一种快速区分核桃品种的引物和方法

专利名称：一种快速区分核桃品种的引物和方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学分子标记领域，具体地说涉及一种快速区分核桃品种的引物和方法。
背景技术：
核桃(Juglans regia L.)属于世界四大干果之一。核桃的分布广袤，除北方严寒地带，台湾、广东、江西全境及福建南部没有或极少核桃中之外，其他各地都有一定的栽培面积。由于近年来核桃产业的不断发展和壮大，核桃无性系品种的推广和深入，以及资源环境的破坏，核桃品种有朝单一性方面发展的趋势，资源保存中经常发生的资源混淆的情况，种质资源研究的重要性也引起越来越多人的重视。因此，建立核桃品种快速可靠的鉴定技术体系对于核桃品种资源的研究与保护及核桃产业的持续发展具有重要的意义。目前传统单一的形态学品种鉴定方法已经无法满足有效区分或鉴别众多的品种的要求。分子标记的产生突破了遗传学研究的瓶颈，克服了传统的形态标记、细胞学标记和生化标记易受外界因素，具有不可比拟的优势。在常用的RAPD、RFLP, SSR、AFLP等分子标记技术中，RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)发展历史长，是应用最早的DNA标记技术之一，它以快捷、简便、不易受外界环境影响以及不需要预知基因组序列的特点与优势，已被广泛应用于品种的分类研究、种质资源的遗传基础研究、基因连锁标记、遗传图谱的构建等方面。现有RAPD在蔬菜作物的种质鉴定中，多采用计算机软件绘制数字化指纹图谱，并结合统计学软件进行聚类分析，但聚类分析的结果往往无法用于品种鉴别。中国专利“基于基因组RAPD分析的豇豆品种分子鉴定方法”(专利号ZL200510018593. 5)公开了基于RAPD区分并判断豇豆不同品种的方法，经过筛选得到23个引物，采用0-1指纹技术并构建出聚类树。该专利采用引物较多，在品质鉴定时操作量非常大，不具备时效性，通过聚类树不好判断区分品种的引物，而且不够直观。

发明内容
发明目的本发明的目的是提供一种快速区分核桃品种的引物和方法，用于快速区分、鉴定核桃品种。技术方案为实现上述目的，本发明提供一种快速区分核桃品种的引物包括P-6 5 ’ -GTTTCGCTCCC-3’，P-17 5 ’ -AGGGGTCTTGG-3’。由于RAPD扩增自身的特点，对随机引物的设计显得尤为重要。一般RAPD的引物为9 10个碱基，理论上，引物越短，模板序列两端与引物互补的位点数量越多，扩增的PCR多态性丰富；但是，引物较短，也会引起模板互补配对稳定性低的问题。本发明通过设计出11个碱基的引物，可提高RAPD反应的稳定性。另外，引物的退火温度也非常重要，因此本发明在设计若干随机引物后要对引物进行严格的筛选。所述引物是通过针对核桃基因组设计的随机引物经2次梯度PCR筛选出条带清晰、产物重复出现的引物。引物要选择扩增性强、稳定性高、多态性好的随机引物，满足用于分析基因组多态性的引物要求。本发明主要是针对现在市面上常见的20中核桃品种进行区分，这20个核桃品种包括岱丰、N8-19、鲁核1号、Sll-U YZ 1-6、心形核桃、丰辉、N1-2、鲁光、N10-15、中林1号、鲁果2号、元丰、意大利、313-7、附2-6、511-8、辽宁2号、S1-19、岱香。