胰岛素模拟肽融合蛋白和突变体及其应用的制作方法

专利名称：胰岛素模拟肽融合蛋白和突变体及其应用的制作方法
胰岛素模拟肽融合蛋白和突变体及其应用发明领域
本发明涉及人糖尿病的预防和治疗药物。具体的，本发明提供一种用于检测和治疗人I型和II型糖尿病的融合蛋白及其制备方法和应用。所述融合蛋白含有胰岛素模拟肽(IMP)和人 IgG-Fc (铰链区-CH2-CH3)蛋白和 / 或 IgG-Fc 突变体(T250Q/M428L ；QL 和 T307Q/N434A;QA)，能有效降低糖尿病患者的血糖水平，增加胰岛素模拟肽体内的半衰期， 尤其是IgG-Fc(QL/QA)的突变体，能进一步增加胰岛素模拟肽的体内代谢半衰期，减少药物的注射频次。
背景技术：
随着人们生活水平的提高，人口老龄化以及肥胖发生率的增加，糖尿病的发病率呈逐年上升趋势。糖尿病是造成人类死亡的主要病因之一，全球大约有2亿患者。糖尿病在中国的发病率达到2%，据统计，中国目前已有3980万糖尿病病人，位居全球第二。预计到2025年，中国糖尿病患者将达到5900万人。中国目前每年约有100多万新增病例。其中I型糖尿病患者占10%，11型糖尿病患者占90%。据业内专家估计，目前国内糖尿病药物的市场容量约70亿元人民币，根据卫生部公布的数据分析显示，未来几年中国糖尿病类药物的销售量将会超过100亿元人民币。
糖尿病的主要分为I型糖尿病和II型糖尿病。其中，I型糖尿病是一种常在小儿或青少年时形成的复杂T细胞依赖自身免疫性疾病(Juneia和I^lmer,Autoimmunity. 1999 ； 29(1) :65-83)。是由胰岛β细胞的免疫性破坏造成伴随相应的胰岛素缺乏和对外源性胰岛素的依赖。单核细胞对胰腺内分泌细胞及组织的病灶性侵润以及功能性β细胞的数量和质量的显著减少是诊断该疾病的组织病理学的特点，但是这些损伤的程度个体间差异显著。自身免疫性破坏使得T细胞侵润到胰岛(islets of Langerhans)，结果出现β细胞的凋亡(Lee 等人，Mol Genet Metab. 2004 ；83 (1-2) :82-92 ；Mandrup-poulsen, Biochem Pharmacol. 2003 ；66 (8) :1433-1440 ；Scsti, Ann Med. 2002 ；34(6)444-450 ；Mathis 等人， Nature. 2001 ；414 (6865) 792-798)。为研究糖尿病潜在的分子机制，已经建立了多种动物模型。例如，用链脲霉素(str印tozotocin) (STZ)诱导的胰岛素缺乏性的大鼠或小鼠模拟在糖尿病患者体内可见的T-细胞介导的炎症和胰岛细胞的破坏。此外，非肥胖糖尿病 (NOD)的小鼠是另一个研究自身免疫性疾病的模型，其中胰岛-抗原活性T细胞浸润胰岛并杀死胰岛β-细胞，并且/或者引发炎症过程导致胰岛β细胞的死亡(Aanderson and Bluestone, Annu Rev Immunol. 2005 ；23 :447-485)。
胰岛素疗法是干预I型糖尿病的主要手段。通过激活胰岛素受体，调节体内血糖水平。胰岛素的受体是一个四聚体，由两个α亚基和两个β亚基通过二硫键连接。两个 α亚基位于细胞质膜的外侧，其上有胰岛素的结合位点；两个β亚基是跨膜蛋白，起信号转导作用。无胰岛素结合时，受体的酪氨酸蛋白激酶没有活性。当胰岛素与受体的α亚基结合并改变了 β亚基的构型后，酪氨酸蛋白激酶才被激活，激活后可催化两个反应
1、使四聚体复合物中β亚基特异位点的酪氨酸残基磷酸化，这种过程称为自磷酸化(autophosphorylation)；
2、将胰岛素受体底物(insulin receptor substrate，II s)上具有重要作用的十几个酪氨酸残基磷酸化，磷酸化的能够结合并激活下游效应物来调节血糖。
II型糖尿病是一种通常在成人期诊断的多基因功能失常，其以引起高血糖症的三个主要异常为特点1.外周胰岛素抵抗、2.肝糖原的过量生成、3.胰腺细胞功能障碍。胰岛素抵抗是指外周组织主要是骨骼肌细胞对胰岛素的反应降低，导致葡萄糖运输到这些组织的障碍(Kahn 和 Goldfine，Jdiabetes Complications. 1993 ；7 (2) :92-105 ； Weyer等人，Jclin Invest. 1999 ； 104(6) :787-794)。胰岛素抵抗同样可以发生在肝脏， 致使在肝脏中胰岛素不能有效地抑制肝脏葡萄糖的生成(Kahn和Goldfine，Jdiabetes Compilations. 1993 ；7(2) :92-105 ；Lam 等人，Am. Jphysiol Endocrinol Metab. 2002 ； ^3(4)E682-E691)。胰岛素抵抗的结果是机体对胰岛素的需求增加。在胰岛素抵抗的早期阶段，通过增加胰岛素分泌引起胰腺内β细胞质量增加的代偿机制。这些患者的血糖水平仍然可维持在正常范围内(Bonner Weir, Trends Endocrinol Metab. 2000 ；11 (9) 375-378 ；Bonner-Weir，Endocrinology. 2000 ； 141 (6) :1926-1929)。许多研究表明，如果能维持胰腺细胞的代偿功能，胰岛素抵抗本身还不足以激发糖尿病的发作(Weyer等人，Diabetes. 1999,48(11) :2197-2203)。但胰岛素抵抗长时间不予纠正并变得严重，对胰岛素的过度需求导致β -细胞衰竭，胰岛素分泌减少，并出现空腹高血糖症状和明显的糖尿病(DeFronzo, Diabetes. 1988 ；37 (6) :667-687 ；Kahn 等人，J Nutr. 2001 ；131 (2) :354S ； Weyer 等人，J Clin Invest. 1999 ； 104(6) :787-794)。
II型糖尿病的常规治疗包括节食和锻炼以及使用磺基脲(sulphonylureas)、甲福明二甲双胍和胰岛素进行药物性干预。但在大多数患者中这些治疗通常都无法阻止血糖控制的长期下降和β细胞的功能紊乱(Matthews等人，Diabet Med. 1998 ； 15 (4) :297-303 ； Turner等人，JAMA. 1999 ；281 (21) =2005-2012)临床上针对II型糖尿病所采用的阶梯式的治疗方法最终也无法维持血糖平衡，对于大多数患者，从节食和锻炼到单因素药物治疗、 从联合治疗最终到胰岛素治疗成为不可避免的过程(Turner等人，JAMA. 1999 ；281 (21) 2005-2012 ；Gerich, Eur J Clin Invest. 2002 ；32Suppl 3 :46-53)。
胰岛素受体是由两个135-kDa的胞外亚基和两个95_kDa的跨膜跨越亚基组成的二硫键相连的二聚体蛋白，含有由上游结合配体激活的细胞内酪氨酸激酶结构域 bina， Y.等人，Cell. 1985 ；40，747-758 和 Ullrich, Α.等人，Nature. 1985 ；313，756-761)。当胰岛素结合到受体后，激活一系列的代谢和有丝分裂反应，这些反应是由包括顶31、 2和Shc在内的几个胞外蛋白基质上的酪氨酸激酶发生磷酸化而产生(White，Μ. F.， Diabetologia. 1997. 40，Supp 1. 2，S2-S17)。IRSl 和 IRS2 是主要的胰岛素受体底物，导致糖代谢，并在不同的器官有独特的和重叠的角色。此外，IRSl和的修改与糖尿病的发生有非常直接的关系。(Yamauchi,T.等人，Mol. Cell Biol. 1996 ； 16，3074-3084 和 Withers， D.J.等人，Nature. 1998 ;391，900-904). Thirone 等在鼠的前肌细胞系(L6 cells)发现了 IRSl 和 IRS2 的特殊功能，并进行了总结(Thirone, A. C.等人，Trends Endocrinol. 2006 ； Metab. 17，72-78)。
但^Sl和对胰岛素信号和胰岛素抵抗发展的相对贡献还没有定论。大部分在这一领域发表的文献表明，^Sl是主要的基板，从而刺激肌肉和脂肪组织对葡萄糖的运输，而在肝脏中^Sl和在胰岛素信号和代谢的互补作用。在对比SHC中不会出现直接参与胰岛素代谢信号，但在胰岛素诱导的有丝分裂中起着关键作用(Thirone，A.C.等人，Endocr. J. 2000 ；47，373-381)。IRS和Shc启动促有丝分裂激活通路激酶/细胞外调节蛋白激酶(MAPK/ERK)途径，包括激活ERK1/2导致基因转录和蛋白质翻译和细胞生长。 其他被IRS蛋白质激活的信号通路是磷脂酰肌醇3激酶(PI3-激酶)途径，包括PKB的激活，导致糖原合成酶和其他酶/急性胰岛素的代谢作用所必需的蛋白质的激活(White， Μ. F. Diabetologia. 1997. 40，Supp 1. 2，S2-S17)。
通过噬菌体展示技术已经获得了能够结合胰岛素受体的合成肽(氨基酸数量 20 40 个)(Pillutla, R. C.等人，J. Biol. Chem. 2002 ；277，22590-22594)。这些多肽能够结合到胰岛素受体上的三个位点(位点1，2和3)。其中1和2两个位点与胰岛素受体上的胰岛素结合位点相重叠，而在位点3的胰岛素受体结合多肽结合在位点1附近，形成最近的同源二聚体。其中许多可以激活胰岛素受体，具有较高的效价和特异性，可能通过一种类似胰岛素与其受体结合的机制降低血糖水平(Schaffer，L.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 2003 ； 100，4435-4439)。
这些胰岛素模拟多肽能够像胰岛素一样激活胰岛素受体，降低鼠的血糖水平。他们的结构更简单的、体积更小，能够有效防止胰岛素抵抗的发生。它们是胰岛素替代治疗很好的候选药物，或者与胰岛素结合治疗糖尿病具有潜在的用途，并可以作为新型肽类药物的设计模板。在相关研究工作中，一些研究者在研究中发现一个31个氨基酸的胰岛素模拟肽(IMP)，能够与胰岛素受体高度亲和，并且相对于胰岛素，具有更弱的促进一些基因表达和促进有丝分裂作用。进一步研究发现，一方面，IMP具有与胰岛素相似的结合胰岛素受体亲和力，但与胰岛素的作用途径不同，这表明它们可以在胰岛素受体上共存。此外，发现这两个配体诱导的基因表达模式之间的存在显著差异，IMP促进细胞分裂的功能明显低于胰岛素。这表明，IMP具有与胰岛素相同的降血糖效果，能避免胰岛素抵抗，具有更小的促进细胞有丝分裂作用，更加的安全。
通常多肽类药物在体内的血清半衰期都比较短。因此需要频繁的给药，高频率的药物注射，严重影响了患者的生活质量，同时带来较高的治疗成本。因此，如何在不影响肽类生物活性的同时增加在体内的半衰期，是众多科学家研究的焦点。如WO 02/46227或WO 05/000892中描述的GLP-I与人血白蛋白或人IgG-Fc形成融合蛋白，能明显的增强其在体内的半衰期。融合蛋白的体内半衰期延长，可能由于其分子变大使肾脏排出减少形成。然而融合蛋白的体外研究显示出较低的功效(Kim等人，Diabetes. 2003 ；52 (3) :751-759)。这使得人们努力以开发出在体内功效稳定且体内半衰期更长的药物。因此，对于糖尿病需要开发针对I型和II型糖尿病的潜在分子机制而非该机制后果的有效治疗策略。理想的发明是既能针对胰岛素受体有效治疗糖尿病，又能减少药物的注射频次，降低药物使用成本， 避免胰岛素抵抗。
