专利名称：一种多色标记活体病毒颗粒的方法
技术领域：
本发明涉及生物、化学、材料、医学、病毒学等学科的交叉学科领域，更具体涉及一种多色标记活体病毒颗粒的方法。
背景技术：
实时示踪活病毒颗粒侵染宿主细胞的研究对于深入理解病毒侵染机制及病毒导致疾病的早期治疗都具有重要意义。在以往的研究中，研究者主要通过两种手段对病毒进行标记并用于示踪研究1)在病毒的外蛋白区域靶向的融合一段荧光蛋白；2)通过化学反应直接将荧光分子探针与病毒蛋白进行偶联。这些方法能够提供许多关于病毒胞吞进入宿主细胞，以及囊膜病毒与宿主细胞膜融合的信息。然而，病毒侵染宿主细胞是一个极其复杂的过程，其主要过程包括病毒囊膜与宿主细胞发生膜融合，病毒核酸在溶酶体内的释放及其在细胞质内的定向移动，病毒核酸在宿主细胞核内的复制及病毒蛋白的表达。仅仅对病毒外蛋白的标记将很难示踪到病毒与细胞膜融合后病毒核酸的定向移动。这个关键信息的丢失大大限制了病毒学的发展。因此，对病毒颗粒的多组分标记，特别是其病毒核酸的标记一直是一个热点问题。虽然多年以来，研究者们一直在尝试标记病毒核酸，其成功标记的工作还鲜有报导。归其原因主要是由于其病毒独特的紧密结构。完整的病毒颗粒一般由囊膜，核壳蛋白和核酸三部分组成，一旦病毒在宿主细胞内组装完成，其病毒核酸就被保护在核壳蛋白及囊膜中。染料很难与其进行偶联。如果通过外力将病毒解离后标记，其病毒的感染能力将大大降低，甚至完全丧失。而本申请在病毒的细胞内增殖过程中，采用金属配合物对重组病毒进行核酸标记，不仅实现了病毒囊膜和病毒核酸的同时标记，而且不影响标记病毒的感染能力，同时，标记效率高，能更好地满足实时示踪活病毒颗粒侵染宿主细胞研究的需要。
发明内容
针对现有技术的限制，本发明的目的是在于提供了一种多色标记活体病毒颗粒的方法。该方法基于病毒自组装体系，将金属配合物与细胞培养基混合，在病毒的细胞内增殖过程中标记病毒核酸；结合基因工程技术，实现了细胞内双荧光标记不同的病毒组分(囊膜蛋白，核酸)。标记过程绿色环保、步骤简单；仅仅通过病毒在宿主细胞内的自增殖，就能得到大量带有绿色荧光囊膜，红色荧光核酸的双色标记子病毒颗粒。通过表征纯化的子代病毒颗粒，可以确定标记的病毒结构完整，每颗病毒含有大量的金属配合物，并且在细胞成像实验中能够提供优异的荧光信号。为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施一种多色标记活体病毒颗粒的方法，其步骤如下(1)借助病毒展示系统，将绿色荧光蛋白(EGFP)与病毒囊膜蛋白GP64融合表达， 构建出GP64上带有绿色荧光蛋白的重组病毒。根据GenBank中AcMNPV基因组(GenBank :L22858. 1)序列用引物设计软件Primerpremier 5 (Premier公司)，设计EGFP/gp64基因表达引物(图6)，在gp64的5’和3’分别加入EcoR I和HindIII两个酶切位点。首先，以提纯的pEGFP-Nl质粒(Clonetech公司) 作为模版，FEGl和REG-G为引物进行PCR扩增；将得到的PCR产物EGPO作为模板，以FN2 和REG-G为引物再次进行PCR扩增，得到一段包含GP64信号肽和EGFP序列的片段，将此序列命名为EGP1。然后以提纯的Bacmid DNA为模板Qnvitrogen公司的he to bac杆状病毒系统)，FG-EG和RG为引物进行PCR扩增，得到一段包含有gp64肽段序列的片段，将此序列命名为EGP2。EGPl的3’端加入的27个EGP2的5’端序列由引物REG-G引入，EGP2的 5，端加入的24个EGPl的3，端序列由引物FG-EG引入，这样EGPl和EGP2就有了 24个互补碱基，为后面的Overlap PCR实验提供条件。Overlap PCR实验以EGPl和EGP2为模板， FN2和RG为引物，扩增出在gp64信号肽序列后面融合有EGFP序列的片段，将此序列命名为 EGFP/gp64。PCR反应体系如下(5，-GAATTCATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTGGCGGCGGCGGCG-3')，(5， -AAGCTTTTAATATTGTCTATTACGGTTTCTAATC-3，)
1 OxKOD-PIus 缓冲液 2mM dNTPs 25mM MgCl2 引物(每种ΙΟμΜ)
5 μ 4 μL 2 μL 1 μL
KOD-Plus ( υ/μ ) ddH20
模板DNA (质粒DNA) 总体积
1 μL 35.5 μ 20 ng 50 μL