对于利用上述引物快速鉴定区分核桃品种的方法，包括如下步骤(1)提取需要进行鉴定、区分的核桃DNA，稀释备用；(2)利用引物P-6对核桃DNA进行RAPD扩增，若在700bp、1 IOObp都出现特征性谱带，而900bp无特征性谱带，核桃品种112-6，被区分出来；若在700bp、900bp都无特征性谱带，在IlOObp出现特征性谱带，核桃品种‘意大利’被区分出来；若在700bp、1100bp都无特征性谱带，在900bp出现特征性谱带，核桃品种‘S13-7’被区分出来；若在700bp、900bp、IlOObp都无特征性谱带，则进入步骤(3)；(3)进一步利用引物P-6进行RAPD扩增，根据在550bp和650bp出现的特征性谱带分为A、B、C三组，若在550bp、650bp都出现特征性谱带则为A组，利用引物P_17再进行扩增，在400bp出现特征性谱带的为品种‘鲁果2号’品种，在400bp无特征性谱带为品种‘S1-19，；若在550bp、650bp都无特征性谱带则为B组，利用引物P_17再进行扩增，在400bp无特征性谱带的为品种‘N8-19’，在400bp有特征性谱带，250bp无特征性谱带的为品种‘YZ1-6，，在150bp、250bp、400bp都有特征性谱带的为品种‘岱丰，，在250bp、400bp都有特征性谱带，在150bp无特征性谱带的为品种‘中林1号’；若在550bp有特征性谱带，而650bp无特征性谱带，则为C组，进入步骤；(4)利用引物P-17对C组的DNA进行RAPD扩增，若在IlOObp有特征性谱带，品种‘鲁光’被区分出来；若在SOObp有特征性谱带，IlOObp无特征性谱带，品种‘S11-8’被区分出来；若在800bp、IlOObp都无特征性谱带，在700bp出现特征性谱带，品种‘辽宁2号，被区分出来；若在700bp、800bp、1 IOObp都无特征性谱带，在650bp出现特征性谱带，品种‘N10-15，被区分出来；若在650bp、700bp、800bp、IlOObp都无特征性谱带，通过进一步区分在200bp、380bp、450bp和550bp的特征性谱带进行区分若在550bp出现特征性谱带，450bp无特征性谱带，品种‘鲁核1号’被区分出来，若在200bp、550bp出现特征性谱带，450bp无特征性谱带，品种‘元丰’被区分出来，若在^Obp出现特征性谱带，200bp、450bp无特征性谱带，品种‘N1-2’被区分出来，若在450bp、550bp都无特征性谱带，品种‘Sll-Γ被区分出来，若在380bp、550bp无特征性谱带，450bp出现特征性谱带，品种‘丰辉，被区分出来，若在200bp、380bp、450bp都出现特征性谱带，在550bp无特征性谱带，品种‘心形核桃’被区分出来，若在380bp、450bp出现特征性谱带，200bp、550bp无特征性谱带，品种‘岱香，被区分出来。该方法的RAPD扩增为30μ 1的PCR反应体系，包括10XPCR Buffer 1. 5μ 1,2. 5mmol/L dNTPs 0. 8 μ 1,2. 5mmol/L MgCl2 1. 2μ 1,0. 08 μ 1 Taq 酶(5U/μ 1)，随机引物4μπιο1/μ1 1. 2 μ 1，模板 DNA 40 50ng ；反应于 95°C预变性 5min ;94°C变性 50s，退火80s，72°C延伸2min，43个循环；最后72°C延伸lOmin。PCR产物用含0. 5mg/L溴化乙锭的琼脂糖胶电泳分离，IXTAE电极缓冲液，150V电压下电泳40min，在凝胶成像系统下观察并记录。所述两种引物是在原有若干随机引物中进行筛选而得，其中包括通过2次梯度PCR进行筛选，而梯度PCR确定的退火温度即为该引物RAPD扩增时的退火温度。所述RAPD扩增反应中，引物P-6的退火温度为42. 8°C，引物P-17的退火温度为38. 0°C。这里的退火温度指复性时的退火温度。本发明通过2个引物就能区分出20个不同品种的核桃，为了清晰、完整地表示鉴定采用的引物和鉴别出的品种，同时为了方便他人对核桃品种进行区分、鉴定，本发明还建立了 “树型鉴别图”。