IgG-Fc是应用最广泛的延长肽类、细胞因子和可溶性受体类体内半衰期的融合蛋白之一，与其他蛋白类相比有许多明显的优势。一方面它可以延长体内的血清半衰期， 另外可以形成二聚体，提高与靶点结合的机率，另一方面对于IgG-Fc的研究比较深入，因此使用起来更加的安全。在IgG中，位于Fc上CH2和CH3域之间的位点(图1)介导与新生受体Fcfoi的相互作用，其中结合可以使来自内体的内吞Fc融合蛋白再循环到血流中(Raghavan et al.，1996，Annu Rev Cell Dev Biol 12 :181-220 ；Ghetie et al，2000， Annu Rev Immunol 18:739-766)。上述过程结合大分子后能减少肾脏滤过作用，产生1 3周的体内血清半衰期。Fc与Fcfoi的结合在单克隆抗体转运中也起关键作用。Fc上结合 Fcfoi的位点也是细菌蛋白A和G结合的位点。与这些蛋白的紧密结合通常可以用作蛋白纯化，使用蛋白A或蛋白G亲和色谱法纯化抗体Fc的方式。此外，Fcfoi受体也负责将与其结合的Fc融合蛋白转移到新生儿的肠道和成年人的肠上皮腔中，增加抗体Fc的细胞和组织的穿透力(Ghetie and Ward, Annu. Rev. Immunol.，2000，18 :739-766 ；Yoshida et al.， Immunity,2004,20(6) :769-783)。
人Fcy的突变研究过程中，已经对结合Fcfoi重要的一些残基进行了研究，结果表明一些氨基酸的突变能明显的增加血清半衰期。Hinton等在人Fc Yl中逐一地将三个残基突变成了另外19种常见的氨基酸。他们发现一些点突变的双重突变体增加了 FcRn结合亲和力，其中T250Q/M428L位点的双突变能显著提高Fc与Fcfoi的亲和力效果，进而明显提高在体内的半衰期。另外，Henry B. Lowman等通过突变IgG-Fc的T307Q/ N434A位点，同样能明显的增强体内血清半衰期。这些实验都通过猴的体内药物代谢实验得到了证实。另外，基于增加Fcfoi亲和力的突变还可以增加融合蛋白或抗体的跨细胞作用(Transcytosis)和组织的通透性，增加体内组织系统对药物的暴露程度，能最大限度的发挥药效作用(Hinton et al. ,2004, J. Biol. Chem. 279(8) :6213-6216 ；Henry B. Lowman et al. , Cancer Research. 2010,70 (8) :3269-3277 ;Y Zheng et al, Clinical Pharmacology&Therapeutics. 2010,89 (2)，283-290)。发明内容
本发明涉及预防和治疗I型和II型糖尿病的融合蛋白和生产方法。本发明的组合物包含新的融合蛋白及其突变体。该融合蛋白含有与IgG重链恒定(Fe)区融合的hsulin mimetic peptides (IMP)分子或者其类似物或片段。该IgG为人源的，可以选自IgGl、IgG2、 IgG3或IgG4。本发明的融合蛋白在本文中被称为IMP/1gG-Fc或IMP/1gG-Fc (T250Q/M428L ； QL)，或者 IMP/IgG-Fc 或 IMP/IgG-Fc (T307Q/N434A ；QA)。
在本发明的其他方面，该融合蛋白的突变体为IMP/IgG-Fc (T250Q/M428L)，含有 T250Q/M428L 一个或者两个突变；也可以为IMP/IgG-Fc (T307Q/N434A ；QA)，包含一个或两个突变，或者上述突变的组合。
本发明的融合蛋白及其突变体在受试者中对I型和II型糖尿病的治疗有效。同样地，本发明提供了用于治疗受试者的I型和II型糖尿病的方法，其中如果需要给受试者使用所述的融合蛋白及其突变体。
本发明还提供了使用哺乳动物表达和细菌培养系统，制备本发明的融合蛋白IMP/ IgG-Fc 和 IMP/IgG-Fc (T250Q/M^8L)和 / 或 IMP/IgG-Fc (T307Q/N434A)的新方法。在这两种系统中，培养细胞克隆以制备包括IMP/IgG-Fc和IMP/IgG-Fc (T250Q/M^8L)和/或 IMP/IgG-Fc (T307Q/N434A)的融合蛋白以及有效延长体内半衰期的突变体型，例如但不限于IMP/IgG-Fc (QL)和IMP/IgG-Fc (QA)。增强对Fcfoi受体的结合和延长体内血清滞留时间。
本发明的二价IMP/IgG-Fc 或 IMP/IgG-Fc (QL)或 IMP/IgG-Fc (QA)融合蛋白具有独特的特点
1)增加了 IMP的体内循环半衰期T1/2，尤其是IgG-Fc突变体^lL)或(QA)更能进一步增加体内半衰期；
2)与胰岛素比较，具有更低的刺激细胞分裂能力，更安全，可以避免胰岛素抵抗；
3)融合蛋白形成而二体结构更加的稳定，同时与IgG-Fc突变体^lL)或(QA)融合增加药物跨细胞作用(Transcytosis)和组织的通透性，增加药物在体内组织的暴露；
4)通过生物工程方法生产，有利于获得生物活性更高的蛋白。用于大规模制备的简便的一步法提纯。可以将本发明的融合蛋白按需要以多种形式提供给受试者。
本发明的一方面提供了一种用于受试者控制血糖平衡的IMP融合蛋白。
本发明的一方面提供了一种用于控制受试者血糖浓度的IMP融合蛋白。
本发明的一方面提供了一种IMP融合蛋白，其通过有别于胰岛素的方式，激活胰岛素受体，促进血糖代谢。
根据本发明的一个方面，本发明的融合蛋白避免了受试者的胰岛素抵抗，增强葡萄糖耐受性并降低空腹血糖水平。
本发明的一方面提供了一种融合蛋白，该融合蛋白含有IMP多肽或类似物、或者其突变体或其片段或者IgG多肽。
本发明的一方面提供了一种异源性融合蛋白，该融合蛋白含有与IgG多肽融合的 IMP多肽或其变异体，其中所述的IgG。
根据本发明的一方面，所述IgG是人源。
根据本发明的一方面，所述IgG Fc是人IgGl、IgG2或IgG4。
根据本发明的一方面，所述IgG是人IgG2。
根据本发明的一方面，所述IgG-Fc是人源IgGl-Fc、IgG2_Fc或IgG4_Fc的杂合体。
根据本发明的一方面，所述IMP多肽选自由胰岛素模拟肽 (SLEEEWAQIECEVYGRGCPSE SFYDWFERQL)及其片段和衍生物组成的组。
根据本发明的一方面，所述IMP 为 SLEEEWAQIECEVYGRGCPSESFYDWFERQL。
根据本发明的一方面，所述衍生物含有大约70%至大约95%与IMPGequence ID NO. 1)序列相同的序列的多肽。
根据本发明的一方面，所述IgG片段含有至少5个氨基酸至多达250个氨基酸。
根据本发明的一方面，所述IgG含有IgG的Fc部分或者Fc部分的片段或衍生物。
本发明一方面提供了一种编码所述异源性融合蛋白的氨基酸序列。
本发明一方面提供了一种含有所述融合蛋白的氨基酸序列的经密码子优化载体。
本发明一方面提供了一种经含有所述异源性融合蛋白的氨基酸序列经密码子偏好优化的载体转染的宿主细胞。
本发明的一方面提供了一种药用组合物，所述组合物含有上述异源性融合蛋白或者包含以可药用载体负载的异源性融合蛋白的氨基酸序列经密码子偏好优化的载体。
根据本发明的一方面，所述药用组合物用于治疗I型和II型糖尿病。
根据本发明的一方面，所述药用组合物可通过选自由局部施用、口服、气雾方式、 腹膜内注射、静脉注射或肌肉注射组成的组的方式施用。
根据本发明的一方面，所述药用组合物用于受治疗者的I型和II型糖尿病的治疗，所述组合物含有包含与IgG多肽融合的IMP多肽或者其衍生物或活性片段的异源性融合蛋白ο
本发明一方面提供了一种治疗受试者的I型和/或II型糖尿病的方法，所述方法包括施用治疗有效量的融合蛋白或所述组合物或所述载体。
本发明一方面提供了所述异源性融合蛋白用于治疗或预防I型和/或II型糖尿病的药物中的用途。
根据本发明的一方面，所述IgG选自由人IgGl、IgG2、IgG3和IgG4组成的组。
本发明的其他特点和优越性可通过以下详细的描述体现。但是，应该理解的是，仅以示例的方式给出详细描述和具体实施例以表明本发明的实施方案，这是因为对于本领域熟练技术人员从所述的详细描述中在本发明的实质和范围内多种改变和改良是显而易见的。


参考附图从以下详细描述中将进一步理解本发明，其中
图1 构建编码 IMP/IgG-Fc、IMP/IgG-Fc (QL)和 IMP/IgG-Fc (QA)的表达质粒。IA 显示运用PCR技术，分别将IMP和IgG-Fc的序列从各自的模板中扩增，接下来以上述的PCR 产物为模板，用引物1和4扩增出IMP/IgG-Fc序列。然后，将编码IMP/IgG-Fc融合蛋白的 cDNA连接到表达载体pcDNA3. 1的BmHI和EcoRV位点之间。利用核苷酸位点定向突变方法， 产生编码IMP/IgG-Fc (QL)或IMP/IgG-Fc (QA)融合蛋白的cDNA，使用与上述相同的方法将 IMP/IgG-Fc (QL)或IMP/IgG-Fc (QA)克隆入pcDNA3. 1表达载体。IB中显示由活性IMP分子和包含人IgG4重链恒定区(铰链、CH2和CH3部分)的IgG-Fc组成的IMP/IgG-Fc融合蛋白的图示。这些蛋白质表达时均以同型二聚体的形式分泌，形成如图所示的空间结构。
图2 显示的是 IMP/IgG-Fc、IMP/IgG-Fc (QL)或 IMP/IgG-Fc (QA)融合蛋白在CHO-S细胞中的表达和检测。用编码IgG-Fc, IMP/IgG-Fc、IMP/IgG-Fc (QL)或IMP/ IgG-Fc(QA)蛋白的质粒载体融合转染CHO-S细胞，转染4 后吸取上清液，用A蛋白琼脂糖凝股纯化融合蛋白。分别进行还原(reduced)和非还原(Non-reduced)的SDS-PAGE分析，用考马斯亮蓝(Comasie Blue)染色。然后，将SDS-PAGE胶转移到醋酸纤维素膜上，进行Western blot分析。上述膜用抗小鼠抗体(1 5000)探测，并用ECL显影。结果显示 IMP/IgG-Fc、IMP/IgG-Fc (QL)或 IMP/IgG-Fc (QA)约为 70KDa 的同源二聚体，与理论分子量一致。其中，泳道 1、2、3 分别是 IMP/IgG-Fc、IMP/IgG-Fc(QL)或 IMP/IgG-Fc (QA)还原状态的 SDS-PAGE0 泳道 5、6、7 为 IMP/IgG-Fc,IMP/IgG-Fc (QL)或 IMP/IgG-Fc (QA)融合蛋白的非还原状态的SDS-PAGE。
图3 显示的是IMP融合蛋白在CHO-S细胞中表达的RT-PCR检测。将生长状态较好的CHO-S细胞植入150mm2培养皿中培养，于次日用80 μ g构建好的表达质粒DNA转染。装染后用G418抗生素进行筛选，并在转染4 后使用总RNA提取试剂盒分离总RNA。并用通过反转录获得的cDNA为模板进行RT-PCR分析。图3显示的是用Goldenview显色的在1 % 琼脂糖凝胶上的RT-PCR产物。其中，泳道1 6依次为对照、DL2000Maker、空白、IMP-Fc、 IMP-Fc (QA)、IgG-Fc0