权利要求
1. 一种多色标记活体病毒颗粒的方法，其步骤如下(1)借助病毒展示系统，将绿色荧光蛋白与病毒囊膜蛋白GP64融合表达，构建出GP64 上带有绿色荧光蛋白的重组病毒；根据GenBank中AcMNPV基因组序列用引物设计软件Primer premier 5，设计EGFP/ gp64基因表达引物，在gp64的5’和3’分别加入EcoR I和HindIII两个酶切位点，首先， 以提纯的pEGFP-Nl质粒作为模版，FEGl和REG-G为引物进行PCR扩增；将得到的PCR产物EGPO作为模板，以FN2和REG-G为引物再次进行PCR扩增，得到一段包含GP64信号肽和EGFP序列的片段，命名为EGPl，然后以提纯的Bacmid DNA为模板，TO-EG和RG为引物进行PCR扩增，得到一段包含有gp64肽段序列的片段，命名为EGP2，EGPl的3’端加入的27 个EGP2的5，端序列由引物REG-G引入，EGP2的5，端加入的24个EGPl的3，端序列由引物FG-EG引入，这样EGPl和EGP2就有了 24个互补碱基，OverlapPCR实验以EGPl和EGP2 为模板，FN2和RG为引物，扩增出在gp64信号肽序列后面融合有EGFP序列的片段，命名为 EGFP/gp64，PCR反应体系如下.1 OxKOD-PIus 缓冲液5 μ .2mM dNTPs4 μL.25mM MgCl22 μL引物(每种ΙΟμΜ)1 μLKOD-Plus ( υ/μ )1 μLddH2035.5 μ 模板DNA20 ng总体积50 pL;将连接反应产物电转化入大肠杆菌DH5 α感受态细胞中制备质粒EGFP/gp64_T Easy Vector,限制性内切酶EcoR I和HindIII双酶切供体质粒EGFP/gp64_T Easy Vector和表达载体pFastBacl，酶切产物经凝胶电泳显示出大小不同的片段，在紫外灯下切取与EGFP/ gp64片段和酶切后的pFastBacl片段大小相符合的胶带，回收DNA片段，纯化回收后在4°C 进行连接反应，EGFP/gp64片段插入到表达载体pFastBacl相应的多克隆位点中；双酶切在 37°C条件下进行3h，反应体系如下提纯质粒DNA200 ngEcoR I2 μLHindIII2 μLIOxMbufFer5 μ ddH2033 μ 总体积50 μL；连接反应体为4°C过夜反应，两片段的加入量根据两片段的浓度和大小对作调整，反应体系如下酶切后的 pFastBacl40 ng酶切后的EGFP/gp64 DNA片段40 ng.2χΤ4 连接酶 buffer5 μLT4连接酶1 ^总体积10 ^iL;.1.连接产物电转化入制备好的大肠杆菌DH5 α感受态细胞中，在含有100 μ g/mL氨苄青霉素和100 μ g/mL卡那霉素的平板上进行蓝白斑筛选，提取白色菌落的质粒DNA，进行 EcoR I-HindIII双酶切鉴定，命名为pFastBacl-EGFP，以50%甘油/菌液体积比3 7存于-80°C冰箱中；将pFastBacl-EGFP转座入野生型杆状病毒全基因组Bacmid中，操作步骤如下将冻存的DHlOBac感受态细胞从冰箱中取出，在冰浴中加入1 μ Lpi^astBacl-EGFP质粒DNA，两者轻轻混勻后转移到预冷的转化杯中，在电转化仪上转座，操作电压为1800V，电转化成功后快速向转化杯中加入0. 8mL SOC培养基，混勻的混合物转移到EP管中37°C，200rpm摇床培养 4h，取 5 μ L 菌液加入 20mg/mL 的 X_gal 40 μ L 和 200mg/mL 的 IPTG 4uL,涂于含有 100 μ g/ mL卡那霉素和100 μ g/mL庆大霉素的固体培养平板上，将平板倒置于37°C培养，16- 小时后进行蓝白斑筛选；用接种环挑取平板上的白色菌落，在100 μ g/mL卡那霉素和100 μ g/mL 庆大霉素的平板上再次进行蓝白斑筛选，挑取平板上的白色菌落，分别接种于含有100 μ g/ mL卡那霉素和100 μ g/mL庆大霉素的LB液体培养基中，37°C摇床培养过夜，沾取各管中菌液，用 M13Forward 和 M13Reverse 引物、以及 M13Forward 和 RG 引物或者 FN2 和 M13Reverse 引物对菌液进行PCR鉴定，命名为Bacmid-EGFP，以50%甘油/菌液体积比3 7存于_80°C 冰箱中；PCR体系为.1 OxKOD-PIus 缓冲液2.5 μL.2mM dNTPs2 μL.25mM MgCl21 μL引物每种ΙΟμΜ0.5 μLKOD-Plus υ/μ 1 μLddH2015.5 μL模板DNA20 ng总体积25 pL鉴定为正确的克隆重新转接到含有100 μ g/mL卡那霉素和100 μ g/mL庆大霉素的LB 液体培养基中培养，16- 小时后提取整管菌液质粒，转染Spodopterafrugiperda细胞得第一代病毒，提取Bacmid-EGFP质粒的步骤为将菌液倒入1. 