专利名称：一种共表达An Man5A和XynⅡ的毕赤酵母系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种共表达源自黑曲霉(Aspergillus niger)Lff-I的β-甘露聚糖酶基因(An man5A)和源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的β_1，4_木聚糖酶基因 (xyn II)的毕赤酵母新表达系统，属于生物工程技术领域。
背景技术：
半纤维素是自然界的第二大类多糖聚合物，作为木质素和纤维素中间的连接物， 广泛存在于植物细胞壁。半纤维素的降解产物具有广泛的应用价值，因此，如何充分利用丰富的半纤维素资源成为研究的热点。半纤维素的完全降解需要靠诸如β_1，4-内切木聚糖酶、β-甘露聚糖酶、半乳糖苷酶和脱乙酰基化酶等酶的协同作用。β-甘露聚糖酶(β-ι， 4-D-mannan mannohydrolase, EC 3. 2. 1. 78)是一种能从均一甘露聚糖和异甘露聚糖主链的内部降解β-1，4-甘露糖苷键的水解酶，属于半纤维素酶类，其广泛地存在于微生物、植物和动物中。β_1，4-内切木聚糖酶(endo-0-l，4-xylanase，EC 3.2. 1.8)是一类能够专一降解木聚糖为低聚木糖和木糖的一组酶的总称，主要从主链内部作用于木糖苷键，是木聚糖降解过程中最重要的酶之一。能够产生木聚糖酶的微生物有很多，包括丝状真菌、细菌、放线菌等。两种酶均广泛应用于食品、医药、饲料、造纸和印染等领域。在饲料工业中，β-甘露聚糖酶和β-1，4-内切木聚糖酶作为新型的饲料添加剂能有效降解植物细胞壁中的甘露聚糖成分，消除抗营养因子，提高能量利用率、改善饲料转化率。在造纸工业中，甘露聚糖酶和β-1，4-内切木聚糖酶等半纤维素降解酶类协同使用，处理纸浆，能明显改善纸质。此外，β-甘露聚糖酶和β-1，4-内切木聚糖酶能增加软木的水解，进而提高木质素的转化。早期对于β-甘露聚糖酶和β_1，4-内切木聚糖酶的研究多集中在产酶菌株的选育、发酵条件的优化、酶的分离纯化、酶的理化性质、酶的复合诱变、酶的水解机理等方面。随着分子生物学研究的不断深入与完善，越来越多的工作集中于酶的基因克隆和高效表达方面，如构建和筛选优良的高效基因工程菌株；基于酶结构与功能的关系，通过定点诱变改变酶活性位点，从而实现催化功能的改变，以拓宽其应用范围等。不同来源的两种酶基因已经被克隆，并在大肠杆菌、酿酒酵母、毕氏酵母等表达系统中进行了表达。然而在毕赤酵母系统中进行共表达的研究尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是构建一种新型的共表达β-甘露聚糖酶基因和β-1，4_木聚糖酶基因的毕赤酵母工程菌。本发明的技术方案所涉及到的pPICZ α A_man5A和pPIC9K_xynII均为本实验室构建和保藏。所述的重组Man5A和重组Xyn II活性的测定方法于25mL具塞试管A和B中，各加入质量浓度为0. 5%的底物溶液2. 4mL, 50°C预热lOmin，在A管中加入0. ImL适当稀释的酶液，50°C反应IOmin ；立即各加入2. 5mL 3'，5' - 二硝基水杨酸(DNS)试剂，在B管中再补加0. ImL酶液，A和B管均煮沸7min;冷却后各加去离子水5mL，摇勻；540nm处以B管为空白对照测定A管吸光度值，并从标准曲线上查出相应的还原糖(分别以甘露糖和木糖计)含量并折算成酶活性单位。其中重组Man5A 活性测定底物为用PH 3. 6、柠檬酸-Na2HPO4缓冲液配制的角豆胶(Sigma，USA)溶液，重组 XynII活性测定底物为用pH 4. 6、柠檬酸-Na2HPO4缓冲液配制的桦木木聚糖(Sigma，USA) 溶液。酶活性单位定义在本测定条件下，以每分钟产生1 μ mol还原糖所需的酶量定义为 1个木聚糖酶活性单位(IU)。所述的重组工程菌的构建方法(l)GS115/man5A的构建、表达及活性测定用&ic I对pPICZ α A_man5A进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电击转化GS115感受态细胞，用^0(^11筛选得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/man5A ；按照手册上的标准流程进行诱导表达，用DNS法测定重组甘露聚糖酶活性。(2)工程菌 GS115/man5A-xynII 的构建用 Ml I 对 pPIC9K_xynII 进行线性化， 按照毕赤酵母表达手册进行电转化GSl 15/man5A感受态细胞，用G418筛选得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/man5A-XynII ；按照手册上的标准流程进行诱导表达，用DNS法测定重组甘露聚糖酶和甘露聚糖酶的活性。本发明的有益效果本发明提供了一种新型的共表达甘露聚糖酶基因和 3-1，4-木聚糖酶基因的工程菌65115/111￡11154-^1111的构建方法。本发明不仅实现对双质粒体系在共表达的应用进行了有益探索，而且实现了目标酶的共同生产，降低了产物的制备成本，为进一步工业化生产复合酶奠定了基础。
