1多重PCR引物筛选(I)RAPD-PCR应用3 条随机引物 S15 :5 ‘ -GGAGGGTGTT-3 ‘ (SEQ ID No. 16)、S18 5' -CCACAGCAGT-3‘ (SEQ ID No. 17)和 S103 :5‘ -AGACGTCCAC-3‘ (SEQ ID No. 18)进行 RAPD-PCR扩增。反应体系采用 QIAGEN Fast Cycling PCR Kit 20 μ L，上述引物各 lOpmol， 汉赛巴尔通体(购自美国菌种保藏中心，ATCC49882)基因组DNA 50ng。扩增条件为94°C 解链5分钟；94°C变性40秒，40°C退火40秒，72°C延伸1分钟，35个循环；72°C延伸5min。(2) RAPD-PCR扩增产物克隆测序将汉赛巴尔通体RAPD-PCR扩增带A、B、C、D、E和F (图1)分别切胶纯化，克隆到质粒上测序。序列分析显示扩增带A、B、C、D、E和F分别是dnaG、BH11550 (膜整合蛋白基因)、ppdK、BH13010 (外膜蛋白基因)、nrdl、rpsK、IpxD0(3)多重PCR组合基因筛选依据上述各基因序列分别设计引物(表1)，分为不同组合扩增汉赛巴尔通体 (B. henselae)、和与其最为近缘的五日热巴尔通体(B. quintana)。A-B-D-E组合在一起， 对于汉赛巴尔通体和五日热巴尔通体4个基因均能扩增出来；再扩增A-B-C-F、A-B-F和 A-C-F组合，其中A-B-C-F对于汉赛巴尔通体各个基因均能扩增出来，对于五日热巴尔通体C扩增不出来。再进行生物信息学分析后发现，发现BH13010特异性地仅存在汉赛巴尔通体和五日热巴尔通体基因组中，因此，利用序列高变区可特异性的鉴定汉赛巴尔通体， BH13010的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。结果也表明，本发明根据汉赛巴尔通体的 BH13010基因的序列高变区涉及的引物，能够从汉赛巴尔通体和五日热巴尔通体准确地鉴定出汉赛巴尔通体。为了保证特异性，筛选A(SEQ ID No. 2)、C^PF(SEQ ID No. 3)三个基因片段用于鉴定汉赛巴尔通体。设计并筛选出引物BhAF-BhAR (简称A)、Cpf-Cpr (简称C)、6fl_6f2(简称F) 3对引物组合，特异性扩增汉赛巴尔通体。结果表明，与汉赛巴尔通体最为近缘的五日热巴尔通体扩增结果为阴性，汉赛巴尔通体则能扩增出三个特异性条带。
表1扩增5个片段的引物序列
目的片段引物名称引物序列(5’ —3’)扩增带大小bpABhAF BhARCACGCGC ATCAAGATAACGAC TTCAATCCAATCGCCGACA1171BBhBF BhBRTGGATTAAGAGGATGCCGTTT CCCCACTCCATCACGGT442CCpf CprGTGACAGCTTATGGCGGTTT CGTCCATTGATCCAATTTCC293DBhDF BhDRCACAGCAGTAAGAGCACGAA GGCAAACCCTTTAGCGATATT381EBhEF BhERGCGGCGTGTTTAATTGG ATGACAATAATACGCGACGAA261F6fl 6￡2ACAGCAGTAGATGCAAtAA ACGTCCACACCACAGCG215实施例2PCR反应条件优化1、引物浓度模板市售的核酸提取试剂盒提取汉赛巴尔通体菌株基因组DNA。反应体系扩增体系为50yL，宝生物公司IOXEx Taq buffer IOyL, TaKaRa Ex Taq 5U,5mM dNTP mixture，引物 BhAF-BhAR、Cpf-Cpr 和 6f l_6f2 各 IOpmol 或者引物 BhAF-BhAR 和 Cpf-Cpr 各 IOpmol，引物 6fl_6f2 15pmol, 1 μ L DNA 模板，和去离子水补足到 50 μ L0PCR扩增参数94°C变性30sJ4°C退火30s，72°C延伸lmin，共25个循环。凝胶电泳和结果观察取5 μ L PCR产物和1 μ L 6 X上样缓冲液充分混勻，置1 % 琼脂糖凝胶电泳。电压5v/cm，电泳缓冲液为0. 5XTBE，凝胶成像仪观察结果并拍照。结果表明，在引物BhAF-BhAR、Cpf-Cpr和6f l_6f2各IOpmol的条件下，引物 6fl-6f2扩增出的片段亮度较暗，而在引物BhAF-BhAR和Cpf-Cpr各lOpmol，引物6fl_6f2 15pmol的条件下，引物6fl-6f2扩增出的片段亮度合适，其他条带不受影响，效果较好。2、退火温度用上述建立的体系进行扩增，退火温度分别为M 54. 7 55. 4 °C、56. 4 V、 57. 2°C、58°C。结果表明，不同的退火温度对扩增结果没有影响，效果均较好。3、TaqDNA 酶用上述建议的体系进行扩增，所用的TaqDNA酶分别为宝生物的TaKaRa Ex !"aq、QIAGEN 的 Fast Cycling PCR Master Mix、赛百盛的 Taq DNA 聚合酶和 U-Taq DNA Polymerase、天根的 Taq DNA Polymerase 禾口 Taq Plus DNA Polymerase。结果表明，宝生物的 TaKaRa Ex Taq、QIAGEN 的 Fast Cycling PCR Master Mix 和天根的 iTaq Plus DNA Polymerase扩增效果优于其它的。 实施例3特异性检测实验
