专利名称：一种来源于小麦Antiquitin基因的启动子及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域，涉及一种来源于小麦Antiquitin基因的启动子及其在提高植物养分利用效率更具体的说是在提高植物中氮素利用效率方面的用途。
背景技术：
在农作物生长的过程中，为了提高产量挖掘农作物的生产潜力，农民会大量使用化肥，特别是大量施用氮肥。据报道，我国有着不到世界10%的耕地，但是氮肥使用量却占世界的近30%。国际合作委员会农业面源污染控制课题组研究得出我国氮肥施用量的一半在被农作物吸收之前就以气体形态逸失到大气中或从排水沟渠流失到水体环境中。目前我国作物氮素利用率只有30-35%，而发达国家则高达45%，大量未被作物吸收利用的氮肥进入环境，不但造成资源浪费，增加生产氮肥的能源消耗，还增加了农民的投入，而且在很多地方已经引起了地下水污染和江河湖泊的富营养化等环境问题。为了改变这一现状， 目前生产上采用氮素利用率高的作物品种，或是在保证作物产量基础上，减少氮肥的使用量等等方式，但无论是哪种方式其目的都是为了提高氮肥的利用率，减少浪费和环境污染。利用生物技术途径是提高作物氮素利用率的重要途径之一。通过转基因过表达与氮素吸收或利用直接相关的基因在提高植物的氮素利用率方面已取得了一定的进展(Habash 等，Ann. Appl. Biol.，2001，138 :83-89 ；Ying Zhou 等，TAG, 2009，118 1381-1390)，效果比较明显的是用作物自身的Antiquitin启动子驱动丙氨酸氨基转移酶的表达(Good 等，Can. J. Bot.，2007，85 252-262，实验材料为油菜；Shrawat 等，2008，Plant Biotechnology Journal，6 :722_732，实验材料为水稻)，转基因油菜和非转基因油菜在达到同样的最高产量时，转基因油菜的氮肥使用量仅为非转基因对照的60%。
发明内容
本发明提供了一种来源于小麦(Triticumaestivum)Antiquitin(TaAntl)基因的启动子(命名为TaAntlpro)及其在提高植物养分利用效率更具体的说是在提高植物氮素利用效率方面的用途。本发明提供的一种来源于小麦Antiquitin基因的启动子，其特征在于具有下列 DNA序列之一1)序列表中SEQ ID NO 1所示的DNA序列；2)将序列表中SEQ ID NO 1所示的DNA序列在5‘端或3'端截去一段后的序列， 其功能不变，只是活性有些改变或没有改变；3)将序列表中SEQ ID NO=I所示的DNA序列经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加但功能并未改变的DNA序列。含有上述TaAntlpr0的表达盒也属于本发明的保护范围。一种含有来源于小麦Antiquitin基因启动子的表达盒，其特征在于该表达盒由所述的来源于小麦Antiquitin基因的启动子、编码目的基因的DNA序列和一个转录终止的DNA序列构成；来源于小麦Antiquitin基因的启动子以功能性方式与编码目的基因的DNA 序列连接，且所述编码目的基因的DNA序列与一个转录终止的DNA序列连接。所述含有来源于小麦Antiquitin基因启动子的表达盒，其特征在于构建的目的基因可以是需要表达的任何基因，在本发明中优选的目的基因为GUS基因或与养分代谢有关的基因。所述含有来源于小麦Antiquitin基因启动子的表达盒，其特征在于构建的目的基因为与氮磷代谢有关的基因，这些基因涉及养分的吸收、转运和利用等过程。所述含有来源于小麦Antiquitin基因启动子的表达盒，其特征在于构建的目的基因为与氮代谢有关的基因，可选自硝酸转运蛋白、氨转运蛋白、硝酸还原酶、谷胺酰胺合成酶、天门冬酰胺合成酶、谷氨酸合成酶、天门冬氨酸氨基转移酶和丙氨酸氨基转移酶 (Alanineaminotransferase，下文简称AlaAT)基因，但并不限于这些基因。