专利名称：一种制备右旋糖酐的右旋糖酐糊精酶的制作方法
技术领域：
本发明属于右旋糖酐生产制备技术领域，具体涉及一种从氧化葡萄糖杆菌 (Gluconobacter oxydans)胞内分离纯化的右旋糖酐糊精酶，及其制备方法和主要的酶学性质。
背景技术：
右旋糖酐(Dextran)，又名葡聚糖，是一种由葡萄糖单元脱水形成的高分子聚合物，它的结构具有多样性，通常被定义为一种完全由α-D-吡喃葡萄糖单体构成的多糖。右旋糖酐是某些细菌产生的一种胞外多糖，是由分泌性酶催化生成的胞外产物，作为最早发现的微生物多糖，右旋糖酐是美国FDA(食品和药物管理局)批准的第一种可用于食品的微生物胞外多糖，也是世界上第一个工业化生产的微生物多糖。右旋糖酐因其安全、无毒、生物相容性好等优点，被广泛应用于医药、食品、色谱分析等多个领域。右旋糖酐的生产包括有如下两种方法微生物直接发酵法和酶合成法，而工业生产上主要以直接发酵法为主。但直接发酵法生产葡聚糖时，产物分子大小难以控制，发酵后菌体与产品很难分离，生产中引入的氮、氯等杂质，致使右旋糖酐质量低，临床副反应多。而利用诱导分离出的葡聚糖合成酶来制备右旋糖酐可以克服这些不足，因此，从特有的微生物中通过分子生物学技术构建和筛选的右旋糖酐合成酶的全新酶源是目前研究重点之一。Hehre和Hamilton等在研究中发现来源于G. oxydans中的某种酶能够利用麦芽糊精和淀粉部分水解物合成右旋糖酐，这种酶被命名为右旋糖酐糊精酶(DDase)。该酶可催化形成只含有α-1，6和α-1，4-糖苷键的右旋糖酐，该右旋糖酐与利用肠膜明串珠菌制备的右旋糖酐相比，粘度和含热值较低，且具有持水性、粘稠性的特点，作为低热量食品添加剂， 广泛应用于食品行业。研究表明，应用DDase是一条优良的右旋糖酐合成途径。该种产品还有许多潜在应用领域亟待开发，如新型食品添加剂、淀粉基甜味剂、低脂肪食物替代品等寸。近二十年来，人们开始慢慢关注这种特殊的转糖基酶，分别对该酶的特性进行了深入的研究，包括影响产酶的环境因素、酶的纯化、酶的底物特异性以及糖基衍生物的合成等等。但是，到目前为止，关于氧化葡萄糖杆菌右旋糖酐糊精酶分离纯化技术方法及其酶学性质的研究鲜有报道，而分子量小于100的小分子右旋糖酐糊精酶，更未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种从氧化葡萄糖杆菌(GluconcAacter oxydans)胞内分离纯化的右旋糖酐糊精酶，及其制备方法和主要酶学性质，以弥补现有技术不足。本发明的右旋糖酐糊精酶，是从能合成右旋糖酐的氧化葡萄糖杆菌中分离纯化得到的，其SDS-PAGE电泳分子量大小为62kD。上述的氧化葡萄糖杆菌可以选用Gluconobacter oxydans DSM 2003菌。上述的右旋糖酐糊精酶，其作用底物为麦芽糊精。
上述的右旋糖酐糊精酶，其抑制剂为狗2+，Zn2+或Cu2+。上述的右旋糖酐糊精酶，其最适酶反应pH范围为4-10。上述的右旋糖酐糊精酶，其最适酶反应温度为15-55°C ；温度稳定区间低于30°C ； PH稳定区间为4. 5-9. 5 ；米氏常数Km为0. 63mmol/L;最大反应速率Vmax为7. 48ymol/ (mL · min)。上述的右旋糖酐糊精酶是联合应用离子交换层析和凝胶过滤层析法从氧化葡萄糖杆菌的发酵粗酶液中纯化得到的。本发明的右旋糖酐糊精酶在制备右旋糖酐中的应用。本发明的右旋糖酐糊精酶，其用麦芽糊精为底物所合成出的右旋糖酐与肠膜状明串珠菌所制备的右旋糖酐相比，只含有α_1，6-糖苷键和α-1，4-糖苷键，并且制备的右旋糖酐结构中出现了肠膜状明串珠菌右旋糖酐上是很少见的α-1，4_支链这一结构。除此之外，相比于G.oxydans ATCC 11894所合成的右旋糖酐，该酶所合成的右旋糖酐中支链的比例更高(12% )，并且具有粘度低的特点。这些特性将使其在食品领域拥有更广阔的应用前