图4 显示的是 IMP/IgG-Fc，IMP/IgG-Fc (QL)或 IMP/IgG_Fc (QA)融合蛋白对患有 II型糖尿病的db/db模型鼠的作用。4周和/或6周龄的db/db小鼠通过肌肉注射IMP/ IgG-Fc或IMP/IgG-Fc (QL)或IMP/IgG-Fc (QA)融合蛋白。收集注射前的和注射后2、12、16 周的血清。活性IMP水平通过IMP Elisa试剂盒检测(数据未显示)。首次注射后2天检测两组小鼠的空腹血糖水平(n = 5 6，ρ < 0. 001)。
图5 显示的是体内表达 IMP/IgG-Fc，IMP/IgG-Fc (QL)或 IMP/IgG-Fc (QA)融合蛋白对链脲霉素诱导的胰岛素缺陷的I型糖尿病模型中的作用。对CDl模型鼠，每只鼠肌肉注射 IMP/IgG-Fc、IMP/IgG-Fc (QL)或 IMP/IgG-Fc (QA)融合蛋白 InM。注射融合蛋白前 2 天， 受试鼠受强化注射STZ(55mg/kg，腹膜内注射)，并于当日起接受连续5日每日注射。注射 STZ数天后，注射的对照受试鼠血糖增加显著(彡17mM)，但IMP/IgG-Fc，IMP/IgG-Fc (QL) 或IMP/IgG-Fc (QA)处理的受试鼠被保护并表现出低的明显糖尿病的发生频率。
具体实施方式
本发明提供了预防和治疗糖尿病的融合蛋白和方法。该融合蛋白通过胰岛素受体帮助调节血糖水平。当对个体施用有效量的融合蛋白时，本发明的融合蛋白通过激活胰岛素受体及相关信号通路，治疗和预防糖尿病的发生。
在一个实施方案中，本发明的组合物和方法延长了 IMP的循环半衰期，增强了其功效。这是通过提供含有活性IMP和IgG重链恒定区的融合蛋白(IMP/IgG-Fc)而实现的。所述IMP肽是天然自身具有实施例的。I gG是人源。人源I gG可以选自I gG 1、I gG2和I gG4。IMP 多肽可以是本身序列或衍生物的片段。IMP多肽可以是SLEEEWAQIECEVYGRGCPSESFYDWFE RQL氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本发明的融合蛋白含有IMP多肽、IMP片段或衍生物、或其衍生物的片段或IgG-Fc(QL)和IgG-Fc(QA)突变体片段。
本发明还提供了编码本发明的可分泌的融合蛋白的载体，所述融合蛋白包括但不局限于活性IMP和人IgGl/IgG2/IgG4-Fc氨基酸序列，用于哺乳动物表达二价的IMP多肽；以及活性的IMP-IgG Fc (QL)和IgG-Fc(QA)氨基酸序列。本领域技术人员可以在如同在本文实施例中描述的载体中或是以相同的方法容易地制备任何所需的IMP序列。体外细胞系研究结合I型和II型糖尿病模型鼠体内肌肉注射融合蛋白进行治疗，证明重组的人类 IMP融合蛋白IMP/IgG-Fc，IMP/IgG-Fc (QL)和IMP-IgG-Fc(QA)的生物学特性以及有效性。 这种治疗方法在严重的I型和II型糖尿病模型中证明有效。通过实验证明在人类和大型动物中有效，而通过肌肉注射融合蛋白在啮齿类动物中证明效率较低。总之，本发明为用蛋白质治疗和基因治疗在哺乳类中预防和治疗I型和II型糖尿病提供了一种新的方法。
本发明的融合蛋白可以是IMP片段，其与多肽有至少60%或更多的相同序列。 所述序列可以与已知形式的IMP多肽有至少70% ,80^^90^^95%或更多的相同序列； 这些已知形式包括类似物、其衍生物和其片段。例如这些形式的序列已经在美国专利 20070775642中公开。本发明还包括将上述的组合物用于预防和治疗糖尿病的药物中的用途，例如I型和II型糖尿病。本发明还包括用于上述所有用途的一种药用组合物，例如预防性的组合物。
融合蛋白的构建是融合IMP和IgG-Fc分子组成一种新的分子，该分子能促进IMP的功效并结合有IgG-Fc的优点，即增加IMP的体内半衰期和减少促进细胞分裂的风险，避免胰岛素抵抗。本发明提供了结合了 IgG-Fc突变体的融合蛋白，所述融合蛋白，例如融合蛋白结合IMP和IgG-Fc分子形成新分子，该新分子具有IMP类似的功效并具备IgG-Fc分子的优点。同样，IMP与IgG Fc(QL)或IgG-Fc(QA)形成的新分子，其具有所述的促进IMP 功效和IgG-Fc(QL)或IgG-Fc(QA)分子的优点，增强Fc与Fcfoi的亲和力，进一步增加体内的半衰期。
本发明的范围包括产生其化学等价物或化学上相似的氨基酸序列而作的变化。与 IMP序列具有相同序列的IgG-Fc融合多肽在本发明的范围内，并经试验确定适用于本发明的方法中。美国专利(申请号20070775642，完整引入作为参考)描述了许多胰岛素模拟肽。本发明中的多种多肽可自然出现变异体，也可以经过突变，或可以经过合成，例如通过如定点突变的蛋白质工程技术，该技术是本领域公知的氨基酸替换技术。比如一个疏水残基像甘氨酸可以被另一个疏水残基像丙氨酸替换，而丙氨酸残基又可以被疏水性更强的亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸替换。带负电荷的氨基酸如天冬氨酸可被谷氨酸替换，带正电荷的氨基酸如赖氨酸可被另一带正电荷的氨基酸精氨酸替换。
所以，本发明包括在氨基酸序列上有保留的变动或替换的IgG-Fc融合多肽。有保留的替换插入一个或多个氨基酸，其保留被替换氨基酸相同的化学特性。本发明包括有保守型的替代序列，经过保守性替换后不破坏原有序列的活性。本发明预期IgG-Fc融合多肽含有1或多个D-氨基酸。预期N-末端有一个或多个氨基酸乙酰化的多肽。本领域技术人员可以理解能用多种技术来构建多肽类似物，该类似物具有所需的与本发明的相应多肽化合物相同或类似的性质，但在溶解度、稳定性和/或对水解和酶解的敏感性方面具有更好的活性。例如,Morgan 和 Gainor (Ann. R 印.Med. Chem.，24 :243-252，1989)中所述。多肽类似物的实施例在美国专利No. 5，643，873中描述。其他描述如何制备和应用多肽类似物的专利包括(例如 US5, 786，322,5, 753，226,5, 654，276,5, 643，873,5, 683，983,5, 677，280、 5/767，075,5, 668，110,5, 763，571,5, 672，584，所有上述文献在此完整引入作为参考)。也可以根据其他本领域已知的技术制备本发明的多肽类似物。例如，通过用化学上转换氢基团为如羟基或氨基的另一种基团来改变侧基的因子来处理本发明的IMP-Fc融合多肽。类似物优选包括完全是氨基酸的组成的序列或是包括氨基酸和改性的氨基酸或其他有机分子的杂交物。本发明同样包括杂交物和IMP-Fc融合多肽，例如，其中一个核苷酸序列与另一个序列结合。
本发明也包括本发明的IMP-Fc融合多肽的具有相同活性的片断，还包括融合多肽的可以作为检验多肽性质和活性的研究工具的片断。这种多肽优选由至少5个氨基酸组成。在优选的实施方案中，它们可以由6 10、11 15、16 25J6 50、51 75、76 100或101 250个氨基酸组成。片断可以包含有一个或多个氨基酸缺失的序列，例如，化合物序列中的N末端氨基酸。
本发明包括带突变的融合蛋白，这些氨基酸突变可以发生在融合蛋白无活性区部分，这些氨基酸突变也可以发生在活性区部分从而增加或减少了融合蛋白的活性。在本发明中，如美国专利WO. 05/00092(在此完整引入作为参考)中所述，可以通过本领域技术人员公知的技术修饰融合蛋白的IgG-Fc部分以改变(增加或减少)免疫原性 (immunogenicity)或者效应器功能(effector function)。
本发明的融合蛋白可以单独有效使用，但也可以在药物组合物中与其他如药用载体的成分一起使用。可以结合本发明的融合蛋白，即可将超过一种类型的可溶形式用于如人类或是动物的受治疗对象，以预防或治疗糖尿病。
本发明的融合蛋白作为药物应用于人类或动物可以通过多种途径，并不局限于局部施用，如口服、喷雾、气管内灌输、腹膜内注射、静脉注射、肌肉注射和基因疗法。施用剂量取决于患者需要、期望取得的效果和施用途径。例如人类的施用量可以为2nmol/kg体重或是0.02 lOOnmol/kg体重。当使用基因治疗时，人的DNA注射浓度可以为1 μ g/kg体重或是0. 1 100yg/kg体重。用体内脂质体或是病毒转运载体可以将融合蛋白导入细胞。 适用于本发明的多种转运载体对本领域技术人员是公知的。本发明的组合物可以每日、每周或是遵医嘱施用持续需要的时间。
本发明的药用组合物可用公知的制备能施用给患者的可药用载体的方法制备，从而使有效量的核苷酸或多肽分子与可药用的载体结合形成混合物。这些适合的载体，在例如雷明顿制药学(Remington' s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa.，USA)中已有阐述。在此基础上，所述药用组合物可以包括与一种或多种可药用的载体或稀释液相结合、并存在于具适当PH值并与生理液体等渗的缓冲液中的活性化合物或物质，例如复合核酸分子、多肽分子或融合蛋。结合活性分子和载体或将两者与稀释剂结合的方法对本领域技术人员是公知的。所述组合物可包括用于运送活性化合物到组织内特定部位的靶向制剂(targeting agent) 0
本发明的组合物可以与已知的I型和/或II型糖尿病的治疗措施如使用降糖药物或结合胰岛素共同进行治疗。例如，治疗糖尿病的药物可以包括Vict0Za、 Actos、AmaryK avandia、DiaBeta、Diabinese、Dymelor、Glucophage、GlucophageXR、 GlucotroK GlucotrolXL、Glucovance、Glynase、PresTabΛ Glyset、Micronase、Orinase、 Pandin、Precose、Starlix 禾口 Tolinase。例如，适合的姨岛素包括Aspart、Insulin、 Glargine (Lantus)、Lispro (Humalog)、NPH 禾口 Ultralente 等。
本发明适用于任何需要此类治疗的个体。这些个体有可能发展成糖尿病、或新近诊断为糖尿病的患者或是已经诊断为糖尿病的患者。本发明与预防和治疗如本文所述的I 型和II型糖尿病相关。例如，这样的个体可以为肥胖的人或有糖尿病遗传史但尚未发病的人、或新近诊断为或已经诊断为糖尿病的人。世界卫生组织(WHO)根据身体质量指数(BMI) 定义肥胖。BMI是用Kg体重除以身高米数的平方得来。为18. 5 25则体重正常。个体的 BMI为25 30则为超重，等于或超过30则为肥胖。这些个体也可以是血糖高于相同年龄与体重的正常值(正常血糖可以是根据医学参考资料常规测定的)的人，尽管还不至于诊断为糖尿病。这些个体也可以是有糖尿病遗传史但是还没有发展成为糖尿病的人。当血糖值高于普遍认可的正常范围时即可诊断为糖尿病。
本发明还提供了新的编码融合蛋白的质粒，该融合蛋白编码含有通过应用重叠 PCR (聚合酶链反应)得到的人IMP和人IgG-Fc (图1)。图例显示IgG-Fc区域含有IgG4 恒定重链(包括饺链、CH2和CH3)。