所述含有来源于小麦Antiquitin基因启动子的表达盒，其特征在于构建的目的基因为与氮代谢有关的水稻丙氨酸氨基转移酶基因。所述含有来源于小麦Antiquitin基因启动子的表达盒，其特征在于使用的转录终止序列可从大量的转录终止序列中进行选择，比如NOS终止序列、35S终止序列等。含有所述TaAntlpro的重组表达载体、重组菌和转基因细胞系也属于本发明保护的范围。可用现有的植物表达载体构建含所述TaAntlpro的重组表达载体。可用的植物表达载体种类很多，比如 PAHC15、pAHC18、pAHC25、pCAMBIA0390、pCABIA2201、pCAMBIA3301、 PBI121或其它衍生植物表达载体。用现有的分子生物学方法可以构建多种含所述 TaAntlpro 的重组表达载体，比如 pCAMBIA0390_TaAntIpro-AlaAT 等。为便于对转基因植物细胞或植株进行筛选或鉴定，在构建含所述TaAntlpro的重组表达载体中可带有抗性筛选基因或标记基因，比如BAR基因、卡那霉素基因、GUS基因、 GFP基因等；从转基因植物的安全性考虑也可以不带抗性筛选基因或标记基因，直接用PCR 或逆境筛选转化植株。本发明还提供了一种来源于小麦Antiquitin基因的启动子在提高植物养分利用率尤其是氮素利用率方面的用途，其特征在于利用所述重组表达载体转化目的植物，从中筛选出养分利用效率尤其是氮素利用效率提高的转基因植株。所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物，具体可以是烟草。一种来源于小麦Antiquitin基因的启动子在提高植物氮素利用率方面的用途， 其特征在于用重组表达载体pCAMBIA0390-TaAnt Ipro-AlaAT转化烟草叶片，抗性再生植株经PCR检测和不同氮素水平的营养液培养，筛选出氮素利用效率提高的转基因后代。所述的重组表达载体转化目的植物的方法可以通过农杆菌介导、花粉管介导或基因枪轰击等常规转基因手段进行。用本发明的方法利用农杆菌把所述含有来源于小麦Antiquitin基因的启动子的重组表达载体pCAMBIA0390-TaAntIpro-AlaAT转化烟草叶片，阳性转基因烟草植株的平均生物量显著高于对照44%，说明本发明的TaAntlpro在培养养分高效利用的转基因植物方面有广泛应用前景。
图1是转pCAMBIA0390_TaAntIpro-AlaAT抗性转基因烟草植株的PCR检测图谱图中M为分子量标准；-ck为未作转化的烟草；+ck为转化用的质粒；AlaAT为转化后得到的抗性烟草。图2是pCAMBIA0390-TaAntIpro-Gus抗性转基因烟草植株的PCR检测图谱图中M为分子量标准；-ck为未作转化的烟草；+ck为转化用的质粒；AlaAT为转 pCAMBIA0390-TaAntIpro-AlaAT得到的抗性烟草；GUS 为转pCAMBIA0390-TaAntlpro_Gus 得到的抗性烟草。图3为转pCAMBIA0390-TaAntIpro-Gus抗性转基因烟草植株⑶S染色情况图中A为TaAntlpr0驱动目的基因在烟草地上部养分运输组织中表达；B为TaAntlpr0 驱动目的基因在烟草根尖表达；C为非转基因烟草，没有GUS染色信号。下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不以任何方式限制本发明的范围。
具体实施例方式实施例中所用试剂如无特别说明均购自上海生工生物工程技术有限公司，所用引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。实施例1 小麦Antiquitin基因启动子的克隆利用水稻的Antiquitin基因的cDNA序列(序列登录号AK060757)在 NCBI (National Center for Biotechnology Information) ^ig Φ ^if Blast