所述树型鉴别图是基于PCR扩增后的谱带形态统计出的结果，树型鉴别图以引物作为节点，节点后是该引物对不同品种的区分结果，包括区分出的类别或者直接区分出来的品种，在节点后的分支还标记了不同结果相互区分的依据，即谱带之间的区别。例如650bp(+)表示在650bp有特征性谱带；1200bp(_)表示在1200bp无特征性谱带。利用本发明的方法，以及“树型鉴别图”，可以极大地方便上述20个核桃品种的鉴定和区分，而且，在已知需要区分品种的情况下，可在“树型鉴别图”上找到区分这些品种的引物，方便快捷。有益效果本发明的一种快速区分核桃品种的引物是经过严格筛选获得，11个碱基的设计有效地提高了 RAPD反应的稳定性，仅通过2个引物就可轻松将20个品种的核桃区分开来，操作方便，快速准确；本发明的方法可实现将20个核桃品种在任何情况下进行快速、准确的区分，所得的树型鉴别图比聚类树更具直观性，根据树型鉴定图就可以找出能区分任意两个品种的引物，该方法可以实现核桃苗木的早期鉴定，在其他物种上也具有广泛的通用性。


图1是利用2个引物对20个核桃品种进行区分鉴定的树型鉴别 图2是利用引物P-6在20个核桃品种上的RAPD扩增图；图3是利用引物P-17对A组和B组品种的DNA进行RAPD扩增得到的扩增图，靠左侧为B组，靠右侧为A组，横列是特异谱带，纵列的数字与图6对应，M表示DNAmarker ；图4是利用引物P-17对C组品种的DNA进行RAPD扩增得到的扩增图，横列是特异谱带，纵列数字与图6对应；M表示DNA marker ；图5是实施例中对品种‘鲁光，与‘S13-7’，iYZl-B'和‘丰辉，的扩增图谱，横列是特异谱带，纵列数字与图6对应；M =DNA marker ；图6是本发明20个核桃品种的编号和品种名称。
具体实施例方式下面结合附图对本发明作更进一步的说明。1、DNA 的提取本发明的核桃样品都是市面常见的重要核桃品种，这20个核桃品种包括岱丰、N8-19、鲁核1号、S11-1、YZ 1-6、心形核桃、丰辉、N1-2、鲁光、N10-15、中林1号、鲁果2号、元丰、意大利、S13-7、N12-6, S11-8、辽宁2号、S1-19、岱香，上述品种主要参见《中国果树志 核桃卷》，郗荣庭等主编，中国林业出版社出版，部分品种为山东果树所近年来新育成品种。以核桃幼叶为材料，在传统DNA提取方法-CTAB法的基础上，加入酚和抗氧化剂(β -巯基乙醇)来有效去除蛋白质和酚类物质，利用这种改良的CTAB法提取核桃基因组DNA,制备的DNA无凝胶状物质、蛋白质和酚类物质，适于PCR扩增。将提取的核桃幼叶基因组DNA，经0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测，利用Eppendorf公司生产的Bio-Photometer核酸检测仪检测DNA溶液浓度与纯度，并将浓度稀释至30ng/ μ 1，保存，用于PCR扩增。为了方便在扩增图谱中标记出来，对每个核桃品种进行了编号，参考说明书附图中的图6。2、PCR反应体系与条件该方法的RAPD扩增为30μ 1的PCR反应体系，包括10XPCR Buffer 1. 5μ 1,2. 5mmol/L dNTPs 0. 8 μ 1,2. 5mmol/L MgCl2 1. 2μ 1,0. 08 μ 1 Taq 酶(5U/μ 1)，随机引物4μπιο1/μ 1 1. 2 μ 1，模板DNA 40 50ng ；反应于95°C预变性5min ；94°C变性50s，退火80s，72°C延伸anin，43个循环；最后72°C延伸lOmin。PCR产物用含0. 