用实施例2优化后的体系扩增五日热巴尔通体、克氏巴尔通体 (B. clarridgeiae)、克勒巴尔通体(B. koehlerae)、文森巴尔通体博格霍夫亚种 (B. vinsonii subsp. berkhoffii)、文森巴尔通体阿鲁潘亚种(B. vinsonii subsp. arupensis)、伊丽莎白巴尔通体(B. elizabethae)、格拉汉姆巴尔通体(B. grahamii)、 特利波契巴尔通体(B. tribocorum)、道志巴尔通体(B. doshiae)和杆菌样巴尔通体 (B. bacilliformis)均无三条扩增带A、C、F同时出现的情况，仅有五日热巴尔通体、克勒巴尔通体扩增出A和F带，但C带没有出现(图幻。结果表明，单独扩增C带也一样可以特异性地鉴定出汉赛巴尔通体。扩增根癌土壤杆菌、布鲁菌、立克次体、大肠杆菌、志贺氏菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、无形体、空肠弯曲菌、军团菌、鲍氏不动杆菌、钩端螺旋体、伯氏疏螺旋体、肺炎链球菌、幽门螺杆菌、肺炎克雷伯杆菌、霍乱弧菌、伤寒杆菌、鼠伤寒沙门菌脑膜炎奈瑟菌等27种细菌及人、猫、犬和鼠类基因组DNA均无阳性扩增带(图4)，表明本发明能特异性地鉴定出汉赛巴尔通体。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种汉赛巴尔通体的PCR鉴定方法，其特征在于，根据汉赛巴尔通体外膜蛋白基因 BH13010的序列高变区设计特异性引物，以待测样品DNA或细菌培养物为模板进行特异性扩增，若能扩增到特异性条带，即鉴定为汉赛巴尔通体。
2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，其中PCR引物序列为 Cpf GTGACAGCTTATGGCGGTTT,Cpr :CGTCCATTGACCAATTTCC。
3.一种汉赛巴尔通体的多重PCR鉴定方法，其特征在于，以待测样品DNA或细菌培养物为模板，特异性地扩增汉赛巴尔通体的dnaG基因、膜整合蛋白基因BH11550、外膜蛋白基因 BH13010和IxpD基因，扩增到目的条带即为汉赛巴尔通体，其中，外膜蛋白基因BH13010的引物是根据汉赛巴尔通体外膜蛋白基因BH13010的序列高变区设计的。
4.如权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，其中，PCR引物分别为 BhAF CACGCGCATCAAGATAACGAC,BhAR TTCAATCCAATCGCCGACA ； Cpf :GTGACAGCTTATGGCGGTTT, Cpr CGTCCATTGACCAATTTCC ；禾口 6fl ACAGCAGTAGTATGCAAtAA， 6f2 :ACGTCCACACCACAGCGo
5.如权利要求4所述的鉴定方法，其特征在于，其中PCR反应液中，引物BhAF、BhAR, Cpf和Cpr的浓度分别为0. 2 μ M，引物6fl和6f2的浓度为0. 3 μ M。
6.如权利要求4所述的鉴定方法，其特征在于，其中多重PCR反应条件为94°C变性 30s，54 58°C退火30s，72°C延伸lmin，扩增25个循环。
7.汉赛巴尔通体PCR鉴定用引物，其为 Cpf GTGACAGCTTATGGCGGTTT,Cpr CGTCCATTGACCAATTTCC。
8.汉赛巴尔通体多重PCR鉴定用引物，其为 BhAF CACGCGCATCAAGATAACGAC,BhAR TTCAATCCAATCGCCGACA ； Cpf :GTGACAGCTTATGGCGGTTT, Cpr CGTCCATTGACCAATTTCC ；禾口 6fl ACAGCAGTAGTATGCAAtAA， 6f2 :ACGTCCACACCACAGCGo
9.含有权利要求7或8所述引物的汉赛巴尔通体多重PCR鉴定试剂盒。
10.权利要求7或8所述的引物在制备用于鉴定汉赛巴尔通体的试剂中的应用。
全文摘要
本发明提供一种汉赛巴尔通体的PCR鉴定方法，其根据汉赛巴尔通体外膜蛋白基因BH13010的序列高变区设计特异性引物，以待测样品DNA或细菌培养物为模板进行特异性扩增，若能扩增到特异性条带，即鉴定为汉赛巴尔通体。其中，所述的引物序列如SEQ IDNo.6和7所示。本发明引物特异性好，鉴定方法准确度高，操作简单，对仪器设备要求低，成本低。
文档编号C12Q1/68GK102312006SQ20111030104
公开日2012年1月11日 申请日期2011年9月28日 优先权日2011年9月28日
发明者刘起勇, 张建中, 栗冬梅 申请人:中国疾病预防控制中心传染病预防控制所