5mL的印pendorf管中， 5，OOOrpm离心^iin后倒掉上清，继续倒入试管中剩下的菌液，重复操作三次直至菌体完全沉淀；加入300 μ L溶液I振荡打散菌体沉淀；加入300yL溶液II，反复颠倒三到四次至混勻，静置至澄清；加入300 μ L提取Bacmid的溶液III，颠倒混勻，冰上放置5min ；12, OOOrpm离心15min，吸取上清转到另一个1. 5mL的印pendorf管中；加入800 μ L异丙醇，_20°C放置25min后12，OOOrpm离心15min ；倒掉上清，加入70%体积比的乙醇ImL, 12，OOOrpm离心 5min ；彻底去除上清，室温干燥，加入20 μ L ddH20溶解；sf9细胞传代到35mm小皿中，在含有10 %质量体积比胎牛血清的Grace，s培养基中于无(X)2条件下培养至贴壁，转染前用无血清Grace’ s培养基洗两次，准备转染液A溶液16 μ LBacmid-EGFP质粒与84 μ L无血清Grace，s培养基混合均勻，B溶液 8 μ Llipofectamine与92 μ L无血清Grace’ s培养基混合均勻，B溶液逐滴加入A溶液中产生脂类-DNA复合物，20-25°C静置45min，每隔5min用手弹勻，每支复合物加入800 μ L无血清Grace’ s培养基，抽吸混勻，滴加入待转染的sf9细胞中，置于23°C无(X)2培养箱中培养6-7个小时，吸出转染混合物，加入2mL含有10%质量体积比胎牛血清的Grace’ s培养基，置于.23°C无CO2培养箱中培养，6天后收集第一代重组病毒，命名为Bac-EGFP ；(2)金属配合物[Ru(phen)2(dppZ)]2+溶液加入10%质量体积比胎牛血清的Grace’s 培养基中培养Sf宿主细胞；将步骤1所构建的重组病毒Bac-EGFP加入培养的宿主细胞中在25°C条件下进行病毒感染，增殖，操作为sf9细胞在含有10%质量体积比胎牛血清的 Grace’ s培养基中生长至70%大皿底面积时用于扩增病毒，先吸出部分培养基，使余下的培养基刚好淹没细胞，加入500mL第一代重组病毒，置于23°C无(X)2培养箱中感染1. 5h，每隔半个小时晃动一下，感染后的细胞加入6mL含有10%质量体积比胎牛血清的Grace's培养基，置于23°C无(X)2培养箱中培养，4天后收获子代病毒；(3)收集，纯化双色标记的子代病毒颗粒，得到的子代病毒通过透射电镜，电感耦合等离子体质谱和激光扫描共聚焦显微镜表征其结构，测量其单颗病毒金属配合物含量及展示其单颗病毒的双荧光信号。
2.根据权利要求1所述的一种多色标记活体病毒颗粒的方法，其特征在于所述的溶液 I :50mmol/L 的葡萄糖，25mmol/L 的 Tris-Cl, IOmmol/L 的 EDTA,终 pH 8. 0 ；溶液 II 0. 2mol/L的NaOH, 1 % SDS,新鲜配制；溶液III :5mol/L的乙酸钾60mL,冰乙酸11. 5mL,水 28. 5mL ；提取Bacmid的溶液III :3mol/L的乙酸钾，终pH5. 5。
全文摘要
本发明公开了一种多色标记活体病毒颗粒的方法，其步骤A、借助病毒展示系统，将绿色荧光蛋白与病毒囊膜蛋白GP64融合表达，构建出GP64上带有绿色荧光蛋白的重组病毒；B、金属配合物[Ru(phen)2(dppz)]2+溶液加入胎牛血清的Grace’s培养基中培养sf宿主细胞；将构建的重组病毒Bac-EGFP加入培养的宿主细胞中进行病毒感染，置于培养箱中培养，收获子代病毒；C、收集，纯化双色标记的子代病毒颗粒，得到的子代病毒通过透射电镜，电感耦合等离子体质谱和激光扫描共聚焦显微镜表征其结构，测量其单颗病毒金属配合物含量及展示其单颗病毒的双荧光信号。操作简便，标记效率高，得到的标记病毒具有优异的荧光信号，能更好地满足实时示踪活病毒颗粒侵染宿主细胞研究的需要。
文档编号C12N15/866GK102492662SQ201110358688
公开日2012年6月13日 申请日期2011年11月14日 优先权日2011年11月14日
发明者何治柯, 周鹏, 王汉中 申请人:武汉大学