本发明还提供了可产生先导序列并导入载体使融合蛋白可以表达后分泌到细胞外培养液环境中去的方法。如图显示，一段IgK分泌先导肽序列与IMP序列融合引导合成的多肽分泌到培养液中。在本发明的实施例中，一段鼠免疫球蛋白K(MUS IGK)先导肽序列(MVSTPEFLVFL LFWIPASRG)与IMP及IgG-Fc序列融合引导合成的多肽分泌到培养液中。 每一个实施例中，这一战略保证了在分泌过程中在切除分泌先导肽之后将使产生的IMP与 IgG-Fc融合蛋白N端的活性组氨酸残基融合。有代表性的IMP/IgG-Fc见图2。这种方法能达到
1)由于Fc融合蛋白以均一的二聚体的形式分泌，IMP-Fc融合蛋白半衰期长并且， 其较高的配体亲和性从而使融合蛋白具有更高的效价。
2)由于大量的胰岛素受体在细胞表面以二聚体的前体形式存在，因而增强了 IMP 多肽的药效。
3)简化了纯化过程。利用ftOtein A凝胶可以一步完成提纯，利于融合蛋白的分离纯化。
本专利还公开了使用哺乳动物表达系统证明了上述融合蛋白的新载体的表达。为评估载体表达和分泌IMP/IgG-Fc融合蛋白的能力，将质粒载体转染至CHO-S细胞中。转染后48h，从表达的转染细胞中提取总RNA，用RT-PCR评估融合蛋白的表达情况。用基因特异性引物(图幻检测IMP-Fc融合蛋白和IgG-Fc对照蛋白在转录水平上的表达。而非转染样品没有检测到上述蛋白在基因转录水平上的表达。
用Western免疫印迹法和抗鼠抗体还分析了转染的中国仓鼠卵巢细胞CHO-S细胞裂解物和细胞培养液以确定融合蛋白在翻译水平上的表达。如图2A中所示，在培养液和细胞裂解物检测Fc融合蛋白。可以通过RT-PCR逆转录聚合酶链式反应和Western免疫印迹法来检测融合蛋白。在条件培养液和细胞裂解物中同时检测融合蛋白表明融合蛋白已经在哺乳动物细胞中合成并分泌。CHO-S细胞系分别瞬时转染了递增量的IMP/IgG-Fc质粒和 IMP-Fc-only质粒，转染后48h收集细胞培养液。从50ml培养液(接种浓度约1. 25 X IO5 个细胞/ml，2天静止培养)利用ftOtein A凝胶一步纯化融合蛋白(Jungbauer等人，J Chromatogr. 1989 ；46 =257-268)得到约300 μ g融合蛋白。样品再分别经还原和非还原的 2种凝胶电泳分离并经考马斯亮兰染色分别检测到了一个约35KDa或约70KDa的条带(图 2)，表明二聚体IMP/IgG-Fc融合蛋白以天然状态存在。
在一个实施方案中，显示的是IMP/IgG-Fc，IMP/IgG-Fc (QL)和 IMP/IgG-Fc (QA)和在预防和治疗I型和II型糖尿病中有效，用于实施例中，1.前期糖尿病db/db鼠作为II型糖尿病的模型；2.由链脲霉素(STZ)诱导的I型缺乏胰岛素的鼠作为I型糖尿病模型。Db/ db小鼠缺乏功能性的瘦素受体，因此形成肥胖、高胰岛素症(hyperinsulincmia)并在4到 6周龄时出现葡萄糖不耐受，在8周龄时出现明显的糖尿病。因此这些小鼠被广泛应用并被认为是II型糖尿病的模型。通过低剂量，多次用药，使用链脲霉素(STZ)诱导缺乏胰岛素的小鼠。链脲霉素可以特异性地破坏细胞，伴随T-细胞介导的浸润。因此这些小鼠被被广泛应用并被认为是模拟个体I型糖尿病的动物模式。目前可以获得并能应用于本发明的其它小鼠糖尿病模型还有高脂饮食诱导的胰岛素抵抗的小鼠模型；这种小鼠因过度摄入脂肪导致体内脂肪过量沉积，因而形成肥胖，具胰岛素抗性，和葡萄糖的不耐受性。另一种动物模型是非肥胖糖尿病(NOD)小鼠。这些小鼠是很好的自体免疫型糖尿病(I型糖尿病)模型，其中胰岛抗原活性了 T-细胞浸润胰岛并杀死胰岛细胞，引起炎症过程使胰岛细胞死亡(Anderson 禾口 Bluestone, 2005)。
通过体外注射治疗途径施用IMP/IgG-Fc，IMP/IgG-Fc (QL)或 IMP/IgG-Fc (QA)的在预防和治疗I型和II型糖尿病中有效。编码本发明的任意融合蛋白例如IMP/IgG-Fc， IMP/IgG-Fc (QL)和IMP/IgG-Fc (QA)分子用于治疗是有效的。通过融合蛋白注射和对4周龄db/db受试鼠注射施用上述的融合蛋白。所有的受试鼠中，在第一次注射后1周进行第二次注射，并监控受试鼠糖尿病的进展情况。遗传性缺乏瘦素受体的db/db鼠是啮齿类的 II型糖尿病模型(Leiter,FASEB J. 1989 ；3(11) :2231-2241)。如上所示，同时通过融合蛋白治疗途径用IMP/IgG-Fc处理的年龄匹配的鼠在16周龄时(注射后1周)显示出血糖量正常，而对照组小鼠空腹血糖(FBG)水平则高出了正常范围(图5)。这些结果表明用IMP/ IgG-Fc的治疗可以防止db/db鼠发生糖尿病。在表达IMP/IgG-Fc的db/db受试鼠中没有糖尿病的发生。
通过肌肉注射，将IMP/IgG-Fc，IMP/IgG-Fc (QL)和 IMP/IgG-Fc (QA)分别被投送到 CDl受试鼠中。在注射融合蛋白的同时，对小鼠进行了一次后续注射，并开始连续5天每天注射STZ(55mg/kg，i. p.)。结果发现，IgG-Fc对照小鼠的血糖浓度显著上升，几天后血糖浓度达到了糖尿病的水平(17nM)，但是 IMP/IgG-Fc，IMP/IgG-Fc (QL)或 IMP/IgG-Fc (QA)小鼠受到保护并显现出明显糖尿病的低发生率(图4)。
基于IgG-Fc的药物有许多优点。因为融合蛋白能够形成70KDa的二聚体的形式，并不会被肾脏在短时间内清除，因此具有实质上更长的半衰期(Larrick and Fry, Hum Antibodies Hybridomas. 1991 ；2 (4) :172-189 ；Weir ^A, Biochem Soc Trans. 2002 ； 30(4) :512-516)。因此，大的IMP/IgG-Fc同型二聚体融合蛋白较天然IMP半衰期增长。由于一些酶更容易降解较小的多肽(Hupe-Sodmann 等人，Regul Pept. 1995 ；58(3). 149-156)， 而分子量较大的IMP/IgG-Fc不容易被降解。而且IMP/IgG-Fc 二聚体可以增加配体的亲和性，通过预先形成的胰岛素受体二聚体及多聚体(George等人，Nat Rev Drug Discov. 2002 ； (10) :808-820 ；Dupuis 等 K, Brain Res Mol Brain Res. 1999 ；67(1) 107-123)增强细胞内信号传导，因此以同型二聚体形式存在的IMP-融合蛋白有更多潜力， 结合更多的胰岛素受体。
IMP/IgG-Fc融合蛋白在体内有降血糖的作用已在由肌肉注射进的db/db小鼠中得到了证明。这种方法具有在持续数周的时间里连续释放融合蛋白进入血液循环中的优点。肌肉注射IMP/IgG-Fc蛋白db/db小鼠中，两周以后已经可以检测到在血液循环中的 IMP融合蛋白，但是作为对照的只注射IgG-Fc蛋白的小鼠中却检测不到IMP融合蛋白。
Db/db受试鼠作为重症II型糖尿病模型是因为它在瘦素信号传导途径方面存在缺陷(Herberg and Coleman, Metabolism. 1977 ；26(1) :59-99 ；Chen 等人，Cell. 1996 ； 84(3) :491-495)。融合蛋白激活胰岛素受体导致的血糖水平实现正常。有可能血糖的正常化更多地是受到融合蛋白对胰岛素受体的激活，进而增加了体内血糖的代谢水平。另外，尽管我们没有看到一些例子中对啮齿动物模型用天然IMP治疗观察到的降低体重的作用(Turton 等人，Nature. 1996 ；379 (6560) :69-72)。我们也没有观察到 IMP/IgG-Fc 对动物有厌食的情况发生(Kim等人，Diabetes. 2003 ；52 (3) :751-759)尽管长时间而有效的胰岛素受体激动剂IMP的处理改变了肥胖症小鼠的空腹血糖水平(Wang和Brubaker， Diabetologia. 2002 ；45 (9) :1263-1273) 0但是体重和外围胰岛素敏感性依然没有改变 (Wang 和 Brubaker，Diabetologia. 2002 ；45 (9) :1263_1273)。这个发现更进一步支持了仅有胰岛素抵抗不足以导致II型糖尿病的发生，只有当β细胞功能失常时才会发生II型糖尿病(Weyer 等人，J Clin Invest. 1999 ； 104(6) :787-794 ；Weyer A, Diabetes. 1999 ； 48(11) =2197-2203)的厌食效果取决于对中枢神经系统脑部多个区域的作用(khick等人，Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2003 ；284(6) :R1427_R1435)融合蛋白穿透血脑屏障的能力还需要进一步的探究。
肌肉注射融合蛋白并结合体内电转移已被证明是有效而安全的方法。这种方法已被广泛使用，并已经用于细胞因子、肽类激素、可溶性受体以及许多膜结合蛋白或细胞质蛋白。确实如此，这种方法在系统性地注射诸如IMP/IgG-Fc融合蛋白这类蛋白质类调节因子方面特别有用。IgG融合技术的优点是在试验室可以通过简单的一步程序得到试验室规模量的IMP/IgG-Fc融合蛋白。頂P细菌表达检测结果表明细菌表达系统的表达效率要低于哺乳动物细胞表达系统的表达效率，这可能归结于在大肠杆菌中表达较CHO-S细胞表达的错误折叠(misfold)的蛋白质。虽然尺Rosetta garni 2细菌细胞表达的正确折叠和功能化蛋白比起其他细菌系已大大提高(Pnnz等人，J Biol Chem. 1997 ；272 (25) :15661-15667)这种提高是通过增加细菌细胞质体中蛋白二硫健的形成并提供大肠杆菌系统中缺乏的特异密码子的 tRNAs 实现(Kurland 和 Gallant，Curr Opin Biotechnol. 1996 ；7 (5) 489-493)。
总之，本发明是IMP(通过噬菌体展示技术获得的胰岛素受体激动剂)与IgG-Fc 及其突变体融合形成IMP/IgG-Fc以增加半衰期、增强在体内活性并减少免疫原性IMP/ IgG-Fc融合蛋白以天然二价的形式存在。在本发明的一个实施方案中，IMP/IgG-Fc融合蛋白可以直接通过注射施用。用鼠糖尿病模型体内试验表明，可以通过融合蛋白的注射施用， 这种方法可以有效控制体内的血糖水平，避免胰岛素抵抗的发生；在II型糖尿病db/db鼠模型证明可以治疗糖尿病。同时，通过恒河猴的药物代谢实验进一步证实IMP/IgG-Fc (QL) 和IMP/IgG-Fc (QA)比IMP/IgG-Fc具有更长的体内半衰期。
上述公开的内容对本发明进行了大体的描述。通过参考下列具体实施例对本发明做更全面的理解。这些实施例仅仅是为了进一步的说明，而不是为了限定本发明的范围。换言之，一些形式上的变异或替换是用作达意的考量。因此，在下文例引用的一些特殊的术语旨在达意，而非限制其意的目的。
实施例
实施例1 载体的构建