图 1 :GS115/xynII、GS115/man5A 和 GS115/man5A_xynII 表达产物的 SDS-PAGE 电泳图谱
具体实施例方式以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。实施例1工程菌GS115/man5A的构建、表达及产物活性测定用Mc I对pPICZ α A-man5A进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化 GSl 15感受态细胞，用kocin筛选得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/man5A。该工程菌用1. 0%甲醇诱导％h，DNS法测得发酵液中重组甘露聚糖酶活性达29. 05IU/mL。SDS-PAGE 电泳显示重组甘露聚糖酶分子量为52. OkDa0实施例2工程菌GS115/man5A-XynII的构建、表达及产物活性测定用Ml I对pPICTk-xynll进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化GS115/ man5A感受态细胞，用G418筛选得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/man5A-XynII。该工程菌用1.0%甲醇诱导96h，DNS法测得发酵液中重组木聚糖酶活性达112. 10IU/mL，重组甘露聚糖酶活性仍为29. 05IU/mL。SDS-PAGE电泳显示重组木聚糖酶和甘露聚糖酶分子量分别为24. IkDa和52. OkDa，如图1所示。
权利要求
1.一种共表达源自黑曲霉(Aspergillus niger)Lff-I的β-甘露聚糖酶基因(An man5A)和源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的β_1，4_木聚糖酶基因(xyn II) 的毕赤酵母新表达系统。
2.共表达Anman5A和xyn II的毕赤酵母系统的构建和表达方法(1)GS115/man5A的构建、表达及活性测定用MeI对pPICZ α A_man5A进行线性化， 按照毕赤酵母表达手册进行电转化GSl 15感受态细胞，用kocin筛选得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/man5A;按照手册上的标准流程进行诱导表达，该工程菌用1.0%甲醇诱导 96h，DNS法测得发酵液中重组甘露聚糖酶活性达29. 05IU/mL ；(2)工程菌GS115/man5A-xynII的构建用Ml I对pPIC9K_xyn II进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化GSl 15/man5A感受态细胞，用G418筛选得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/man5A-Xyn II ；按照手册上的标准流程进行诱导表达，该工程菌用1.0% 甲醇诱导96h，DNS法测得发酵液中重组木聚糖酶活性达112. 10IU/mL，重组甘露聚糖酶活性仍为29. 05IU/mL ；SDS-PAGE电泳显示重组木聚糖酶和甘露聚糖酶分子量分别为24. IkDa 和 52. OkDa0
全文摘要
本发明提供了一种新型的共表达源自黑曲霉(Aspergillus niger)LW-1的β-甘露聚糖酶基因和源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的β-1，4-木聚糖酶基因的工程菌GS115/man5A-xyn II的构建方法。所构建成的毕赤酵母共表达系统可用于的β-甘露聚糖酶和β-1，4-木聚糖酶的工业化生产。所制备的两种酶具有底物亲和力强、催化效率高的特性，具有较大的工业化生产潜力和经济价值。
文档编号C12N15/81GK102559526SQ201110410598
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月12日 优先权日2011年12月12日
发明者李剑芳, 殷欣, 赵顺阁, 邬敏辰, 魏喜换 申请人:江南大学