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图1 本发明的右旋糖酐糊精酶纯化过程的电泳图；其中泳道1为粗酶液，2为膜过滤液，3 为 Q Sepharose Fast Flow 溶液,4 为 ANX Sepharose Fast Flow 溶液,5 为 Sephadex 75PG 溶液，6 为标准分子量蛋白(18. 4、25、35、45、66· 4、116kD)；图2本发明右旋II酐糊精酶的凝胶渗透色谱图3本发明右旋II酐糊精酶的最适酶活温度及温度稳定性示意图
图4本发明右旋II酐糊精酶的酶活半衰期；
图5本发明右旋II酐糊精酶的最优PH及pH稳定性示意图6各种离子对右旋糖酐糊精酶影响的示意图7底物浓度对右旋糖酐糊精酶反应速率的影响图8本发明右旋II酐糊精酶酶促反应液凝胶渗透色谱图。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明酶的纯化步骤、酶的性质进行详细的描述。实施例1 右旋糖酐糊精酶的分离纯化步骤本发明的酶是从能合成右旋糖酐的氧化葡萄糖杆菌中分离纯化的，其中一种是氧化葡萄糖杆菌DSM 2003，该菌株已在文献中公开(氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003膜结合乙醇脱氢酶的纯化鉴定和性质研究食品科学2010年31卷13期)。目前该菌株保藏于中国海洋大学食品科学与工程学院。(1)菌体培养将氧化葡萄糖杆菌DSM 2003菌种接种于种子培养基，30°C恒温摇床培养24h后， 按接种量10% (ν/ν)接入产酶培养基，30°C恒温摇床培养60h。种子培养基山梨醇80g/L，酵母粉 20g/L，KH2PO4 0. 6g/L，MgSO4 · 7H200. 5g/L。产酶培养基萄糖17. 67g/L，麦芽糖30g/L，胰蛋白胨12. 20g/L,酵母粉13. 53g/L，硝酸铵15g/L，硫酸铜0. 01g/L，硫酸锌0. 01g/L，氯化钠0. 01g/L，初始pH 6. 0。(2)无细胞粗酶液的制备离心发酵液收集菌体，向菌体中加入3倍体积的pH 7. 4的50mmol/LTriS-HCl缓冲液，重悬后采用超声波破碎90次(超声波破碎条件每破碎k间隔k，功率300W)。再在4°C下离心(10000r/min，20min)，上清液即为无细胞粗酶液；(3) Q Sepharose Fast Flow琼脂糖凝胶阴离子交换层析用pH 7. 4的50mmol/L Tris-HCl缓冲液充分平衡HiTrap Q FF离子交换柱(5mL， GE公司)，上样吸附。然后用pH 7. 4的50mmol/L Tris-HCl缓冲液(含lmol/LNaCl)进行阶段洗脱，洗脱速度为2mL/min，分部收集，对收集管中的溶液测酶活并进行蛋白电泳分析；(4) HiPrep Desalting Sephadex 1 用pH 7. 4 的 50mmol/L Tris-HCl 缓冲液充分平衡 HiPr印 26/10 Desalting 凝胶脱盐柱(53mL，GE公司)，上样吸附。然后用pH 7. 