5mg/L溴化乙锭的琼脂糖胶电泳分离，IXTAE电极缓冲液，150V电压下电泳40min，在凝胶成像系统下观察并记录。3、引物的严格筛选本发明的2个引物是在原先设计的40个随机引物经严格筛选而得。先针对现有核桃品种的基因组设计40个随机引物，从中选取出11个碱基的、扩增性强、稳定性高、多态性好的随机引物，经2次梯度PCR筛选出条带清晰、产物重复出现的引物。具体地说，梯度 PCR 的反应体系为 10XPCR Buffer 1. 5 μ 1,2. 5mmol/L dNTPs 0. 8 μ 1,2. 5mmol/L MgCl21. 2μ 1,0. 08μ 1 Taq 酶(5U/μ 1)，随机引物 4 μ mol/μ 1 1. 2 μ 1，模板 DNA 40 50ng。反应程序为95°C预变性5min ；94°C变性50s，退火80s，72°C延伸2min，43个循环；最后72°C延伸lOmin。根据连续2次梯度PCR选择谱带清晰、PCR产物重复出现的引物、该引物的退火温度以偏高为佳，对于适宜温度范围较大的则选择中间温度。本发明的引物序列和退火温度如下P-6 5，-GTTTCGCTCCC-3，，退火温度 42. 8 °C ；P-17 :5，-AGGGGTCTTGG-3，退火温度 38. 0°C。4、核桃品种的快速区分选用DNA多态性谱带在不同品种中的有无将核桃品种进行区分，直到所有待鉴别的品种被单独分开为止。通过“树型鉴别图”以更好地方便品种鉴别、统计工作。“树型鉴别图”是基于PCR扩增后的谱带形态统计出的结果，树型鉴别图以引物作为节点，节点后是该引物对不同品种的区分结果，包括区分出的类别或者直接区分出来的品种，在节点后的分支还标记了不同结果相互区分的依据，即谱带之间的区别。利用P-6、P-17两个引物对20个品种的核桃品种进行RAPD扩增，即可绘制出完整的树型鉴别图(如图1所示)，具体区分步骤如下(1)利用引物P-6对核桃DNA进行RAPD扩增，请参考图2，若在700bp、IlOObp都出现特征性谱带，而900bp无特征性谱带，核桃品种‘附2-6，被区分出来；若在700bp、900bp都无特征性谱带，在IlOObp出现特征性谱带，核桃品种‘意大利’被区分出来；若在700bp、IlOObp都无特征性谱带，在900bp出现特征性谱带，核桃品种‘S13-7’被区分出来；若在700bp、900bp、IlOObp都无特征性谱带，则进入下一步骤；(2)进一步利用引物P-6进行RAPD扩增，根据在550bp和650bp出现的特征性谱带分为A、B、C三组，若在550bp、650bp都出现特征性谱带则为A组，请参考图3右侧，利用引物P_17再进行扩增，在400bp出现特征性谱带的为品种‘鲁果2号’品种，在400bp无特征性谱带为品种‘S1-19，；若在550bp、650bp都无特征性谱带则为B组，请参考图3左侧，利用引物P_17再进行扩增，在400bp无特征性谱带的为品种‘N8-19，，在400bp有特征性谱带，250bp无特征性谱带的为品种‘YZ1-6，，在150bp、250bp、400bp都有特征性谱带的为品种‘岱丰，，在250bp、400bp都有特征性谱带，在150bp无特征性谱带的为品种‘中林1号’；若在550bp有特征性谱带，而650bp无特征性谱带，则为C组，请参考图4进入下一步骤；(3)利用引物P-17对C组的DNA进行RAPD扩增，若在IlOObp有特征性谱带，品种‘鲁光’被区分出来；若在SOObp有特征性谱带，IlOObp无特征性谱带，品种‘S11-8’被区分出来；若在800bpUlOObp都无特征性谱带，在700bp出现特征性谱带，品种‘辽宁2号，被区分出来；若在700bp、800bp、1 