使用重叠PCR(overlap PCR)构建了含有IMP和IgGl-Fc的编码融合蛋白的载体， IMP/IgG-Fc (QL)和 IMP/IgG-Fc (QA)载体。IgG4_Fc 区含有 IgG4 恒定重链(铰链-CH2-CH3 部分)。将鼠IgK分泌先导肽序列与IMP序列融合以便引导合成的融合蛋白分泌到培养液中。编码IMP/hlgG-Fc融合蛋白的cDNA是化学合成的，并将其连接到编码人IgG4_Fc (铰链、CH2和CH3)的PCR扩增的产物上，然后插入pcDNA3. 1载体的EcoRV和BamHI位点间构建IMP/hIgG-Fc/pcDNA3. 1载体。可分泌的IMP/hlgG-Fc及其突变体融合蛋白含有IgG4恒定重链(铰链-CH2-CH3)。鼠IgK分泌引导肽序列与IMP序列融合引导合成的蛋白分泌到细胞培养液中。该方法确保在分泌过程中，分泌引导肽被切除之后，融合蛋白的IMP的氨基端可以和一个活性组氨酸残基融合。图1显示了分泌的IMP/IgG-Fc融合蛋白的图示。其特点是
1.解决了 IMP半衰期短的问题，因为融合蛋白是以同型二聚体的形式分泌的，在体内具有长的半衰期并由于配体的高度亲和性而达到了高效价(Ozmen等人，J Immunol. 1993,150(7) :2698-2705 ；Kurschner 等人，J Immunol. 1992 ；149(12) 4096-4100 ；Kurschner 等，J Biol Chem. 1992 ；267 (13) :9354-9360)。
2.由于大多数胰岛素受体是在细胞表面预先形成二聚体(George等人，Nat Rev Drug Discov. 2002 ；1(10) :808-820 ；Dupuis等人，Brain Res Mol Brain Res. 1999 ；67(1) 107-123)因而多肽与其受体的结合将更为有效；
3.有利于生产中的提纯过程，可以通过A蛋白葡聚糖凝胶一步纯化(Jimgbauer等人，Chromatogr. 1989 ；476 :257-268)。
使用基因特异性引物和重叠PCR从MP(化学合成，Shenggong, Shanghai, China) cDNA和IgG质粒扩增全长IMP和IgG-Fc cDNA。对于第一轮重叠PCR，使用5 ‘ -GATATCATGG TGAGCACCCCCGAGTTCCTGGTGTTCCTGCTGTTCTGGATCCCCGCCAGCCGGGGCAGCCTGGAGG-3‘和 5 ‘ -T GCTGACCAAGCTCGCCGTCGACCCGCCGCCGCCGTCGCCG-3‘；5' -AGCGGCAGCTGGGCGGCGGCGGCAGGGCG GCGGCGGCAG-3，和 5' -TGATGTGGGTCTTCTCGGACTCGGACTCGGACCCGTTCCCTAAG-3，。在第二轮重叠PCR中使用PCR及产物制备备用IMP/IgG-Fc cDNA。将扩增的产物亚克隆到载体Bam HI 禾卩 Eco RV 位点，使用 5 ‘ -ATGGTGAGCACCCCCGAGTTCCTGGTGTTCCTGCTGTTCTGGATCCCCGCCAG CCGGGGCAGCCTGGAGG-3‘和 5' -TGATGTGGGTCTTCTCGGACTCGGACTCGGACCCGTTCCCTAAG-3，引物。
为构建编码IMP-IgG-Fc 的对照载体，使用 5 ‘ -GGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCG GCAG-3，和 5 ‘ -TGATGTGGGTCTTCTCGGACTCGGACTCGGACCCGTTC-3，，通过 PCR 单独扩增 I gG cDNA并克隆到载体Bam HI和Eco RV位点。用于编码人IgG4_Fc (铰链-CH2-CH3) WcDNA 片段的 PCR 扩增的引物为5 ‘ -GGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAG-3 ’和 5 ‘ -TGATGTGGGT CTTCTCGGACTCGGACTCGGACCCGTTCCCTAAG-3，。载体含有 CMV 直接-早期(immediate-early) 增强子和启动子、单一真核生物转录单元。嘌呤尾和转录终止序列。为使IMP序列分泌，通过PCR于其5’端引入鼠IgK-链信号肽序列。为在细菌中表达IMP/IgG-Fc融合蛋白，融合 cDNA 序列通过 PCR 扩增并亚克隆至 pET32a 载体(Novagen，EMD Bioscience, San Diego, CA)。IgG-Fc (QL)和 IMP/IgG-Fc (QA)表达质粒的构建方法同上，T250Q/M^8L 和 T307Q/ N434A突变位点另外设计两对PCR引物，进行重叠PCR反应，最后获得IMP/IgG-Fc (QL)和 IMP/IgG-Fc (QA)表达质粒(图 1)。
实施例2 IMP/IgG-Fc, IMP/IgG-Fc (QL)和 IMP/IgG-Fc (QA)融合蛋白的 CHO 细胞表达
为了估价载体在表达与分泌IMP/IgG-Fc融合蛋白的能力，构建的融合蛋白载体转染至CHO-S细胞中瞬时表达。转染后48h，自转染细胞中提取总RNA并用RT-PCR评估表达效果。应用基因特异性引物，检测到IMP/IgG-Fc融合蛋白基因在转录水平上的表达和 IgG-Fc对照基因的表达(图2A)。在对照样品中没有检测到转录水平的表达。
用Western免疫印记法和抗鼠抗体检测了转染的CH0-S细胞裂解物和细胞培养液以确定融合蛋白在翻译水平上的表达。如图2B中所示，同时在培养液和细胞裂解物中检测到Fc融合蛋白。融合蛋白在电泳迁移位置大约在35kDa，是在还原的SDS-PAGE条件下融合蛋白单体的分子量。在条件培养液和细胞裂解物中同时检测到融合蛋白表明融合蛋白已经在哺乳动物细中合成并分泌。
在哺乳动物细胞中的表达，是将IMP/1 gG-Fc或I gG-Fc的cDNA通过脂质体(Lipofectamine) 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)转染到 CHO-S 细胞中。其过程是先将密度为每孔2. 5X105个的CHO-S细胞生长在6孔细胞培养板。添加含有4μ gIMP/ IgG-Fc cDNA和10 μ 1转染脂质体的无血清无抗菌素的DMEM(Invitrogen)进行培养。转染他后，转换为全培养液。转染后4 分别收集培养液和细胞。为了大规模地表达IMP/ IgG-Fc融合蛋白，将生长在150mm培养皿内的CHO-S细胞用阳离子转染试剂、聚乙酰亚胺) (Poly (ethyleneimine) (PEI，25kDa)和 80yg 相关。cDNA 转染。用 150Mm Nacl 分别稀释 DNA和PEI，混合后培养20分钟。然后将DNA/PEI复合物加到细胞中，并在无血清无抗菌素的培养液中培养他。以加有10% FBS和P/S的DMEM替换培养液。该方法的转染率可高达 85%。
为建立稳定表达IMP/IgG-Fc的CHO-S细胞，将在6孔细胞培养板(2. 5 X IO5个细胞/孔)上生长的细胞用4 μ g线性化的IMP/IgG-Fc或IgG-Fc转染。转染24h后，细胞在含有G418(500y g/ml)的DMEM培养液分裂和培养，以筛选那些已经将重组质粒稳定整合到其基因组内的细胞。培养过程中，每3天换培养液一次直至细胞克隆形成。分离单克隆细胞并扩展成稳定的细胞系并将这些细胞系在M孔板上生长的组织培养的上清液用SDS-PAGE 或Elisa检测融合蛋白。选择能大量分泌融合蛋白，且传代稳定的细胞用作以后的特性分析。
实施例3 从哺乳动物细胞培养液中纯化IMP/IgG-Fc，IMP/IgG-Fc (QL)和IMP/ IgG-Fc (QA)融合蛋白
为进行小规模的纯化，将从转染细胞收集的培养液(通常为6孔培养板中每孔取 2. 5ml)加入用含IOOmM Tris pH值8. 0和150mM Nacl的缓冲液预冲洗的70 μ 1满体积 (packed volume)。A 蛋白的葡聚糖凝胶快速洗脱树脂(Amersham-Pharmacia，Piscataway， NJ)中。在4°C下培养过夜后，以Tris缓冲液冲洗，然后以30μ1含SDS的样品缓冲液直接将蛋白从树脂上洗脱。
为获得大量的融合蛋白，应用A蛋白葡聚糖凝胶柱可以进行中规模的蛋白纯化。50ml的柱体积可以纯化15cm培养皿中生长的转染IMP/lgG-Fc，IMP/IgG-Fc (QL) 和IMP/IgG-Fc (QA)融合载体的CHO-S细胞的条件培养液。收集细胞转染后48h的50ml DMEM培养液，或是收集稳定表达融合蛋白的细胞，将其加入A蛋白葡聚糖凝胶ImL满体积，(Amersham-Pharmacia)。加入 1 % TritonX-IOO 在 4°C 下培养过夜。然后用含 1 % "TritonX-lOO的PBS缓冲液洗涤，然后用150mM Nacl洗涤，最后用ImM Nacl氨基乙酸 (pH2. 7)将蛋白从树脂上洗脱。洗脱液立即用Tris缓冲液(pH9. 0)中和并且纯化的蛋白用 PD-10凝胶柱除盐(Amersham-Pharmacia)并用PBS洗脱。如图中所见(图2A)，两步洗脱方法可以将大部分融合蛋白由葡聚糖凝胶柱上洗脱下来。样品的组分经SDS-PAGE溶解并经考马斯亮兰染色显影以评估产率和纯化率(结果显示每ml培养液接种1.25 X IO5细胞培养2d后，融合蛋白得率约为6 μ g/ml)。
实施例4 IMP/IgG-Fc, IMP/IgG-Fc (QL)和 IMP/IgG-Fc (QA)蛋白的细菌表达
在大肠杆菌细胞中表达IMP/IgG-Fc，IMP/IgG-Fc (QL)和 IMP/IgG-Fc (QA)融合蛋白。为了补偿大肠杆菌BL21细胞的密码子偏倚(Codon bias)，使用了可以促进二硫键形成并可额外搭载质粒以表达7个罕见的tRNAs的Rosetta garni 2细胞(Merck，Germany)用 IMP/IgG-Fc/pET32a,IMP/IgG-Fc(QL)pET32a,IMP/IgG-Fc(QA)pET32a 或 IgG_Fc/pET32a 载体(Novagen)转化细菌后，选择并筛选出其中几个克隆以最佳表达融合蛋白。蛋白质的表达是将单一克隆培养在有卡那霉素的50ml的2XYT培养液中于37°C过夜培养。而后将培养液稀释成(1 50)新培养液，直至细胞密度达到0D_读数值0.6后，再在培养液中添加 ImM的IPTG(EMD)3小时以诱导表达。收集细菌并将菌球(Pallet)保存以进行其他步骤。
蛋白质的提取简言之是将离心后的细菌重新悬浮在冰浴的含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Sigrma, St. Louis, MO)的PBS缓冲液后用超声波裂解细胞。添加1% TritonX-IOO 以溶解蛋白，30min后离心(12000g，IOmin)收集含有融合蛋白的上清液。表达的融合蛋白通过A蛋白葡聚糖凝胶纯化并通过SDS-PAGE ；和考马斯亮兰染色分析验证(数据未显示)。 从3L的细菌培养液中可以提纯约120 μ g的IMP/IgG-Fc和Fc-only融合蛋白。在表达IMP 融合蛋白的哺乳动物细胞和细菌中均能观察到IMP水平呈肽剂量依赖性增加。但发现总 IMP在细菌中的表达水平低于在哺乳动物细胞中的水平。