4的50mmol/L Tris-HCl缓冲液进行缓冲液置换，洗脱速度为2mL/min分部收集，对收集管中的溶液测酶活并进行蛋白电泳分析；(5) ANX Sepharose Fast Flow琼脂糖凝胶阴离子交换层析用pH 7. 4 的 50mmol/L Tris-HCl 充分平衡 HiTrap ANX FF 离子交换柱(lmL, GE 公司)，上样吸附。然后用pH 7. 4的50mmol/L Tris-HCl缓冲液(含lmol/L NaCl)进行阶段洗脱，洗脱速度为2mL/min，分部收集，对收集管中的溶液测酶活并进行蛋白电泳分析；(6) Sephadex 75PG 凝胶过滤层析用pH 7. 4 的 50mmol/L Tris-HCl 缓冲液(含 IOOmmol/L NaCl)充分平衡 HiLoad 16/60 Superdex 75PG凝胶柱(120mL，GE公司)，上样^iL的酶浓缩液。然后用pH 7. 4的 50mmol/L Tris-HCl缓冲液(含100mmol/L NaCl)洗脱，洗脱速度0. 5mL/min，分部收集，对收集管中溶液测酶活并进行蛋白电泳分析。分别测定了以上个步样品的酶活力并进行了 SDS-PAGE。纯化结果见表1，粗酶液经几步纯化后，比活性从0. 6U/mg提高到112. 5U/mg,纯化倍数为187. 5倍。蛋白电泳结果 (图1)表明，纯化后的右旋糖酐糊精酶在电泳上为一条带，分子量约为62kD。表1 右旋糖酐糊精酶的纯化步骤及结果
权利要求
1.一种右旋糖酐糊精酶，是从能合成右旋糖酐的氧化葡萄糖杆菌中分离纯化得到的， 其SDS-PAGE电泳分子量大小为62kD。
2.如权利要求1所述的右旋糖酐糊精酶，其特征在于所述的氧化葡萄糖杆菌为 Gluconobacter oxydans DSM 2003 菌。
3.如权利要求1所述的右旋糖酐糊精酶，其特征在于所述的右旋糖酐糊精酶，其作用底物为麦芽糊精。
4.如权利要求1所述的右旋糖酐糊精酶，其特征在于所述的右旋糖酐糊精酶的抑制剂为 Fe2+，Zn2+或 Cu2+。
5.如权利要求1所述的右旋糖酐糊精酶，其特征在于所述的右旋糖酐糊精酶的最适酶反应pH范围为4 10。
6.如权利要求1所述的右旋糖酐糊精酶，其特征在于所述的右旋糖酐糊精酶的酶反应温度为15-55°C。
7.权利要求1所述的右旋糖酐糊精酶的生产方法，是从能合成右旋糖酐的氧化葡萄糖杆菌的发酵粗酶液中纯化得到的。
8.如权利要求7所述的生产方法，其特征在于是将所述的发酵粗酶液经离子交换层析和凝胶过滤层析后制备出右旋糖酐糊精酶。
9.权利要求1所述的右旋糖酐糊精酶在制备右旋糖酐中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种从能合成右旋糖酐的氧化葡萄糖杆菌中分离纯化得到的，其SDS-PAGE电泳分子量大小为62kD，其作用底物为麦芽糊精，抑制剂为Fe2+，Zn2+和Cu2+；最适酶反应pH范围为4-10。本发明的右旋糖酐糊精酶，其与以麦芽糊精为底物合成的右旋糖酐与肠膜状明串珠菌右旋糖酐相比，只含有α-1，6-糖苷键和α-1，4-糖苷键，并且其结构中出现了肠膜状明串珠菌右旋糖酐上是很少见的α-1，4-支链这一结构。除此之外，相比于G.oxydans ATCC 11894所合成的右旋糖酐，该酶所合成的右旋糖酐中支链的比例更高(12％)，并且具有粘度低的特点。这些特性将使其在食品领域拥有更广阔的应用前景。
文档编号C12P19/14GK102321597SQ20111030099
公开日2012年1月18日 申请日期2011年10月9日 优先权日2011年10月9日
发明者毛相朝, 王舒, 阚翡翡, 魏东芝 申请人:中国海洋大学