检索到一个小麦Antiquitin基因的cDNA序列(AK330832. 1)，该cDNA全长2109bp，编码区1530bp,与水稻Antiquitin基因编码区的序列相似性为90 %，小麦Antiquitin基因起始密码子ATG上游有192bp的5'未翻译区，未能检索到与小麦Antiquitin基因对应的基因组序列。为得到小麦Antiquitin基因的启动子序列，把上述小麦Antiquitin cDNA起始密码子ATG上游的192bp的序列提交到中国农业科学院作物科学研究所贾继增老师建立的小麦基因组数据库中进行比对，结果比上一条长度为22. 6kb的小麦基因组序列，该基因组序列包括有小麦Antiquitin基因的启动子序列，根据该序列设计了一对扩增Antiquitin基因启动子的引物，为便于后续的重组表达载体的构建，在2个引物的5' 分别添加了不同的酶切位点和保护碱基，具体的引物序列为W-4 ALDH Pl上:AATTAAGC IIGAGCCCGTGCGTTCCTTCCTATCT(下划线部分为添加的 HindIII 酶切位点，W-4ALDH Pl 下 AATACCCGGGATGGTGGGCGGGTTGGTTCT (下划线部分为添加的Sma I酶切位点，并在上海生工生物工程)有限公司对这2条引物进行了合成。利用上述引物对小麦品种中国春的基因组DNA进行PCR扩增。采用25 μ 1的反应体系，其中含有 IOmM Tris-HCl, 50mM KCl, 1. 5mMMgCl2,pH 9. 0，每种 dNTP 0. ImM，正反向引物各0. 4 μ M，1. 2UPfu Taq DNA聚合酶和约IOOng的基因组DNA。扩增参数为94°C 4分钟，94 V 45秒，65 °C 45秒，72 °C 1.5分钟，30个循环，72 °C 7分钟。PCR扩增产物经1 %的琼脂糖凝胶电泳分离，得到1条与设计扩增长度相一致的电泳条带，对该电泳条带用天根生化科技(北京)有限公司试剂盒进行纯化并将纯化产物克隆到该公司的PBS-T克隆载体上，测序后得出，PCR扩增序列与设计引物时参照的小麦基因组序列只有3个碱基的差别， 证实了扩增得到的序列是小麦Antiquitin基因的启动子序列，该启动子序列(起始密码子 ATG的上游序列)长度为1118bp，将其命名为序列表中的SEQ ID NO :1。实施例2 水稻丙氨酸氨基转移酶基因(AlaAT)编码序列的克隆在NCBI数据库中用“rice AlaAT”进行Blast检索，从中查到一个水稻丙氨酸氨基转移酶的完整mRNA，其登录号为AB007405. 1,该序列全长1821bp，其中的编码区 1452bp，为获得该基因完整编码序列的克隆，在编码区的两端设计了一对引物，为便于后续载体构建，在引物的5'还分别加上了不同的酶切位点，具体的引物序列为R-Ala P3-1 AATACCCGGGCAACGCTGCCGCTGAATC (下划线部分为添加的 Sma I 酶切位点)，R-Ala P3-2 -M TTGAGCTCAAAAAGAAGGCCTGGGGAAAATC (下划线部分为添加的Mc I酶切位点)。用天根生化科技(北京)有限公司生产的植物总RNA提取试剂盒从水稻品种中花 11号的根中提取总RNA，并用宝生物工程(大连)有限公司生产的CDNA合成试剂盒将提取的总RNA反转录成cDNA，以得到的cDNA为模板，用引物组合R-Ala P3-1/R-Ala P3-2进行 PCR 扩增，采用 25 μ 1 的反应体系，其中含有 IOmM Tris-HCl, 50mM KCl, 1. 5mM MgCl2, pH 9. 0，每种dNTP 0. ImM，正反向引物各0.4 μ M，1.2 U Pfu Taq DNA聚合酶和IOng的cDNA。扩增参数为94°C 4分钟，94°C45秒，57°C 45秒，72°C 1. 5分钟，30个循环，72°C 7分钟。PCR 扩增产物经的琼脂糖凝胶电泳分离，得到1条与目标长度一致的电泳条带，对该电泳条带用天根生化科技(北京)有限公司试剂盒进行纯化并将纯化产物克隆到该公司的PGM-T 克隆载体上进行测序，结果表明，目的基因的扩增长度为1577bp，与设计扩增长度完全相符，扩增片段的序列与登录号为AB007405. 