实施例5 =IMP/IgG-Fc, IMP/IgG-Fc (QL)禾Π IMP/IgG-Fc (QA)治疗预防 db/db 小鼠中(II型糖尿病模型)糖尿病的发生
4周龄的雌性db/db鼠(ffeitong lihua, Beijing, China)。年龄背景匹配的对照鼠 CJ57BLKS 和 CDl (Weitong lihua，Bei jing，China)。受试鼠在有控光照(12 光照/12 小时黑暗)和恒温条件下饲养，提供充足的(适宜啮齿类的)食物和饮水。所有程序都依照中国实验动物伦理委员会的守则进行并经实验动物伦理委员会批准。
通过如前所述的肌肉注射法处理糖尿病db/db受试鼠(Prud' homme和Chang， Gene Ther. 1999 ；6 (5) :771-777)。简言之，对麻醉处理的受试鼠胫腓骨肌肉注射了含有 InM的IMP/IgG-Fc融合蛋白的PBS，注射使用有塑料套的27号针头以限制针头注射深度为5mm。每天对其体重和空腹血糖水平进行监测。蛋白注射后2、3、5、7天取空腹条件下的隐静脉血。用Roche公司生产的基础血糖计测量空腹血糖水平，IMP, IMP/IgG-Fc, IMP/ IgG-Fc (QL)和IMP/IgG-Fc (QA)水平的测量如下所述
IMP/IgG-Fc融合蛋白体内的表达量是用本研究机构制作和包被的IMP Elisa试剂盒检测血浆活性IMP含量来进行评估。如图所示，第一次注射2天后，注射IMP/IgG-Fc的受试鼠较注射IgG-Fc的受试鼠血清IMP水平显著高。IMP/IgG-Fc (QL)和IMP/IgG-Fc (QA) 融合蛋白的IMP水平与IMP/IgG-Fc基本一致(图5)。
在试验过程中，两组受试鼠的体重并没有发生显著的变化(未显示)。在注射后第一个月里，两组受试鼠空腹血糖水平也没有显著的差异(未显示)。然而，在注射后1周，注射过IMP/IgG-Fc的受试鼠空腹血糖水平显著低于对照组(P < 0. 05)(图5)。这一结果表明，体内注射的IMP/IgG-Fc，IMP/IgG-Fc (QL)和IMP/IgG-Fc (QA)对db/db受试鼠有降低血糖的功效，其原因很可能是由于激活了胰岛素受体，促进体内的糖类的代谢。
实施例6 IMP/IgG-Fc, IMP/IgG-Fc (QL)和 IMP/IgG-Fc (QA)预防 STZ 诱导的胰岛素缺乏性小鼠I型糖尿病模型中糖尿病的发生
最近的研究结果表明，胰岛素模拟肽(IMP)能够模拟胰岛素调节血糖缓解I型糖尿病(Maja Jensen 等人，J Biol Chem. 2007，282 :35179-35186)。为了确定 IMP/IgG-Fc 融合蛋白对胰岛细胞损伤模型的有效性，我们研究了其对链脲霉素(STZ)诱导的糖尿病⑶1小鼠的作用。分别将编码IMP/IgG-Fc、IgG-Fc或IgG-Fc的融合蛋白(InM/小鼠) 肌肉注射到⑶1受试鼠。注射融合蛋白同时，连续5天注射STZ(55mg/kg，i. p.)结果显示，IgG-Fc对照组血糖显著增加，几天内达到糖尿病的水平(血糖彡17mM)，但是注射IMP/ IgG-Fc或IMP/IgG-Fc (QL)或IMP/IgG_Fc (QA)融合蛋白的受试鼠受到保护显现出明显糖尿病的低发生率(图4)。
实施例7 RT-PCR 化法检测 IMP/IgG-Fc，IMP/IgG-Fc (QL)和 IMP/IgG-Fc (QA)融合蛋白的表达
使用一步法RT-PCR试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)和基因特异性引物检测IgG融合蛋白在转录水平上的表达。为检测IMP/IgG-Fc，IMP/IgG-Fc (QL)和IMP/IgG-Fc (QA)融合蛋白基因表达，提取细胞总RNA IOOng作为模板和添加0. 6 μ M的特异性引物
(SEQ IDNo: 18)
5' -AGCCTGGAGGAGGAGTGGGCCCAGATCGAGTGCGAGGTGTACGGCCGGGGCTGC-3‘
禾口
(SEQ ID No: 19)
5' -TCGAAGATGATGACCAAGATCGCCGTCGAC-3'
同时为检测IgG Fc的表达，使用特异性引物
(SEQ ID No 20)
5 ‘ -GAGAGCAAGTACGGCCCCCCCTGCCCCAGCTGCCCCGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGCCCC-3 ‘ 和
(SEQ ID No 21)
5 ‘ -TCGACGTCGCACTACGTGCTCCGGGACGTGTTGGTGATGTGGGTCTTCTCGGACTCGGACTCGGA CCCGTTC-3‘)
一步 RT-PCR 的条件是 50°C 30min,95°C 5min,40 个循环的 94°C 30min、55°C 30 秒和72 °C 60秒，随后在72°C下进行IOmin的延伸。RT-PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分离，Go Idenview染色检测。
实施例8 SDS-PAGE 和 / 或免疫印迹法检测 IMP/IgG-Fc，IMP/IgG-Fc (QL)和 IMP/ IgG-Fc (QA)融合蛋白
对表达的融合蛋白进行翻译水平上的检测。取小规模提取的溶于SDS上样缓冲液的融合蛋白30μ 1经10% SDS PAGE凝胶电泳分离后转移至醋酸纤维素膜，并用抗鼠抗体 (1 5000，Amersham-Pharmacia)探IlJ,用 ECL Mfi (Amersham-Pharmacia) 30 μ 1 中等规模提取的融合蛋白则经10% SDS PAGE凝胶电泳分离后用考马斯亮兰染色检测。
实验9 药代动力学检测
通过恒河猴药代动力学实验对药物在体内的动力学尤其是半衰期进行检测。选取健康成年恒河猴9只，雌雄各半，皮下注射IMP、IMP/IgG-Fc、IMP/IgG-Fc (QL)和IMP/ IgG-Fc(QA)，后用ELISA法检测血液中药物的浓度。浓度-时间数据经药代动力学参数计算，表明药物消除符合二房室模型，血药浓度-时间曲线及各药代参数见表1。其中，IMP/IgG-Fc注射组，9只恒河猴的平均体内消除半衰期为98士 19.池。平均达峰浓度为对.0士4.2118/1111，平均消除速率为0. 190士0. 026ml/kg/h，药时曲线下面积为4， 915士539yg.h/ml，体内半衰期明显的长于IMP的7士 1.8h。同时IMP/IgG-Fc (QL)能够进一步的延长半衰期至153士41. 5h。
表1 IMP/IgG-Fc的药代动力学参数
最大血清浓度 Cmax(pg/ml)清除率 CL(ml/kg)浓度-时间曲线下面积 AUC(h.pg/ml)清除半衰期 Tl/2(h)IMP30.4 士 4.31.024±0.5213,002士3497 士 1.8IMPAgG-Fc24.0 士 4.20.190±0.0264,915 士 53998 士 19.2IMP/IgG-Fc(QL)28.1 士 2.60.0846±0.021211,491士2870153 士 41.5IMP/IgG-Fc(QA)27.6 士 2.30.0796±0.030112,180±2392169 士 3 8.7
统计学分析所有数据都以平均倌士标准差(mean+SEM)的形式表示。用SAS软件(Statistical Analysis Systems, Cary, NC)进行学生 t 检验或是方差分析(ANOVA)， 用〃 n-1"假设检验(post hoc custom hypotheses test)，以 ρ < 0. 05 表示显著性差异。
序列表
IMP、人 IgGl-Fc、人 IgG2_Fc、人 IgG3_Fc、人 IgGjzFc 及其突变体(QL)和(QA)、鼠 IgK引导序列
<110> 张海涛
<120>胰岛素模拟肽融合蛋白和突变体及其应用
<160>
<210>1
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<310>
<311>2011-11-26
<312>
<400>1
Ser Leu Glu Glu Glu Trp Ala Gln lie Glu Cys Glu Val Tyr Gly
151015
Arg Gly Cys Pro Ser Glu Ser Phe Tyr Asp Trp Phe Glu Arg Gln
16202530
<210>2
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>2
Gly Gly Gly Gly Ser(SEQ ID NO 2)
<210>3
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>3
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO 3)
<210>4
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>4
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO 4)
<210>5
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>5
(GlyGlyGlyGlySer) 4(SEQ ID NO 5)
<210>6
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>6
(GlyGlyGlyGlySer) 5(SEQ ID NO 6)
<210>7
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>7
(GlyGlyGlyGlySer)6(SEQ ID NO 7)
<210>8
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>8
(GlyGlyGlySer) η其中η 是 0，1，2，3，45 或 6。(SEQ ID NO 8)
<210>9
<211>237
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>9
IgGl-Fc(Hinge-CH2-CH3)(SEQ IDMO 9)
Glu Pro Lys SerCysAspLysThrHis ThrCysProProCysPro
151015
Ala Pro Glu LeuLeuGlyGlyProSer ValPheLeuPheProPro
16202530
Lys Pro Lys AspThrLeuMetlieSer ArgThrProGluValThr
31354045
Cys Val Val ValAspValSerHisGlu AspProGluValLysPhe
46505560
Asn Trp Tyr ValAspGlyValGluVal HisAsnAlaLysThrLys
61657075
Pro Arg Glu GluGlnTyrAsnSerThr TyrArgValValSerVal