IOObp都无特征性谱带，在650bp出现特征性谱带，品种‘N10-15，被区分出来；若在650bp、700bp、800bp、IlOObp都无特征性谱带，通过进一步区分在200bp、380bp、450bp和550bp的特征性谱带进行区分若在550bp出现特征性谱带，450bp无特征性谱带，品种‘鲁核1号’被区分出来，若在200bp、550bp出现特征性谱带，450bp无特征性谱带，品种‘元丰’被区分出来，若在^Obp出现特征性谱带，200bp、450bp无特征性谱带，品种‘N1-2’被区分出来，若在450bp、550bp都无特征性谱带，品种‘Sll-Γ被区分出来，若在380bp、550bp无特征性谱带，450bp出现特征性谱带，品种‘丰辉，被区分出来，若在200bp、380bp、450bp都出现特征性谱带，在550bp无特征性谱带，品种‘心形核桃’被区分出来，若在380bp、450bp出现特征性谱带，200bp、550bp无特征性谱带，品种‘岱香，被区分出来。综上所述，但凡涉及上述20个品种中任意品种或者其组合的核桃，按照上述步骤即可完成品种鉴别和区分。利用本发明的方法统计出的“树型鉴别图”不仅可完成对未知品种的鉴定，还可查询出鉴定不同品种所需要的引物和鉴别依据。下面请参考图1，可以看出，当需要查询任意核桃品种的鉴别方法和所需引物时，只需要在树型鉴别图分支末端找到对应品种编号，向前回溯即可。例如，需要查询区分品种‘意大利’ ‘岱丰’、‘丰辉’，根据本发明的方法，通过引物P-6即可将在IlOObp有特征性谱带的‘意大利’区分出来，而利用引物P-17进行扩增，在150bp、250bp、400bp出现特征性谱带的为品种‘岱丰，。再给出一个实施例，请参考图5，利用本发明方法区分‘鲁光’与‘S13-7’，iYZl-B'和‘丰辉’这两组核桃品种，根据图1可以发现，选用引物P-6扩增，通过在900bp出现的特征性条带即可完成鉴定。可以看出，‘鲁光’在900bp处时没有特征性谱带的，而‘S13-7’在900bp处是有特征性谱带的。对于品种1Z1-6’和‘丰辉’，利用引物P-17即可完成鉴定，可以看出，1Z1-6’在550bp无特征性谱带，而‘丰辉’有。
权利要求
1.一种快速区分核桃品种的引物，其特征在于包括P-6 5'-GTTTCGCTCCC-3，，P-I7 5’ -AGGGGTCTTGG-3，。
2.根据权利要求1所述的一种快速区分核桃品种的引物，其特征在于，所述引物是通过针对核桃基因组设计的随机引物经2次梯度PCR筛选出条带清晰、产物重复出现的引物。
3.一种利用权利要求1所述引物快速鉴定区分核桃品种的方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)提取需要进行鉴定、区分的核桃DNA，稀释备用；(2)利用引物P-6对核桃DNA进行RAPD扩增，若在700bp、IlOObp都出现特征性谱带，而900bp无特征性谱带，核桃品种112-6，被区分出来；若在700bp、900bp都无特征性谱带，在IlOObp出现特征性谱带，核桃品种‘意大利’被区分出来；若在700bp、1100bp都无特征性谱带，在900bp出现特征性谱带，核桃品种‘S13-7’被区分出来；若在700bp、900bp、IlOObp都无特征性谱带，则进入步骤(3)；(3)进一步利用引物P-6进行RAPD扩增，根据在550bp和650bp出现的特征性谱带分为A、B、C三组，若在550bp、650bp都出现特征性谱带则为A组，利用引物P-17再进行扩增，在400bp出现特征性谱带的为品种‘鲁果2号’品种，在400bp无特征性谱带为品种‘S1-19’ ；若在550bp、650bp都无特征性谱带则为B组，利用引物P-17再进行扩增，在400bp无特征性谱带的为品种‘N8-19’，在400bp有特征性谱带，250bp无特征性谱带的为品种‘YZ1-6，，在150bp、250bp、400bp都有特征性谱带的为品种‘岱丰，，在250bp、400bp都有特征性谱带，在150bp无特征性谱带的为品种‘中林1号’；若在550bp有特征性谱带，而650bp无特征性谱带，则为C组，进入步骤(4)；(4)利用引物P-17对C组的DNA进行RAPD扩增，若在IlOObp有特征性谱带，品种‘鲁光’被区分出来；若在SOObp有特征性谱带，IlOObp无特征性谱带，品种‘S11-8’被区分出来；若在800bp、1100bp都无特征性谱带，在700bp出现特征性谱带，品种‘辽宁2号，被区分出来；若在700bp、800bp、IlOObp都无特征性谱带，在650bp出现特征性谱带，品种‘N10-15，被区分出来；若在650bp、700bp、800bp、IlOObp都无特征性谱带，通过进一步区分在200bp、380bp、450bp和550bp的特征性谱带进行区分若在550bp出现特征性谱带，450bp无特征性谱带，品种‘鲁核1号’被区分出来，若在200bp、550bp出现特征性谱带，450bp无特征性谱带，品种‘元丰’被区分出来，若在550bp出现特征性谱带，200bp、450bp无特征性谱带，品种‘N1-2’被区分出来，若在450bp、550bp都无特征性谱带，品种‘Sll-Γ被区分出来，若在380bp、550bp无特征性谱带，450bp出现特征性谱带，品种‘丰辉，被区分出来，若在200bp、380bp、450bp都出现特征性谱带，在550bp无特征性谱带，品种‘心形核桃’被区分出来，若在380bp、450bp出现特征性谱带，200bp、550bp无特征性谱带，品种‘岱香，被区分出来。
4.根据权利要求3所述的一种快速鉴定区分核桃品种的方法，其特征在于该方法的 RAPD 扩增为 30μ 1 的 PCR 反应体系，包括 10XPCR Buffer 1. 5 μ 1,2. 5mmol/L dNTPs·0.8 μ 1,2. 5mmol/L MgCl2 1. 2μ 1,0. 08 μ 1 Taq 酶(5υ/μ1)，随机弓 | 物 4μπιο1/μ1·1.2 μ 1，模板DNA 4(T50ng ；反应于95°C预变性5min ；94°C变性50s，退火80s，72 °C延伸2min，43个循环；最后72°C延伸IOmin0
5.根据权利要求3所述的一种快速鉴定区分核桃品种的方法，其特征在于所述RAPD扩增反应中，引物P-6的退火温度为42. 8°C，引物P-17的退火温度为38. 0°C。
全文摘要
本发明公开了一种快速区分核桃品种的引物和方法，属于分子生物学分子标记领域，本发明针对核桃的基因序列设计RAPD随机引物，经筛选后得到2个随机引物，提取核桃品种的DNA后，逐个利用引物扩增未知核桃品种的DNA，将得到的具有唯一特异性谱带的品种区分出来，建立树型鉴别图。本发明的引物是经过严格筛选获得，并针对性地提高了RAPD反应的稳定性，仅通过2个引物就可轻松将20个品种的核桃区分开来，操作方便，快速准确；本发明的方法可实现将20个核桃品种在任何情况下进行快速、准确的区分，树型鉴别图比聚类树更具直观性，根据树型鉴定图就可以找出能区分任意两个品种的引物。
文档编号C12Q1/68GK102559870SQ20111040783
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月9日 优先权日2011年12月9日
发明者上官凌飞, 张美勇, 徐颖, 王晨, 相昆, 韩键 申请人:南京农业大学