1的文献公布的水稻丙氨酸氨基转移酶mRNA的相应序列完全相同。实施例3 由小麦Antiquitin基因启动子(TaAntlpr0)驱动的农杆菌表达载体的构建用Hind III/EcoR I 对基础表达载体 pAHC25 (Christensen AH 和 Quail PH, Transgenic Research, 1996,5 :213-218)进行部分双酶切，回收含有 Ubi-Gus-Nos-Ubi-Bar-Nos元件的大小约71Λ的大片段，然后将其连接到同样双酶切的农杆菌表达载体pCAMBIA-0390 (基因库登录号AF234291. 1)的多克隆位点上，得到标记基因为⑶S抗性筛选基因为BAR的农杆菌表达载体pCAMBIA0390-Ubi-Gus，该表达载体大小约13. 91Λ，对此表达载体进一步用Hind ΙΙΙ/Sma I进行部分双酶切，回收约 11.9kb的大片段，并将其与从含TaAntlpro的pBS_T克隆载体上用同样双酶切切下来的 TaAntlpro片段连接，通过转化大肠杆菌，从单个抗性菌斑中用PCR筛选含有TaAntlpro和 GUS基因的重组表达载体(有的重组表达载体不含GUS基因)，将此重组表达载体命名为 pCAMBIA0390-TaAntIpro-Gus。该表达载体主要用于检测TaAntlpro驱动GUS基因表达的部位。为检验TaAntlpro在提高植物养分利用效率方面的应用效果，构建了一个以水稻丙氨酸氨基转移酶(AlaAT)为目的基因的表达载体。构建方式是通过Sma I/Sac I双酶切用水稻的AlaAT基因置换表达载体pCAMBIA0390-TaAntlpro-Gus中的Gus基因。由于在水稻AlaAT编码基因的中间部位也有一个Me I的酶切位点，为获得含有完整水稻AlaAT 编码基因的片段，对含有水稻AlaAT编码序列的重组pGM-T载体用Sma I/Sac I进行部分双酶切，回收大小为1. 6kb的DNA片段(该片段即含有完整的水稻AlaAT的编码序列)，并把该片段连接到同样双酶切的pCAMBIA0390-TaAntIpro-Gus载体上，得到⑶S基因被水稻 AlaAT置换的新重组表达载体pCAMBIA0390-TaAntlprO-AlaAT，在该重组表达载体中含有的以TaAntlpro为启动子的表达盒为TaAntlpro-AlaAT-NOS终止子片段。实施例4 小麦Antiquitin基因启动子的功能验证及其应用将重组表达载体pCAMBIA0390-TaAntIpro-Gus 和 pCAMBIA0390_TaAntIpro-AlaAT 用冻融法分别转入根癌农杆菌EHA105(购自行知生物科技有限公司)中，叶盘法(kience， 1985,227 :1229-1231)转化烟草品种SRl (来源于中国国家种质资源库)，并用5mg/ LBiolaphos进行抗性筛选，转化得到的抗性再生植株分别用GUS和水稻AlaAT基因的引物进行PCR检测。AlaAT基因PCR检测的引物及参数同实施例2 ;GUS基因PCR检测的引物为 GUS-F :AGTGTACGTATCACCGTTTGTGTGAAC, GUS-R :ATCGCCGCTTTGGACATACCATCCG，采用 25 μ 1 的反应体系，其中含有 10mMTris-HCl，50mM KCl，1.5mM MgCl2, pH 9. 0，每种 dNTP 0. ImM, 正反向引物各0. 4yM，1.2U Taq DNA聚合酶和IOOng的基因组DNA，扩增参数为94°C 4分钟，94°C45秒，62°C 45秒，72°C 1. 5分钟，30个循环，72°C 7分钟，预期扩增片段的长度约 11Λ。图1和图2给出了两种基因的部分PCR检测结果，扩增片段大小与预期大小相符，说明两种目的基因都已整合到烟草的基因组中。