76808590
Leu Thr Val LeuHisGlnAspTrpLeu AsnGlyLysGluTyrLys
9195100105
Cys Lys Val SerAsnLysAlaLeuPro AlaProlieGluLysThr
106110115120
lie Ser Lys AlaLysGlyGlnProArg GluProGlnValTyrThr
121125130135
Leu Pro Pro SerArgAspGluLeuThr LysAsnGlnValSerLeu
136140145150
Thr Cys Leu ValLysGlyPheTyrPro SerAsplieAlaValGlu
151160165
TrpGluSerAsn GlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThr
171175180
ProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSer
186190195
ThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPhe
201205210
SerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGln
216220225
LeuSerLeuSerPro GlyLys
231235
<210>10
<211>228
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>10
IgG2-Fc(Hinge-CH2-CH3)(SEQ IDNO 10)
GluArgLysCysCysValGluCysProProCysProAla
1510
ValAlaGlyProSerValPheLeuPheProProLysPro
162025
ThrLeuMetlieSerArgThrProGluValThrCysVal
313540
AspValSerHisGluAspProGluValGlnPheAsnTrp
465055
AspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArg
616570
GlnPheAsnSerThrPheArgValValSerValLeuThr
768085
HisGlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLys
9195100
AsnLysGlyLeuProAlaProlieGluLysThrlieSer
106110115
LysGlyGlnProArgGluProGlnValTyrThrLeuPro
121125130
ArgGluGluMetThrLysAsnGlnValSerLeuThrCys
136140145
LysGlyPheTyrProSerAsplieAlaValGluTrpGluSer
151155160
GlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThrThrProProMetLeu
166170175
SerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeuThrValAsp
181185190
SerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCysSerValMet
196200205
GluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSerLeu
211215220
ProGlyLys
226
<210>11
<211>249
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>11
IgG3-Fc(Hinge-CH2-CH3)(SEQIDNO 11)
GluLeuLysThrProLeuGlyAspThrThrHisThrCysPro
1510
CysProGluProLysSerCysAspThrProProProCysPro
162025
CysProAlaProGluLeuLeuGlyGlyProSerValPheLeu
313540
ProProLysProLysAspThrLeuMetlieSerArgThrPro
465055
ValThrCysValValValAspValSerHisGluAspProGlu
616570
GlnPheLysTrpTyrValAspGlyValGluValHisAsnAla
768085
ThrLysProArgGluGluGlnTyrAsnSerThrPheArgVal
9195100
SerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeuAsnGlyLys
106110115
TyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuProAlaProlie
121125130
LysThrlieSerLysThrLysGlyGlnProArgGluProGln
136140145
TyrThrLeuProProSerArgGluGluMetThrLysAsn
151155160
SerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAsp
166170175
ValGluTrpGluSerSerGlyGlnProGluAsnAsnTyr
181185190
ThrProProMetLeuAspSerAspGlySerPhePheLeu
196200205
LysLeuThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsn
211215220
SerCysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnArgPhe
226230235
LysSerLeuSerLeuSerProGlyLys
241245
<210>12
<211>229
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>12
IgG4-Fc(Hinge-CH2-CH3)(SEQID NO 12)
GluSerLysTyrGlyProProCysProSerCysProAla
1510
PheLeuGlyGlyProSerValPheLeuPheProProLys
162025
AspThrLeuMetlieSerArgThrProGluValThrCys
313540
ValAspValSerGlnGluAspProGluValGlnPheAsn
465055
ValAspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysPro
616570
GluGlnPheAsnSerThrTyrArgValValArgValLeu
768085
LeuHisGlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCys
9195100
SerAsnLysGlyLeuProSerSerlieGluLysThrlie
106110115
AlaLysGlyGlnProArgGluProGlnValTyrThrLeuProPro
121125130135
SerGlnGluGluMetThrLysAsnGlnValSerLeuThrCysLeu
136140145150
ValLysGlyPheTyrProSerAsplieAlaValGluTrpGluSer
151155160165
AsnGlyGlnProGluAspAsnTyrLysThrThrProProValLeu
166170175180
AspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerArgLeuThrValAsp
181185190195
LysSerArgTrpGlnGluGlyAsnValPheSerCysSerValMet
196200205210
HisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSerLeu
211215220225
SerLeuGlyLys
226
<210>13
<211>247
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>13
突变 IgGl-Fc (Hinge-OE-CH3)(SEQ IDNO L3)
GluProLysSerCys Asp LysThrHis Thr CysProProCysPro
151015
AlaProGluLeuLeu Gly GlyProSerValPheLeuPheProPro
16202530
LysProLysAspXaal Leu Met lieSer Arg Thr Pro Glu Val Thr
31354045
CysValValValAspValSerHisGluAspProGluValLysPhe
46505560
AsnTrpTyrValAspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLys
61657075
ProArgGluGluGlnTyrAsnSerThrTyrArgValValSerVal
76808590
LeuXaa2 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
9195100105
CysLys ValSer Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
106110115120
lieSerLysAlaLysGlyGlnProArgGluProGlnValTyr Thr
121125130140
LeuProProSerArgAspGluLeuThrLysAsnGlnValSer Leu
141145150155
ThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAsplieAlaVal Glu
156160165170
TrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThrThr Pro
171175180185
ProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLys Leu
190195200205
ThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSer Cys
210215220225
SerValXaa3HisGluAlaLeuHisXaa4 His Tyr Thr Gln Lys Ser
226230235240
LeuSerLeuSerProGlyLys
241245
<210>14
<211>227
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>14
突变 IgG2-Fc(Hinge-CH2-CH;3)(SEQ IDNO 14)
GluArg LysCysCys ValGluCys ProProCysProAlaPro Pro
151015
ValAla GlyProSerValPheLeuPheProProLys Pro Lys Asp
16202530
Xaal Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Va:Thr Cys Val Val Val
31354045
AspValSerHisGluAspProGluValGlnPheAsnTrp Tyr Val
46505560
AspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArg Glu Glu
61657075
GlnPheAsnSerThrPheArgValValSerValLeuXaa2 Val Val
76808590
HisGlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLys Val Ser
9195100105
AsnLysGlyLeuProAlaProlieGlu LysThrlieSerLys Thr
106110115120
LysGlyGlnProArgGluProGlnVal TyrThrLeuProPro Ser
121125130135
ArgGluGluMetThrLysAsnGlnVal SerLeuThrCysLeu Val
136140145150
LysGlyPheTyrProSerAsplieAla ValGluTrpGluSer Asn
151155160165
GlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThr ThrProProMetLeu Asp
166170175180
SerAspGlySerPhePheLeuTyrSer LysLeuThrValAsp Lys
181185190195
SerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPhe SerCysSerValXaa3 His
196200205210
GluAlaLeuHisXaa4 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
211215220225
ProGlyLys
226
<210>15
<211>249
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>15
突变 IgG3-Fc(Hinge-CH2-CH;3)(SEQ ID NO ]L5)
GluLeuLysThrProLeuGlyAspThr ThrHisThrCysPro Arg
151015
CysProGluProLysSerCysAspThr ProProProCysPro Arg
16202530
CysProAlaProGluLeuLeuGly Gly ProSerValPheLeu Phe
31354045
ProProLysProLysAspXaa ]_ Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu
46505560
ValThrCysValValValAsp ValSer HisGluAspProGlu Val
61657075
GlnPheLysTrpTyrValAsp GlyVal GluValHisAsnAla Lys
76808590
ThrLysProArgGluGluGln TyrAsn SerThrPheArgVal ValVal Lys Thr Thr Leu Glu Pro Leu Cys Ser95100105Leu Xaa2 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys GluCys lie Leu ProThrTrpProThrSerLeu110Lys Val 125 Ser Lys 140 Pro 155 Leu 170 Ser 185 Met Leu 200 Val Asp 215Cys GluSer Asn Thr Lys Ser Arg Val Lys Ser Gly Asp Ser Lys SerLys Gly Glu Gly Gln Asp Arg115 Leu 130 Pro 145 Met 160 Tyr 175 Pro Glu190 Gly Ser 205 Trp Gln 220Ala Gln Glu PheVal Xaa3 His Glu Ala Leu His 230235Ser Leu Ser Pro Gly Lys 245120Pro Ala Pro lie Glu 135Arg Glu Pro Gln Val 150Thr Lys Asn Gln Val 165Pro Ser Asp lie Ala 180Asn Asn Tyr Asn Thr 195Phe Phe Leu Tyr Ser 210Gln Gly Asn lie Phe 225Xaa4 Arg Phe Thr Gln 24091 Ser 106 Tyr 121 Lys 136 Tyr 151 Ser 166 Val 181 Thr 196 Lys 211 Ser 226 Lys 241 <210>16 <211>234 <212>PRT <213>人工序列 <220><223>合成构建体 <400>16突变 IgG4-Fc(Hinge-CH2-CH3) (SEQ ID NO :16) Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu 151015Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 16202530Asp Xaal Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 31354045Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 46505560Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 61657075
GluGlnPheAsnSerThrTyrArg
7680
LeuHisGlnAspTrpLeuAsnGly
9195
SerAsnLysGlyLeuProSerSer
106110
AlaLysGlyGlnProArgGluPro
125130
SerGlnGluGluMetThrLysAsn
141145
ValLysGlyPheTyrProSerAsp
156160
AsnGlyGlnProGluAspAsnTyr
171175
AspSerAspGlySerPhePheLeu
186190
LysSerArgTrpGlnGluGlyAsn
201205
HisGluAlaLeuHisXaa4 His Tyr
216220
SerLeuGlyLys
231
<210>16
<211>234
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>16
Mouse IgK signa:leader:(SEQ ID
MetValSerThrProGluPheLeu
15
ProAlaSerArg Gly
1620
权利要求
1.一种融合蛋白，由胰岛素模拟肽通过连接肽(Linker)与IgG-Fc或IgG-Fc 突变体形成，其通式为 IMPansulin mimetic peptides) -Linker-IgG-Fc 或者 IgG-Fc-Linker-IMP(Insulin mimetic peptides)。
2.权利要求1所述IMP为胰岛素模拟肽及其突变体(SEQID NO :1)。
3.权利要求1 所述 Linker 选自序列 SEQ ID NO 2 ；SEQ ID NO 3 ；SEQ ID NO 4 ；SEQ ID NO 5 ；SEQ ID NO 6 ；或 SEQ ID NO :7，(GGGGS)n，其中 η 为 1，2，3，4，5 或 6。
4.权利要求1所述Linker可以选自SEQID NO :8，其中η为1，2，3，4，5或6，或者直接连接，或者为其它甘氨酸富集的连接肽。
5.权利要求1所述IgGFc (铰链区-CH2-CH3)序列为人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4的 Fc及其突变或缺失体，上述序列选自SEQ ID NO 9 ；SEQ ID NO 10 ；SEQ ID N0:11或SEQ ID NO: 12，或者选自上述IgG-Fc序列的杂合体，其中IgG-Fc序列参照EU (Kakit)指数进行编号，重要的是上述IgG-Fc突变体选自序列SEQ ID NO 13 ；SEQ ID NO 14 ；SEQ ID NO 15 ； SEQ ID NO :16，上述突变位点可以是单位点突变或多位点突变组合，其中Xaa1 = Gln 或 ThrXaa2 = Gln 或 ThrXaa3 = Leu, Met 或 HisXaa4 = Ala 或 Asn
6.根据权利要求1所述，更进一步，与胰岛素模拟肽(IMP)相连的融合蛋白可以选自人血白蛋白或转铁蛋白，也可以选自人血白蛋白或转铁蛋白部分片段、突变体和缺失体。
7.权利要求1 5所述融合蛋白应用于人I型和II型糖尿病的预防与治疗，或者其 DNA序列应用于基因治疗。
8.权利要求5所述融合蛋白突变体，是基于增加与Fcfoi的亲和力来进一步增加IMP在体内的半衰期。
9.权利要求1 5所述融合蛋白使用真核细胞进行表达，蛋白纯化过程中使用A或G 蛋白葡聚糖凝胶层析柱。
10.权利要求1 5所述融合蛋白使用原核细胞进行表达。
全文摘要
本发明涉及一种治疗人I型和II型糖尿病的融合蛋白的氨基酸序列，以及生产方法和应用，本发明涉及一种能避免胰岛素抵抗的非胰岛素糖尿病疗法。本发明涉及的融合蛋白由胰岛素模拟肽与IgG-Fc或IgG-Fc突变体通过连接肽相互融合形成，在保留胰岛素模拟肽降低血糖活性的同时，能明显的提高胰岛素模拟肽的体内半衰期。其中，IgG-Fc的突变体能进一步增加融合蛋白体内的半衰期。
文档编号C12N15/62GK102516393SQ20111039972
公开日2012年6月27日 申请日期2011年11月30日 优先权日2011年11月30日
发明者张海涛 申请人:张海涛