取部分GUS基因PCR检测呈阳性的再生植株和部分未转化的对照植株进行GUS染色，结果在在转基因植株的根尖部位和地上部的输导组织中可以看到很强的⑶S表达，在部分根毛部位和根系的输导组织中也能看到一些GUS基因的表达，而未经转化的对照植株没有检测到这些信号(图3)，说明克隆的小麦Antiquitin基因的启动子具有启动子的功能，同时还说明该启动子驱动目的基因表达的部位具有组织特异性，这些部位与养分的吸收和运输密切相关。选择部分转pCAMBIA0390-TaAnt Ipro-Gus 和 pCAMBIA0390-TaAntlpro_AlaAT 且大小一致的阳性转基因幼苗在两种低氮条件下对其生长情况进行了比较。处理方式为将两种幼苗均移栽到装有蛭石的同一个塑料盒中，然后向2个栽有幼苗的塑料盒中分别浇施含 9. 4mM和3mM氮素的营养液，在25°C和16小时光照/8小时黑暗的条件下生长23天后称取幼苗的鲜重。含9. 4mM氮素的营养液为去掉了硝酸铵的1/2MS无机成分，营养液中未加MS 的有机成分，含3mM氮素的营养液是在上述含9. 4mM氮素营养液的基础上，进一步把硝酸钾的浓度降到了 3mM，为使营养液的钾离子浓度保持不变，在营养液中又添加了 6. 4mM的氯化钾。处理结果见表1，在两种低氮条件下，转pCAMBIA0390-TaAntIpro-AlaAT的幼苗都比转 pCAMBIA0390-TaAntIpro-Gus的幼苗生长速度快，在较低的氮素条件下(3mM)，鲜重的差异更加明显，而且达到了显著水平。转pCAMBIA0390-TaAntIpro-Gus的幼苗与未转化的对照差异不明显。说明本发明确实可以用来提高植物的养分利用效率。表1、转不同基因的烟草植株在两种低氮条件下生长23天后的鲜重(克)
权利要求
1.一种来源于小麦Antiquitin基因的启动子，其特征在于碱基序列为序列表中SEQ ID NO 1。
2.一种含有权利要求1所述启动子的表达盒，其特征在于该表达盒由权利要求1所述的来源于小麦Antiquitin基因的启动子、编码目的基因的DNA序列和一个转录终止的DNA 序列构成；所述来源于小麦Antiquitin基因的启动子以功能性方式与编码目的基因的DNA 序列连接，且所述编码目的基因的DNA序列与一个转录终止的DNA序列连接。
3.根据权利要求2所述的表达盒，其特征在于构建的目的基因为与养分吸收利用相关的基因。
4.根据权利要求3所述的表达盒，其特征在于构建的目的基因为与氮代谢相关的水稻丙氨酸氨基转移酶基因。
5.根据权利要求4所述的表达盒，其特征在于利用该表达盒构建含有来源于小麦 Antiquitin基因的启动子的重组表达载体。
6.根据权利要求5所述的表达盒，其特征在于构建的重组表达载体为 pCAMBIA0390-TaAntIpro-AlaATο
7.根据权利要求1所述的来源于小麦Antiquitin基因的启动子在提高植物养分利用率方面的用途，其特征在于，用含有来源于小麦Antiquitin基因的启动子的重组表达载体转化目的植物，获得养分利用效率提高的转基因植株。
8.根据权利要求7所述的来源于小麦Antiquitin基因的启动子在提高植物养分利用率方面的用途，其特征在于，用重组表达载体pCAMBIA0390-TaAntlprO-AlaAT转化烟草叶片，抗性再生植株经PCR检测和不同氮素水平的营养液培养，筛选出氮素利用效率提高的转基因后代。
全文摘要
本发明公开了一种来源于小麦Antiquitin基因的启动子及其用途。所述启动子以功能性方式与编码目的基因的DNA序列连接，且所述编码目的基因的DNA序列与一个转录终止的DNA序列连接构成表达盒。通过转基因途径，把所述表达盒导入目的植物中，利用所述启动子具有在植物根部和地上部养分输导组织驱动目的基因表达的功能，可培育养分高效利用的转基因植物尤其是氮素高效利用的转基因植物。
文档编号C12N15/113GK102392023SQ20111041056
公开日2012年3月28日 申请日期2011年12月12日 优先权日2011年12月12日
发明者柴建芳, 武晓晶, 王海波 申请人:河北省农林科学院遗传生理研究所